本发明涉及一种内切β-1,4-甘露聚糖酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该内切β-1,4-甘露聚糖酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发明提供的内切β-1,4-甘露聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及寡糖制备等领域。
背景技术：
蒟蒻(amorphophalluskonjac)，俗称魔芋，天南星科魔芋属多年生草本植物。魔芋中主要成分为魔芋多糖(又称魔芋葡甘露聚糖)，由葡萄糖与甘露糖组成。魔芋葡甘露聚糖通过β-1,4吡喃糖苷键将β-d-葡萄糖和β-d-甘露糖按1∶1.6或1∶1.69的摩尔比连接而成，每19个糖残基上有一个乙酰基团存在，其特殊的结构使其虽具有多种生物学功能。但是其在水中为胶体，粘度大、溶解度小，在后续加工利用上带来不便；其在各种食品中添加量小，影响了其生物活性。目前我国魔芋产业多停留在魔芋初级食品开发层面，亟需高值化加工技术，对魔芋主要成分魔芋葡甘露聚糖的深加工是魔芋下游产业的主要方向。
将魔芋多糖降解成魔芋寡糖，即魔芋葡甘露寡糖(konjacoligo-glucomannan，kogm)，其分子量小，在水中可溶，易于吸收，将会克服魔芋多糖在加工利用中问题。与魔芋多糖相比，魔芋寡糖具有优良的性能，具有改善食品品质，保鲜食品，改善人体肠道菌群，增强免疫力，调节血糖、血脂以及肠道解毒等生物活性。生理功能试验表明，葡甘露低聚糖除了具有低热量、稳定、安全无毒等良好的理化特性外，还具有促进以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖,改善肠道内菌群结构；减慢肠道粘膜分泌的β-糖苷酶的扩散速度，不升高血糖，提高机体抗氧化能力等功能。
目前尚无大量工业生产魔芋葡甘低聚糖的报道，其生产尚停留在实验室研究期间，获得葡甘低聚糖的方法主要有以下几种：(1)从天然原料(魔芋)中提取，但提取工艺复杂，且产率极低；(2)通过人工化学合成的方法获得，但此法步骤繁琐，成本太高；(3)利用酸水解魔芋葡甘露聚糖的方法获得，但这样生产的低聚糖性质不稳定，副产品多，不易得到特定的低聚糖；(4)利用物理方法降解得到，但此方法要利用现代化的生产设备，实验设备要求太高，不利于大量生产；(5)利用酶解葡甘露聚糖的方法获得，酶的反应效率高，方法简单、易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶解葡甘露聚糖的方法生产葡甘露低聚糖是一条相对简单，容易研究的生产方法。
β-1,4-d-甘露聚糖水解酶(β-1,4-d-mannanmannohydrolase，ec3.2.1.78)是一类从甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主链内部随机切割β-1,4-d-甘露聚糖糖苷键的水解酶，简称β-甘露聚糖酶(β-mannanase)，是降解葡甘露聚糖制备葡甘露寡糖的有效工具。国内外对甘露聚糖酶的研究多集中于微生物，其中细菌特别是革兰氏阳性菌包括芽孢杆菌(bacillus)和梭菌(clostridium)、真菌中曲霉(aspergillus)和里氏木霉(trichodermareesei)、放线菌中链霉菌(streptomyces)研究较多。革兰氏阴性菌如弧菌(cellvibrio)也有报道。此外，类芽孢杆菌属的菌株具有芽孢杆菌属的某些共性，能产生耐热抗逆的芽孢，有利于酶制剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。目前国内外已有很多研究对该菌属多种菌株进行过生理活性及抗菌活性的研究，对甘露聚糖酶基因的报道却非常少，且已报道的内切β-1,4-甘露聚糖酶对魔芋多糖的降解活性均较弱，不适于大规模应用。因此，寻找一种能够高效、稳定降解魔芋多糖的甘露聚糖酶是降低葡甘露寡糖生产成本的有利途径。而由于β-1,4-甘露聚糖酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提高β-1,4-甘露聚糖酶产量的一种有效措施。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)的内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman及其编码基因。
本发明的第二个目的是提供一种制备新型内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的方法。
本发明的第三个目的是提供含有所述的内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。
本发明的第四个目的是提供一种新型内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman在魔芋多糖降解中的应用。
本发明所提供的内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman，来源于土壤中分离纯化的多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa，从中扩增出的内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman编码基因(命名为ppman)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：
1)序列表中seqidno.1的脱氧核糖核酸(dna)序列；
2)编码序列表中seqidno.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列；
3)与seqidno.1限定的脱氧核糖核酸(dna)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(dna)序列；
4)对序列表中seqidno.1的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性的核苷酸序列。
本发明还提供了内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：
1)序列表中的seqidno.2从氨基端开始的第1-631位氨基酸残基序列，其中1-623位为具有内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman活性的氨基酸序列，624-631位为酶切位点及his-tag的氨基酸序列；
