本发明属于细胞生物学和医药领域，具体而言，本发明涉及一种核酸分子及其制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。我国的肿瘤病例数相当庞大，有资料显示占全世界病例数的55%。肿瘤疾病现已上升为世界第2号"杀手"，其死亡人数仅次于心血管病。
良性肿瘤对机体的影响较小，主要表现为局部压迫和阻塞症状。恶性肿瘤由于分化不成熟、生长较快，浸润破坏器官的结构和功能，并可发生转移，因而对机体影响严重。恶性肿瘤除可引起与上述良性肿瘤相似的局部压迫和阻塞症状外，还可有发热、顽固性疼痛，晚期可出现严重消瘦、乏力、贫血和全身衰竭的状态。
近几年来，国外医学界对于肿瘤疾病的发病机理在细胞基础上又有了新的认识。基于对肿瘤发病机制的进一步理解，人们利用各种途径来研制和开发能够特异，有效地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的药物。目前，对于癌症的治疗仍以化疗及放疗为首选，两者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效，但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性因而具有较大的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上限制了它们在临床中的应用。近年来，为了开发出能特异性地杀伤癌细胞而对正常细胞无毒负作用的药物，人们对癌症的发病机制从细胞,分子水平上的研究予以高度重视和巨额投资。例如，“结直肠癌”（crc）在肿瘤中向来有“富贵病”之称,表明其与人们的生活习惯有着密切的联系。在上海,随着生活水平的提高,结直肠癌的发病率已跃居常见恶性肿瘤的第二位,仅次于肺癌。据复旦大学附属肿瘤医院资料统计,近几年结直肠癌手术量连年攀升,2007年该院结直肠癌手术量近900例,2008年已突破千例,达到了1027例。研制能特异性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒副作用的药物或者化合物一直是本领域的热点。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种用于抑制体外细胞ctl4基因表达的核酸分子。通过制备、应用该核酸分子抑制体外ctl4基因的表达，从而达到维持目标细胞正常生理状态的效果。
本发明提供了一种新的核酸分子，它具有抑制体外细胞ctl4基因表达的活性；
并且
其抑制的目标元件包括seqidno1所示的序列。
更优选的，目标元件具有seqidno1所示的序列。
本发明还提供了一种重组载体，它包含上述核酸分子。
其中，a、t、g和c分别是腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。
在本发明中，术语“ctl4hsh4”指具有抑制血管ctl4表达活性、并且抑制的目标元件包括seqidno1所示序列的核酸分子。该术语还包括目标元件的序列与seqidno1的同源性至少90%的核酸分子。
该术语还包括在目标元件5’和/或3’端添加数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内)核苷酸，或者3‘端加入若干dt（脱氧胸苷）后形成的序列。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将含有本发明ctl4hsh4所对应的dna序列可操作地连于表达调控序列，可以形成重组载体。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林脑炎病毒表达系统(semlikiforestvirus)。慢病毒（lentivirus）属于逆转录病毒亚属,以人类免疫缺陷病毒(humanimmunodefficiencyvirus,hiv)为代表。慢病毒不仅具有感染分裂靶细胞并整合其基因组中，尤其是具有感染包括神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和干细胞等在内的多种非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因转移的有效工具，被广泛应用于基因功能尤其是基因治疗的研究。
另一方面，本发明提供了一种抑制体外细胞ctl4基因表达的试剂盒，它包括上述核酸分子。
较好的，所述的核酸分子的序列如seqidno2或者seqidno3所示。
例如，它具有序列如seqidno2所示的核酸分子。
或者，它具有序列如seqidno3所示的核酸分子。
更好的，它具有序列如seqidno2和seqidno3所示的核酸分子。
本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括制备序列如seqidno2或者seqidno3所示的核酸分子的步骤：如seqidno2或者seqidno3所示的核酸分子按照其序列人工合成；即按核酸序列，将各核糖核酸分子依次脱水缩合。
或者，使用酶切方法，以及将各功能元件分别制备后连接。
第三方面，本发明提供了一种抑制体外细胞ctl4基因表达的方法，即上核酸分子通过适当的介质转染体外细胞。
例如，加入体外细胞的培养基，或者通过载体（包括病毒载体系统）转染目标细胞。
具体而言，该方法可以包括：
（1）扩增核酸分子；
（2）构建含有核酸分子的表达载体；
（3）将步骤（2）获得的表达载体转入目标体外细胞。
本发明还提供了上述的核苷酸分子在制备抑制体外细胞—尤其是肿瘤细胞—增殖的药剂的应用。本发明的实验结果表明，所述的ctl4hsh4可明显抑制ctl4的表达。实验证明，ctl4（ncbi基因id80736）具有重要的免疫系统生物学功能，但在某些情况下,也可对机体造成损伤,引起变态反应性疾病或免疫性疾病。在限定范围的细胞中抑制ctl4的表达，能够有效的控制其导致的过激反应，维护机体的正常生理活动。
