一种兔黑色素细胞的体外分离培养方法与流程

本发明涉及细胞遗传学和分子生物学领域，具体涉及一种兔黑色素细胞的体外分离培养方法。

背景技术：

哺乳动物皮肤和被毛有着各种各样的颜色，是由化学性质稳定的黑色素导致的，可分为褐黑色素和真黑色素，它们是酪氨酸或有关的成份在相应酶的催化下氧化而成的。遗传基因控制着毛色色素的形成和类型，从而决定哺乳动物的毛色。兔作为一种重要皮毛动物和试验模型，其毛色也十分丰富，有黑、灰、黄、蓝等多种天然色彩，无需印染，备受消费者青睐。但是，由于活体动物实验困难重重，又缺乏合适的细胞模型，严重阻碍了人们对家兔毛色遗传机制的研究。本方法以黑兔为实验材料，体外分离培养兔黑色素细胞，并通过细胞染色等方法进行鉴定，可以用于探索毛色相关基因的表达和调控，为毛色基因功能的研究提供理论和实践基础。

技术实现要素：

为了解决家兔毛色遗传研究中缺乏合适的细胞研究模型的问题，本发明提供了一种兔黑色素细胞的体外分离培养方法，能在体外分离培养和鉴定兔黑色素细胞，有助于开展毛色相关基因的表达调控研究工作，也为毛色遗传机制的研究提供理论和实践基础。

本发明所采用的技术方案是，一种兔黑色素细胞的体外分离培养方法，是通过酶消化法分离兔黑色素细胞，经M254完全培养基培养后更换M254/HMGS培养基培养至汇合度达到80％～90％，再利用差速消化法去除角质细胞和成纤维细胞等其他细胞，大大提高了目的细胞的纯度。

本发明所述方法具体包括以下步骤：

1)兔黑色素细胞的分离获取

a)取1.5cm×1.5cm大小的皮肤，预冷PBS冲洗3次，去除皮下结缔组织；

b)将皮肤剪成0.2cm×0.5cm大小的皮肤块，放入20mL的Dispase II酶消化液中，4℃过夜消化(14-16h)；

c)再将皮肤放入Dispase II酶中，37℃孵育30min；揭下表皮；

d)将揭下的表皮收集到35mm干燥的培养皿中，加入500μL的0.25％胰酶37℃消化8min；

e)加入2mL血清终止消化，吹打数次，200目过滤网过滤，1000rpm离心5min；

f)加入2mL M254完全培养基重悬，置入35mm培养皿中；

g)培养1h后，换成2mL M254/HMGS培养基，每隔2d换一次培养基；

2)兔黑色素细胞的传代与纯化

a)当汇合度达到80％～90％时，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化1～2min，首先消化脱落下来的细胞类型为黑色素细胞；

b)快速加入2mL血清终止消化，1000rpm离心5min，弃清液；

c)加入3mL M254/HMGS培养基，重悬细胞；

d)按照测定的细胞浓度将细胞悬液重新接种到60mm培养皿中，放入CO₂细胞培养箱中37℃继续培养，每隔2d换液；

e)观察细胞生长状况，差速消化3次即可得到纯的黑色素细胞。

本发明步骤b)c)中，采用冷消化和热消化相结合，更加容易将兔子的表皮揭下，兔子皮肤相比其他物种皮肤较厚，表皮和真皮用Dispase II酶消化会较困难，冷消化过夜之后再半小时热消化，会较容易将表皮揭下。

本发明步骤f)中，M254完全培养基培养一个小时之后更换M254/HMGS培养基，此方法可以减少除黑色素细胞之外的其他细胞的存在。M254完全培养基是M254培养基中加入胎牛血清(9:1)。

本发明在实验中，研究了了不同的培养基组合，结果显示培养基的选择对效果影响很大。图5显示：使用DMEM/F12培养基培养1h之后更换M254/HMGS培养基的效果(图5A)：细胞贴壁数量少于使用M254完全培养基培养1h之后更换M254/HMGS培养基(图5B)。图6显示，使用M254完全培养基培养培养1h之后更换M254/HMGS培养基的效果(图6A)与分离之后直接使用M254/HMGS培养基(图6B)效果不同之处：黑色素细胞的数量明显高于直接使用M254/HMGS培养基培养的黑色素细胞数量。对通过本发明方法分离培养的黑色素细胞结合细胞形态观察、半定量、L-DOPA染色、抗S-100免疫细胞化学染色法等多种技术手段，鉴定分离培养黑色素细胞，结果显示，分离的原代黑色素细胞多呈树突状和细长的梭状，L-DOPA染色呈棕黑色阳性反应，PCR分析结果显示分离细胞含有黑色素细胞的标志基因，S-100染色胞质为棕黄色。说明在选择培养基条件下培养的细胞具有黑色素细胞的形态，可表达黑色素细胞的标志物，能够合成黑色素颗粒，可为毛色遗传机制研究提供细胞模型。

