本发明属于微生物发酵领域，尤其涉及利用固定化混合菌种联合发酵生产苯丙氨酸的方法。
背景技术：
苯丙氨酸在食品加工和医药、化妆品等行业均有应用。作为食品营养的强化剂和餐饮添加剂以及高甜保健型甜味剂（APM）的主要合成原料，特别是APM热量低，适于肥胖症人群及糖尿病患者食用，现在有多国获准销售。特别是其被证明有提神醒脑以及减肥等功效，还可以作为氨基酸类抗癌药物使用。
目前苯丙氨酸的合成方法主要有四种：提取法、化学合成法、微生物发酵法、酶法，其中酶法又包括有苯丙酮酸酶法和肉桂酸酶法。目前国内大多数中小企业采用发酵法进行生产，但经过几年的生产，其缺陷逐渐暴露出来：产酸率低，生产周期较长，废水量大，能耗高等，加之国内肉桂酸价格也持续走低，达到1.8-2.0万元/吨，尤其广西肉桂酸资源较丰富，更增加了发酵法的可应用性。但是由于发酵法生产采用人工添加氨水及碳酸氢铵的方法提供氨源和高pH条件，造成了微生物生长受到制约，且微生物内部的苯丙氨酸解氨酶在很短的时间内就失活，严重制约了苯丙氨酸的发酵法生产，提供替换型氨源以及改善生产环境成为了迫切需求。
固定化技术是现代生物技术及其工业化环节中的一种核心技术。日本的千佃一郎首次将固定化酶技术应用于工业化生产，他从1960年开始研究固定化氨基酰化酶，1969年进入工业化应用，这在国际上是个突破。细胞固定化技术是指利用各种理化方法将游离的细胞定位在有限的空间内并使其保持活力和可以反复利用的一种技术，它是在固定化酶基础上发展起来的。固定化细胞有许多优点，能够长期保持细胞活性，抗剪切力，可以反复利用，成本低，优化工业流程，简化设备，对于次生物质的合成和积累有提高。细胞固定化技术的关键是载体材料的性质和固定化的方法。
现阶段很多学者试图通过基因工程手段，将微生物进行基因改造，用来发酵生产苯丙氨酸，如公开号CN102399835A的中国发明专利“一种微生物发酵生产L-苯丙氨酸的方法”，以及公开号CN102181503A的中国发明专利“一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法”都采用了基因工程手段，分别对谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌进行基因改造，用以发酵生产苯丙氨酸。但是通过基因改造的方法生产的苯丙氨酸产量较低，且存在潜在遗传风险，需要大量研究结果和实验数据支持才可以进入工业化生产，找到天然菌种进行苯丙氨酸生产也迫在眉睫。如果能够使用固定化技术将天然菌种进行固定化处理，在不添加氨水和碳酸氢铵的条件下生产苯丙氨酸，将会对苯丙氨酸产业带来巨大的变革。
技术实现要素：
本发明的目的是为了提供一种固定化混合菌种联合发酵生产苯丙氨酸的方法。克服了现有技术人工添加氨水造成酶失活较快，产物后提取分离步骤复杂，以及基因改造存在潜在风险的缺点。
本发明的目的是通过以下步骤来实现的：
（1）产氨短杆菌培养：将产氨短杆菌按照1%-1.5%的接种量接入培养基中，于发酵罐内进行搅拌发酵，发酵完毕后离心得到产氨短杆菌菌体；
（2）深红酵母培养：将深红酵母按照1.5%-3%的接种量接入培养基中，于发酵罐内进行搅拌发酵，发酵完毕后离心得到深红酵母菌菌体；
（3）混合菌种固定化：将步骤（1）和步骤（2）得到的产氨短杆菌菌体和深红酵母菌菌体按照1:2的比例进行混合，对混合菌体进行固定化处理；
（4）混合培养基的制备：将大麦芽除杂，除去秸秆和杂草，再用粉碎机粉碎成细小颗粒状，以质量体积比为1:4（KG/L）的比例加入纯水，放入水浴锅中65℃保温糖化7小时并不断搅拌，以保证糖化均匀。使用4层纱布过滤除杂，将糖化液煮沸加入适量鸡蛋白作为吸附助滤剂，待冷却后，再用4层纱布过滤，即得到澄清的麦芽汁，再加入2%尿素、0.2%硫酸镁、2%葡萄糖、2%反式肉桂酸既得到混合培养基；
（5）流化床发酵：将固定化的混合菌体放入发酵用流化床内，通入混合培养基进行流化床发酵；
（6）苯丙氨酸提纯：发酵完成后，发酵液通过阳离子交换树脂洗脱收集，再进行喷雾干燥得到纯度为97.8%以上的苯丙氨酸。
进一步地，所述步骤（1）和步骤（2）中使用的培养基为：蛋白胨5克、酵母浸出粉2克、葡萄糖20克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、蒸馏水1000毫升。