2)将序列表中的seqidno.2从氨基端开始的第1-631或1-623位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列。
本发明的内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的β-1,4-甘露聚糖酶ppman的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。
制备重组酶ppman的方法，是将内切β-1,4-甘露聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切β-1,4-甘露聚糖酶。
上述内切β-1,4-甘露聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：
1)具有序列表中seqidno.1的脱氧核糖核酸(dna)序列；
2)编码seqidno.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列；
3)对序列表中seqidno.1的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性的核苷酸序列；
所述的重组表达内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。
用于重组表达内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如escherichiacolibl21、escherichiacolijm109、escherichiacolidh5α等)、酵母菌宿主细胞(如saccharomycescerevisiae、pichiapastoris、kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如bacillussubtilisr25、bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如lacticacidbacteriacocc101等)、放线菌宿主细胞(如streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如trichodermaviride、trichodermareesei、aspergillusniger、aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如bombyxmori、antharaeaeucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞cho、幼小仓鼠肾脏细胞bhk、中国仓鼠肺细胞chl等)。
本发明的内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的基因序列是通过pcr技术从多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)中克隆得到。该基因编码区长1896bp，属于糖苷水解酶gh(glycosidehydrolase)26家族。
本发明提供的内切β-1,4-甘露聚糖酶在降解魔芋多糖中可以应用，包括以下应用中的一种或二种：
1)在断裂魔芋多糖的糖苷键，获得单糖或葡甘露寡糖中的应用；
2)在断裂甘露聚糖的糖苷键，获得单糖或甘露寡糖中的应用；
3)与其他葡甘露聚糖酶混合后，在协同断裂葡甘露聚糖糖苷键方面应用。
本发明从大肠杆菌重组表达获得的内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman，可以高效降解魔芋多糖，以魔芋多糖为底物时，在25℃、ph8.0的条件下具有最佳酶活性，比活为65u/mg。解决了现有β-1,4-葡寡糖生产成本高的难题，具有重要的实用价值，可应用于大规模的工业化生产。
本发明的内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及葡甘露寡糖的制备等领域。
附图说明
图1：内切β-1,4-甘露聚糖酶基因ppman琼脂糖凝胶电泳检测。
图2：内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman表达及纯化的sds-page图。各泳道加入的样品分别是：泳道1-ppman未诱导菌体总沉淀，泳道2-ppman诱导后菌体总沉淀，泳道3-ppman破菌上清，泳道4-ppman上柱三次流穿液，泳道5-40mm咪唑洗脱流穿液，泳道6-80mm咪唑洗脱流穿液，泳道7-250mm咪唑洗脱流穿液，泳道8-蛋白分子量标准。
图3：ph值对内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的影响曲线。
图4：温度对内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的影响曲线。
图5：内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman对魔芋多糖降解产物的maldi-tof-ms图谱。
具体实施方式
序列表
seqidno.1的信息
(a)序列特征
长度：1896核苷酸
类型：核苷酸
链型：单链
(b)分子类型：dna
序列描述：seqidno.1
atggaatcaactaacttggtcaccgatgttgaagggcgaacgttgatgaatgcaagtcaagattcatccactaacgacaattcctcttctatcgtcgtcagctccaaagatgcaattcttcaaggttacggtgtagaaaaacgggatacaccctataccggcgatacgctttataaaggcgatggctatgtatccttcttttatgactacgacccaaattccggcaagtccgacgggacggccacgtttaaagtgaacgtgcccacagcaggtctttatagactgagcctcggctactacattccggcgggcactggctccaaggataccagcatcgaggtcaatggcacaatgtctgagaacataacgctggctgctcctccgaaaggtgcggcagtgaacgagaaaatattaaccaagatcatgctgaatgccggcacaaacgagcttacttttgcaagaggctggggatattacgggatcgaatacgtgaaggttgaattcgccaatctgcctgctgcaattagcaaaatggaagccgaagacggagtcattactggtgaggtcaagatcgaagctgctgatacaggctattcgggtagcggttacgccgccttcaaaagcacaggttcgttaacctttgcctataatgcaccttcaagcgggctttacaatcttgcaatcggttacagtaaccccaatggagacaaaaagacccaattggtggtcaacggccagaccagcgaaatatcactgccgacaacagcaagctacacagaggtatccggcggtaaactgatgctgaattcgggaaacaatatcttacagttcaatgtcgactcggaccaatatcatatcgactacgtcaagctatcagcagtgtcccccccgaaactgcatcaaattgagaaaaagccagtaaacccgaatgcgactgcggaaaccacggcactcatgggttatctcgtggatagttacggcagccacattctttccggtcagcacactttggaggatgcacagtggattaaagaccaaactggaaagtatcctgccatgttatcaatggacatgatggattattccccctctcgcatcgagcatggcgccacctcaactgaggtggaaaaggcaattcaatgggcccaagaaggtggacttgtcacattcgcatggcactggaatgctcctaagggactgtatgatattcccggtaaagaatggtggcgcgggttttacacggacgctactacattcgacgttcaatatgcacttagtcatcccgagtcggaagagtatcagcttatcctaagggatatcgatgccattgctgctcagttgaaacgcctccaagacgctcacgttccggtgctgtggagaccgctgcacgaggcggagggcaaatggttctggtggggcgcccaaggtccagactccgccaagcagctgtaccgtatcatgtacgaccgcctaacacactaccatcacctgaacaacctgatctgggtatggaactccgagagtcccgactggtatccagaggatgatgtcgtcgatattgtaagtgtggatatctacaaccaggcggctaattatagcccaagtattggcaagtacgacagtttggtaaatctcgtgcagggtaagaagctggttggtctgtctgaaaacggcccgattagcgatcccgaattgcttcaaacatattcagcgcattggctctttttcactacgtggacgggcgacttcatccgcaatggaaaatataactccctggatcatctcataaaagtgttcaacagcgattacgtgatcacgagggatgagcttcctcaagacctgcttacttcgtccaaaaatgaagcggagctcgagcaccaccaccaccaccactga
seqidno.2的信息
(a)序列特征
长度：631氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
(b)分子类型：蛋白
序列描述：seqidno.2
mestnlvtdvegrtlmnasqdsstndnsssivvsskdailqgygvekrdtpytgdtlykgdgyvsffydydpnsgksdgtatfkvnvptaglyrlslgyyipagtgskdtsievngtmsenitlaappkgaavnekiltkimlnagtneltfargwgyygieyvkvefanlpaaiskmeaedgvitgevkieaadtgysgsgyaafkstgsltfaynapssglynlaigysnpngdkktqlvvngqtseislpttasytevsggklmlnsgnnilqfnvdsdqyhidyvklsavsppklhqiekkpvnpnataettalmgylvdsygshilsgqhtledaqwikdqtgkypamlsmdmmdyspsriehgatstevekaiqwaqegglvtfawhwnapkglydipgkewwrgfytdattfdvqyalshpeseeyqlilrdidaiaaqlkrlqdahvpvlwrplheaegkwfwwgaqgpdsakqlyrimydrlthyhhlnnliwvwnsespdwypeddvvdivsvdiynqaanyspsigkydslvnlvqgkklvglsengpisdpellqtysahwlffttwtgdfirngkynsldhlikvfnsdyvitrdelpqdlltsskneaelehhhhhh
实施例1内切β-1,4-甘露聚糖酶全长基因克隆
参照基因组dna纯化试剂盒(thermo，lot00105781)操作步骤提取多粘类芽孢杆菌的基因组dna。对thenationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)数据库中内切β-1,4-甘露聚糖酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物ppman-f:5’-cggacgcatatggaatcarctmmcttggtcac-3’；ppman-r:5’-gacgagctcgagctccgcttyattyttggabraagta-3’，以提取的多粘类芽孢杆菌的基因组dna为模板，扩增编码内切β-1,4-甘露聚糖酶成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。pcr反应条件为：94℃2min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min，1个循环。pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的基因进行切胶回收，经双酶切的方法连接到原核表达载体pet21a上后测序。
实施例2内切β-1,4-甘露聚糖酶基因序列分析
测序结果采用genbank数据库中的basiclocalalignmentsearchtool(blast)分析，dnaman软件进行多序列比对，vectornti分析序列信息。