附图说明

图1：第1，3，5，7代兔黑色素细胞的形态(100×)

A：第1代黑色素细胞；B：第3代黑色素细胞；C：第5代黑色素细胞D：第7代黑色素细胞。

图2：第五代兔黑色素细胞L‐DOPA染色

A：L‐DOPA染色前；B：L‐DOPA染色后。

图3：第五代兔黑色素细胞抗S‐100免疫细胞化学染色

A：免疫细胞化学染色前；B：免疫细胞化学染色后。

图4:MITF、TYR、TYRP1基因在黑色素细胞中的表达。

图5是不同培养基分离培养三天之后的效果图。A.使用DMEM/F12培养基培养1h之后更换M254/HMGS培养基的效果；B.使用M254完全培养基培养1h之后更换M254/HMGS培养基的效果。

图6是使用M254完全培养基培养培养1h之后更换M254/HMGS培养基的效果与分离之后直接使用M254/HMGS培养基效果图。A.使用M254完全培养基培养培养1h之后更换M254/HMGS培养基；B.分离之后直接使用M254/HMGS培养基。

具体实施方式

实施例1

1材料与方法

1.1实验材料

(1)实验动物：6月龄黑兔。

(2)试验器材：眼科镊、眼科剪、不锈钢滤网(200目)、手术刀等。

(3)主要试剂：M254/HMGS培养基、PBS缓冲液、0.25％胰蛋白酶消化液、0.25％Dispase II消化液、SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒、Mouse Anti-S-100、0.1％TritonX-100、PBS缓冲液、胎牛血清(FBS)、双抗(青链霉素混合液100×)、二甲基亚砜(DMSO)。

1.2兔黑色素细胞的分离获取

(1)巴比妥钠溶液麻醉实验兔，75％酒精对采样区消毒，剪毛剪剃去背毛，取一块1.5cm×1.5cm皮肤组织，用含双抗预冷的PBS反复冲洗3次。

(2)将皮肤组织放入含双抗PBS培养皿中，放入超净台用眼科镊和眼科剪去除皮下脏污血渍以及结缔组织，用含双抗PBS冲洗3次。

(3)用手术刀将皮肤边缘修正齐，注意将表皮朝下，避免手术刀对表皮的损伤。用眼科剪将皮肤剪成0.2cm×0.5cm大小的皮肤块，放入20mL的Dispase II酶消化液中，Dispase II酶的体积是皮肤体积的十倍，4℃消化14～16h(过夜)。

(4)将皮肤取出放入4℃预冷的PBS中漂洗3次，放到干燥的培养皿中，表皮朝下，用精细镊先尝试揭下表皮，若表皮不容易揭下，再次放入Dispase II酶中37℃孵育30min，之后取出皮肤，在预冷的PBS中冲洗3遍，再在干燥的培养皿中用精细捏将表皮揭下，表皮是很薄的透明状的物质，揭下的表皮收集到35mm的干燥的培养皿中，加入500μL的0.25％胰酶37℃消化8min，2mL血清终止消化，用枪头反复吹打，200目滤网过滤，1000rpm离心5min，加入2mLM254完全培养基重悬，置入35mm培养皿中，培养1h后，换成2mL M254/HMGS培养基，每隔2d换一次培养基,并观察细胞的生长状态，若细胞汇合度达到80％～90％时，进行细胞的纯化工作。

1.3兔黑色素细胞的传代与纯化

(1)观察培养板中细胞生长情况，当汇合度达到80％～90％时，吸去培养基，加入500μL0.25％胰蛋白酶消化液，轻轻晃动，利用差速消化法去除角质细胞和成纤维细胞等其他类型细胞，在显微镜下观察细胞消化情况，首先消化脱落下来的细胞类型为黑色素细胞，一般消化时间在1～2min。

(2)快速加入2mL血清终止消化，反复轻轻吹打，将细胞悬液收集到提前准备好的15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入3mL M254/HMGS培养基，重悬细胞。

(3)吸取少量的细胞悬液加入台盼蓝工作液，滴入细胞计数板中进行计数，按照测定的细胞浓度将细胞悬液重新接种到60mm培养皿中，放入CO₂细胞培养箱中37℃继续培养，每隔2d换液。

(4)观察细胞生长状况，差速消化3次即可得到纯的黑色素细胞。

1.4兔黑色素细胞的冻存与复苏

1.4.1黑色素细胞冻存

(1)按时观察黑色素细胞的生长状态，当培养板中的细胞密度达到70％～80％时，吸去培养基，加入1mL 0.25％的胰酶消化液，消化2min。

(2)在倒置显微镜下观察细胞的形态变化，当细胞的胞质形态发生回缩且变圆，细胞之间的间隙变大，轻轻晃动培养板有大量细胞脱落时，快速加入2mL的血清终止消化，反复轻轻地吹打培养板底部，使其形成细胞悬液，切记在吹打时，动作要轻柔，以免大力造成细胞损伤，影响细胞的生长活力。