本发明的核酸分子及其类似物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的核酸分子为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的核酸分子可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的核酸分子被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明中，所述的药剂是由含有效治疗量的核酸分子和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。
本发明提供了一种核酸分子，它具有抑制体外细胞ctl4基因表达的活性；并且其抑制的目标元件包括seqidno1所示的序列。本发明提供了含有该核酸分子的重组载体，还提供了一种抑制体外细胞ctl4基因表达的试剂盒，它包括上述核酸分子；所述的核酸分子的序列如seqidno2或者seqidno3所示。本发明还提供了所述核酸和制备方法和应用。实验表明，本发明的核酸分子能够抑制体外细胞ctl4基因至少45%的表达量。
具体实施方式
实施例1设计、筛选ctl4抑制分子
以ctl4序列中gccgtatctcctgtacttcaa(sedidno1)作为靶标筛选抑制分子，序列为5'-acctcgccgtatctcctgtacttcaatcaagagttgaagtacaggagatacggctt-3'(sedidno2)或者5'-caaaaagccgtatctcctgtacttcaactcttgattgaagtacaggagatacggcg-3'(sedidno3)的核酸分子作为ctl4候选抑制剂,称为ctl4hsh4；
种293t细胞于24孔板中，种板密度2*104/孔；
于种板后24h（小时）、72h、120h重复转染ctl4hsh4片段，以opti-mem（opti-memireducedserummedium,invitrogen公司，31985-070）为溶剂溶解，使终浓度达到40nm。转染试剂使用lipofectamin2000（11668-027，invitrogene公司）；
于第一次转染后24h、72h、120h消化细胞，收取72h和120h部分（5*104）细胞样品。western检测，抗体用nogo(n-18)sc-11027(santacruz公司)ctl4内源蛋白表达水平的变化；
结过显示：与sirna阴性片段ns（靶标替换为gatgctccactacgttctcat，seqidno4）比较，5'-acctcgccgtatctcctgtacttcaatcaagagttgaagtacaggagatacggctt-3'或者5'-caaaaagccgtatctcctgtacttcaactcttgattgaagtacaggagatacggcg-3'转染后72h即可见ctl4蛋白表达水平下调至少50%，表明，本发明的ctl4hsh4可以明显抑制ctl4。
实施例2对ctl4基因表达的消减作用的细胞水平筛选实验
实验步骤包括：
种293t细胞（购自中国科学院细胞库）于96孔板中，种板密度0.8*104/孔；
24h后将携带ctl4hsh4的lentivirus（慢病毒，吉凯公司）转导入细胞。lentivirus滴度为106tu/ul，取moi为100，即每孔加入80ul病毒液；具体转导方法如下：
给每孔细胞换上50ul新鲜培养基（ph7.0），加入适量病毒液，7-8h后每孔补加50ul培养基。24h后换液。48-72h观察gfp（绿色荧光）荧光，检测转导效率；
将细胞扩大培养，利用流式细胞术对细胞进行gfp绿色荧光分选，筛选出病毒转导阳性细胞，并检测其阳性率；
western检测阳性细胞和阴性细胞的ctl4内源蛋白表达水平的变化；
结过显示：
a.48h观察gfp荧光，阳性率为约50%,说明病毒转导实验方法正确；
b.流式细胞术分选转导细胞，阳性组与阴性组的转导率均大于90%（流式细胞仪显示数据）；
c.western检测阳性细胞ctl4蛋白表达水平较阴性细胞大大降低。
实施例3
流式细胞术检测ctl4hsh4对人正常结肠上皮细胞hcoepic的存活率的影响
源自人正常结肠上皮细胞的hcoepic细胞（购自atcc）按5×104个细胞/孔的密度接种12孔板,培养24小时使之贴壁后转染ctl4hsh4或者对照，转染方法同实施例1；培养过夜后加入5-氟尿嘧啶。24h后，胰酶消化，离心收集细胞，弃上清，并用预冷pbs清洗细胞两次，重悬于含50μg/mlpi(sigma公司)的pbs中。避光室温孵育15min后，流式细胞术检测；
结果显示：转染5'-caaaaagccgtatctcctgtacttcaactcttgattgaagtacaggagatacggcg-3'的hcoepic细胞相比于转染阴性片段的hcoepic细胞存活率提高20%以上,转染5'-acctcgccgtatctcctgtacttcaatcaagagttgaagtacaggagatacggctt-3'的hcoepic细胞相比于转染阴性片段的hcoepic细胞存活率提高30%以上；结果表明:ctl4hsh4能够提高结肠细胞对化疗药物,例如5-氟尿嘧啶的耐受性。
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<110>复旦大学
<120>核酸分子ctl4hsh4、其制备方法及应用
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