获得的内切β-1,4-甘露聚糖酶基因(命名为ppman)编码区长1896bp，其核苷酸序列如seqidno1所示。ppman编码631个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如seqidno2所示，蛋白质理论分子量为70.11kda，预测等电点为4.97。ppman编码的氨基酸包含两个碳水化合物结合模块cbm(carbohydratebindingmodule)35和一个gh26家族结构域，其结构域特征与gh26家族成员更为相似，由此表明ppman为gh26家族的一名成员。
实施例3ppman基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化
为了便于基因的重组表达，在设计的上下游引物中分别引入ndei和xhoi酶切位点。将pcr清洁产物ppman和表达载体pet21a分别用ndei和xhoi进行双酶切，酶切产物经清洁回收后，用t4dna连接酶连接(连接体系：(5μlt4dnaligase0.5μl，10×t4dnaligasebuffer0.5μl，pet21a2μl，pcr产物2μl)，连接条件：室温过夜连接。)。取5μl连接产物转化e.colitop10感受态细胞，涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的固体luria-bertani培养基上，37℃培养12-16h。挑取单克隆，使用简并引物进行菌落pcr验证，将扩增正确的单克隆接入含有100μg/ml氨苄青霉素的液体luria-bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶ndei和xhoi对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测序。测序结果表明，在pet21a的ndei和xhoi酶切位点之间插入了seqidno1所示的ppman基因，且插入方向正确，证明重组质粒构建成功，将该重组质粒命名为pet21a-ppman。
将pet21a-ppman转化e.colibl21(de3)，对其进行诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。
实施例4内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的活性测定及酶学性质分析
(1)内切β-1,4-甘露聚糖酶ppman的活力测定
以450μl0.5％(w/v)的魔芋多糖为底物，加入50μl重组酶ppman，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(dns)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以甘露糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(u)。蛋白浓度使用碧云天bca蛋白浓度测定试剂盒进行测定。
(2)ph对重组酶ppman的影响
在25℃的条件下，分别以450μl0.5％(w/v)，ph3.0-10.0(ph3.0gly-hcl，ph4.0-5.0hac-naac，ph6.0-7.0na2hpo4-nah2po4，ph8.0tris-hcl，ph9.0-10.0gly-naoh)的魔芋多糖为底物，加入50μl重组酶ppman，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(dns)法测定其活性。以灭活的酶作为对照，以活性最高的值为100％，测定在各个反应ph下酶的相对活性。根据酶在不同ph下的相对活性绘制曲线，确定酶的最适反应ph。结果如图3所示，ppman的最适反应ph为8.0，随着ph的升高或降低，ppman的活性均降低。
(3)温度对重组酶ppman的影响
在ph8.0的条件下，以450μl0.5％(w/v)魔芋多糖为底物，分别在25-85℃下加入50μl重组酶ppman，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(dns)法测定其活性。以灭活的酶为对照，以反应最高酶活力为100％计算相对酶活，根据酶在不同温度下的相对活性绘制曲线。结果如图4所示，ppman的最适反应温度为25℃。
在最适温度和最适ph条件下，按标准方法测得ppman的比活为65u/mg。(4)重组酶ppman的底物特异性
选取魔芋葡甘露聚糖、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、田菁胶、刺云豆胶、葫芦巴胶、黄原胶、卡拉胶8种底物考察重组酶ppman的底物特异性。将50μl重组酶ppman分别加入到450μl0.5％(w/v)的不同底物中，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(dns)法测定重组酶ppman对各底物的降解活性，以降解魔芋葡甘露聚糖的比活力为100％。结果如表1所示，重组酶ppman对魔芋葡甘露聚糖表现出最高的活性，对几种半乳甘露聚糖的底物也有活性，但对其它几种底物未检测到活性。
表1β-1,4-甘露聚糖酶ppman的底物特异性
实施例5重组酶ppman降解魔芋葡甘露聚糖产物分析
将0.5％(w/v)魔芋多糖与重组酶ppman按9:1(体积比)的比例混合后，在25℃条件下反应2h，通过sevage法除蛋白后，对其产物进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)分析。如图5所示，ppman对魔芋多糖的降解可以生成多种聚合度的低聚糖，dp＝2-12。因此，ppman可用于葡甘露低聚糖的制备以及与魔芋多糖降解相关方面的研究，包括农业、食品、饲料添加、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。
sequencelisting
<110>中国科学院大连化学物理研究所
<120>一种内切β-1,4-甘露聚糖酶编码基因及其制备与应用
<130>
<160>4
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1896
<212>dna
<213>多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa
<220>
<221>dna
<222>(1)..(1896)
<400>1
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<213>多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa
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