进一步地，所述步骤（1）和步骤（2）的培养温度为28℃，分别发酵24小时和36小时。
进一步地，所述步骤（3）中固定化混合菌体采用吸附法、共价结合法、交联法、包埋法、微囊化法中的一种，优选聚乙烯醇和琼脂糖混合包埋法。
进一步地，所述步骤（5）中流化床发酵时间为56小时，通过高效液相色谱法检测，发酵液中苯丙氨酸浓度不再增加即停止发酵。
进一步地，所述高效液相色谱法检测条件为，色谱柱：Alltech C18柱；流动相：甲醇/水，10/90(V/V)；柱温：25℃；流速：0.65 mL/min; 进样量：10 µL；检测器：SHIMADZU公司的LC-10AT HPLC系统，UV210 nm。
进一步地，所述产氨短杆菌和深红酵母均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 20101、CICC 32621。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：通过产氨短杆菌和深红酵母菌的混合菌种固定化发酵，产氨短杆菌发酵尿素产生氨，配合外的加反式肉桂酸，采用深红酵母进一步发酵，产生苯丙氨酸，达到了不外加氨水的目的，且使用的都是天然工业化生产菌种，不存在转基因风险，固定化发酵也简化了产物苯丙氨酸的后提取工艺。整个发酵过程条件温和可控，工艺流程简单，也未使用强酸和强碱，在保证了生产条件温和的同时，增加了酶活，延长了酶的使用时间，简化了后提取步骤，并且增加了苯丙氨酸的产率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1：
将蛋白胨100克、酵母浸出粉40克、葡萄糖400克、磷酸氢二钾20克、硫酸镁10克溶解与20KG蒸馏水中，接入产氨短杆菌，于28℃下发酵24小时，离心得到菌体4.3KG。将深红酵母菌同样接入等质量的培养基中，于28℃下发酵36小时，离心得到菌体8.8KG。将两种菌体混合均匀后采用海藻糖包埋法进行固定化处理。将大麦芽100KG除杂，除去秸秆和杂草，再用粉碎机粉碎成细小颗粒状，加入纯水400KG，放入水浴锅中65℃保温糖化7小时并不断搅拌，以保证糖化均匀。使用4层纱布过滤除杂，将糖化液煮沸加入1KG鸡蛋白作为吸附助滤剂，待冷却后，再用4层纱布过滤，即得到澄清的麦芽汁410KG，再加入8.2KG尿素、0.82KG硫酸镁、8.2KG葡萄糖、8.6KG反式肉桂酸既得到混合培养基。将固定化混合菌体放入流化床内，通入混合培养基进行发酵，发酵56小时后，采用高效液相色谱法，检测条件为：色谱柱：Alltech C18柱；流动相：甲醇/水，10/90(V/V)；柱温：25℃；流速：0.65 mL/min; 进样量：10 µL；检测器：SHIMADZU公司的LC-10AT HPLC系统，UV210 nm，检测发酵液中苯丙氨酸的产量，浓度不再增加，停止发酵。通过阳离子交换树脂洗脱收集后，再进行喷雾干燥得到纯度为97.8%以上的苯丙氨酸4.5KG。
实施例2：
将蛋白胨300克、酵母浸出粉120克、葡萄糖1200克、磷酸氢二钾60克、硫酸镁30克溶解与60KG蒸馏水中，接入产氨短杆菌，于28℃下发酵24小时，离心得到菌体12.45KG。将深红酵母菌同样接入等质量的培养基中，于28℃下发酵36小时，离心得到菌体25.5KG。将两种菌体混合均匀后采用海藻糖包埋法进行固定化处理。将大麦芽200KG除杂，除去秸秆和杂草，再用粉碎机粉碎成细小颗粒状，加入纯水780KG，放入水浴锅中65℃保温糖化7小时并不断搅拌，以保证糖化均匀。使用4层纱布过滤除杂，将糖化液煮沸加入3KG鸡蛋白作为吸附助滤剂，待冷却后，再用4层纱布过滤，即得到澄清的麦芽汁800KG，再加入16KG尿素、1.6KG硫酸镁、16KG葡萄糖、16.8KG反式肉桂酸既得到混合培养基。将固定化混合菌体放入流化床内，通入混合培养基进行发酵，发酵56小时后，采用高效液相色谱法，检测条件为：色谱柱：Alltech C18柱；流动相：甲醇/水，10/90(V/V)；柱温：25℃；流速：0.65 mL/min; 进样量：10 µL；检测器：SHIMADZU公司的LC-10AT HPLC系统，UV210 nm，检测发酵液中苯丙氨酸的产量，浓度不再增加，停止发酵。通过阳离子交换树脂洗脱收集后，再进行喷雾干燥得到纯度为97.8%以上的苯丙氨酸10.3KG。