(3)将细胞悬液收集到准备好的离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清，吸取1mL冻存液重悬细胞，移至冻存管中，做好标记，放入细胞冻存盒(程序自动降温)中，-80℃过夜，次日将细胞冻存管转入液氮中保存，动作要速度。

1.4.1黑色素细胞复苏

(1)从液氮罐中取出一管冻存的兔黑色素细胞，迅速浸入37℃的水浴锅中(冻存管要竖着放入水浴锅，液面不能没过管盖的下缘，以防止污染细胞)，来回晃动冻存管加快管内冻存液的融化。

(2)待固体完全融化后迅速用75％酒精喷洒整个冻存管，擦净管壁液体后放进超净台，用移液器吹打几次细胞悬液后吸出，加入含有10mL M254完全培养基的离心管中，l000rpm离心5min，弃去上清，PBS重悬细胞，再次1000rpm离心5min，最后用M254/HMGS培养基重悬细胞，按照适宜的浓度接种到细胞培养板中，放入CO₂细胞培养箱中37℃静置培养，次日观察细胞贴壁情况适时更换培养基，继续培养。

1.5兔黑色素细胞的鉴定

1.5.1 L-DOPA染色

(1)取第五代黑色素细胞，处于对数生长期，接种于6孔板中，37℃、5％CO₂培养2d。PBS清洗2次，4％多聚甲醛室温固定20min。

(2)预冷PBS清洗2遍，加入0.1％的L-DOPA，37℃孵育4h，更新孵育液后，37℃继续孵育18h，此过程需一直避光。

(3)待染色完成后，再用PBS冲洗3次，显微镜下观察采集图像。

1.5.2 RT-PCR检测

(1)细胞汇合度达到90％以上时，约1～5×10⁵个细胞，用PBS轻轻冲洗三次，加入1mL Trizol，按照试剂盒说明书提取总RNA，用核酸蛋白测定仪测定OD_230/260和OD_260/280的比值及浓度，取1μLRNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，剰余样品立刻放于-80℃中保存。

(2)在冰上按照下列成分配置反转录的反应体系：5×PrimeScript^TMBuffer4μL，PrimeScript^TMRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrime(50μM)1μL，Random6mers(100μM)1μL，TotalRNA 2μL，RnaseFreedH₂O加至20μL，将总RNA反转录成cDNA。

(3)根据NCBI中公布的兔Tyr、Tyrp1和MITF基因的序列，利用oligo 7引物设计软件设计PCR引物，引物信息如表1所示。进行PCR扩增，反应体系：将10μL 2×Taq PCR Mix、7μL灭菌水、1μLcDNA、上下游引物各1μL，加入100μLPCR管中，共计20μL的反应体系，充分混匀后放入仪器中，检测特异性基因在黑色素细胞中的表达。

表1.引物信息

(4)配制1％琼脂糖凝胶(加入0.5μL的Goldview)，将凝固彻底的凝胶轻柔放入电泳槽中，加入适量的电泳液，100V的电压下跑胶30min，跑胶完毕后，将胶取出于凝胶成像系统中曝光并采图。

1.5.3抗S-100免疫细胞化学染色

(1)取第五代处于对数生长期的黑色素细胞，调整细胞浓度为2×10⁵/mL，接种于六孔板中，37℃、5％CO₂培养箱培养2d。

(2)PBS洗2×2min，4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗3×2min。

(3)0.1％TritonX-100室温处理20min，PBS洗3×2min。

(4)滴加5％BSA封闭液，室温，20min，吸出封闭液，不漂洗。

(5)加入抗S-100抗体(1:200)，阴性对照用PBS代替，4℃过夜，PBS漂洗3×2min。

(6)滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃，20min，PBS洗3×2min。

(8)滴加试剂SABC，37℃，20min，PBS洗4×5min。

(9)DAB显色：取A、B、C试剂各一滴于1mL蒸馏水中，混匀后，滴入6孔板中，室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～30min之间。

2结果

通过各种条件的摸索尝试，首次利用酶消化法分离出兔黑色素细胞，进行鉴定和传代培养(见附图1)，通过L-DOPA染色，可见细胞被染成棕黑色(见附图2)，检测黑色素标志基因在分离细胞中的表达，发现MITF、TYR、TYRP1基因均表达(见附图3),抗S-100免疫细胞化学染色，可见胞质内着色，呈棕黄色(见附图4)。结果证实，在选择培养基条件下，分离培养的细胞具有黑色素细胞的形态，可表达黑色素细胞的标志基因，能够合成黑色素颗粒。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种兔黑色素细胞的体外分离培养方法

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