本发明涉及一种提高胆固醇氧化酶对底物谷甾醇的特异性的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术：
胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase；EC1.1.3.6；COD)属于黄素氧化酶类，能特异性氧化含C3-OH的类固醇底物，为催化胆固醇降解的第一步作用酶，氧化胆固醇C3-OH，随后异构化类固醇环上Δ5-6双键，其中以氧气为电子受体生成胆甾-4-烯-3-酮和H2O2。
胆固醇氧化酶具有重要医学检测价值，可用于定量血样胆固醇的含量，如动脉粥样硬化性疾病需评估高密度脂蛋白或低密度脂蛋白的含量，以及评估血栓形成的风险等，而将胆固醇氧化酶固定在膜上采用电化学生物传感器测定胆固醇的含量是最近研究的热潮；胆固醇氧化酶具有广泛的底物特异性，可以转化大量的3β-羟甾类化合物，同时伴随有异构化作用，为工业类固醇药物甾体激素或甾体类药物的合成生产提供有用的中间体。例如R.equi DSM89-133被用来转化胆固醇和其他的甾醇生产雄甾-4-烯-3,17-二酮和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。胆固醇氧化酶在生物催化方面的应用前景广阔，要求胆固醇氧化酶具有不同的底物特异性。
胆固醇，谷甾醇，孕烯酮醇，胆甾烷醇是四种胆固醇氧化酶常见的底物，它们有相同的环结构，差异在于R侧链不同。在生物催化生产类固醇药物前体物质需要胆固醇作用于不同侧链的类固醇。
为了提高胆固醇氧化酶的应用价值，对酶分子改造主要是改变底物特异性。Nishiya采用随机突变的方式找到V145E/G405S突变株能提高Km值并适于临床检测胆固醇含量；也有报道对StreptomycesSA-COO源CODs进行突变，发现突变酶对脱氧异雄酮的催化效率提高了，对囊泡胆固醇的催化效率降低了，这可能是因为突变损坏酶的疏水通道，破坏对疏水活性中心的保护。
目前，还鲜有关于提高胆固醇氧化酶对谷甾醇的特异性的报道。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种对谷甾醇底物特异性提高的胆固醇氧化酶突变体。
所述突变体的氨基酸序列是在NCBI上GenBank：ABC75776.1的胆固醇氧化酶氨基酸序列的基础上，缺失了第34位的氨基酸且第127位的氨基酸突变成为苏氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体，是在Rhodococcus sp.源(以前被分类命名为Brevibacterium sp.DGCDC-82)的胆固醇氧化酶基础上突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述Rhodococcus sp.源的CODr的核苷酸序列，如Genebank：DQ345780.1。
所述突变体对谷甾醇的底物特异性提高了6.2倍。
本发明还要求保护表达所述突变体的载体、工程菌，以及所述突变体在食品、环境、制备药物等方面的应用。
本发明还提供一种提高Rhodococcus sp.源的胆固醇氧化酶底物特异性的方法，所述方法是将Rhodococcus sp.源的胆固醇氧化酶的第34位的氨基酸进行缺失突变且将第127位的氨基酸G(甘氨酸)突变成苏氨酸T。
本发明的有益效果：
原始的Rhodococcus sp.源的胆固醇氧化酶对胆固醇，谷甾醇，孕烯酮醇，胆甾烷醇这4种底物的活性差不多，而本发明的突变体的底物特异性有显著变化，对谷甾醇的活性最高，是对胆固醇的活性的6.2倍。通过本发明的方法，有效提高了胆固醇氧化酶对底物谷甾醇的特异性。
具体实施方式
实施例1：突变株的构建
(1)化学合成CODr基因片段，序列如GenBank登录号为DQ345780.1(Rhodococcus sp.来源的胆固醇氧化酶)所示，将该基因片段连接到pET28a(+)，转化E.coli。提取重组E.coli，质粒，验证正确的质粒，即为重组质粒pET28a(+)-CODr。
(2)以pET28a(+)-CODr为模板，根据要缺失的第34位氨基酸和要突变的第127位氨基酸的前后序列，设计两对引物，引物上相应的位点核苷酸缺失或者为突变后的核苷酸。利用HS PCR酶(购于TaKaRa公司)采用全质粒PCR的方法进行PCR，PCR产物线性化处理后转化大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞。得到相对于GenBank：ABC75776.1的胆固醇氧化酶缺失了第34位的氨基酸且第127位的氨基酸突变成为苏氨酸的突变质粒pET28a(+)-CODrM。
(3)将pET28a(+)-CODrM转化得到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，验证重组转化子，验证正确的即为突变体菌株E.coli-CODrM，突变体菌株所产胆固醇氧化酶即为CODrM。
实施例2：突变株发酵产酶与酶纯化
(1)粗酶液的制备
种子液的培养条件：采用250mL摇瓶培养，装液为20％的LB培养基，并在培养基中加入过滤除菌的100mg·mL-1硫酸卡那霉素50μL，取单菌落至培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。
发酵液培养条件：采用500mL摇瓶培养，装液为20％的发酵培养基，其中的MgSO4·7H2O，葡萄糖，甘油分别配成母液，单独灭菌，用时添加相应的量，并加入过滤除菌100mg·mL-1的硫酸卡那霉素100μL，加入5％的种子液，37℃，200rpm，培养8h，加入20％的乳糖诱导液，28℃，200rpm，诱导培养20h。
菌体的收集及粗酶液的获得：将发酵液8000rpm离心5min，称得湿重，按1g湿菌体加入20mL pH7.5，20mmol·mL-1的磷酸缓冲液的比例重悬菌体，进行超声破碎，使用过程破壁4min，停1min，并吹打菌液，防止破壁过程中因温度过高导致酶的失活，破壁30min后8000rpm离心10min，上清即为粗酶液。
(2)COD的纯化
以琼脂糖为基质，2-羟基-1,3-丙二胺连接臂，8-氯咯嗪为配体合成的介质进行亲和纯化。
1.样品制备：将上样粗酶液的的电导率与20mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.5)的电导率调节到一致。
2.装柱：15mL塑料小柱垂直固定，柱子下端导管打开，装入3mL介质，静置沉淀，使柱中乙醇流出约至略高出介质界面。
3.平衡：用20mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.5)平衡10个柱体积。
4.上样：取20mL粗酶液加到平衡好的亲和介质中。
5.洗涤：用20mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.5)洗10个柱体积，洗去未结合的蛋白，再用含0.1mol·L-1NaCl的磷酸缓冲液(pH 7.5)洗去部分与介质结合不牢固的杂蛋白。
6.洗脱：以含0.5mol·L-1NaCl的磷酸缓冲液(pH 7.5)为洗脱液，收集并测定COD活性用SDS-PAGE检测蛋白的分子量大小和纯度。
实施例3：突变前后胆固醇氧化酶的底物特异性比较
选取胆固醇，谷甾醇，孕烯酮醇，胆甾烷醇四种底物，都配成21.3mmol·L-1的检测液B，测定酶活，并以胆固醇为底物时的活性为100％，计算以其他类固醇为底物时的相对活性，比较酶的底物特异性。
COD酶活的测定：
利用胆固醇氧化酶与辣根过氧化物酶的耦合反应，胆固醇氧化酶氧化类固醇底物产生的H2O2，可以在辣根过氧化酶的作用下使苯酚与4-氨基-安替比林产生红色苯醌亚胺类化合物，在A500处有最大吸收峰。具体操作：比色管中加入3mL检测液A(4-氨基-安替比林,1mmol/L；苯酚，6mmol/L；叠氮钠，0.2g/L；过氧化物酶，5,000U/L；磷酸钾缓冲液，25mmol/L，pH 7.5)+50uL酶液+150uL类固醇底物(异丙醇为溶剂)，三种组分振荡混匀后，37℃水浴15min，立即用沸水煮3min，使酶失活，放冷水中冷却；9000rpm，离心2min；上清A500处测吸光值，平行实验测三次，取平均值。酶活力单位定义：在37℃下，每分钟催化1μmol类固醇底物转化成产物所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
结果显示，原酶(wild-type)对4种底物的活性差不多，对孕烯酮醇的活性稍好，本发明的突变体CODrM的底物特异性有显著变化，对谷甾醇的活性最高，是对胆固醇的活性的6.2倍，而CODrM对孕烯酮醇和胆甾烷醇的活性分别为对胆固醇的活性的1倍、1.4倍。这可能是由于突变后胆固醇氧化酶的结构发生变化，而便于与谷甾醇接触、作用。本发明的突变体，改变酶的底物特异性，对谷甾醇的活性较好。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。