专利名称：荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酶分析技术领域，具体地说是涉及一种荧光探针的应用，其可 用于检测酶活性和筛选抑制剂。
背景技术：
传统的定量检测酶活性的方法是分光光度法。该方法是利用酶促反应前后 底物吸光度的变化求出底物浓度的变化值，从而得出酶的活性。这种方法由于 需要依靠紫外检测，使得其灵敏度低，而且酶和底物的消耗大，无法在低浓度 下检测酶活性。
另外一些定量检测酶活性的方法包括HPLC分析、电化学分析、化学发光 分析等。HPLC分析虽然具有定量分析的优点，但需要较多的样品量，灵敏度 偏低，而且难以连续、实时地进行检测。在大多情况下，电化学分析需要偶联 多步反应，甚至需要其它酶的参与，使反应体系变得复杂。灵敏度较高的化学 发光分析同样如此，而且不易操作，重复性差，难以准确地定量检测酶活性。
近年来由于荧光分析技术的灵敏度高，其在检测酶的活性方面越来越受到 人们关注，这种技术通常是将酶的底物设计成双标记分子，即在底物两端共价 连接两个不同的染料分子，两染料分子之间发生能量转移或电子转移，酶作用 于底物后两染料分子分开，切断了转移过程，使荧光光谱发生变化。但双标记 的成本较高，而且大多底物分子难以双标记修饰，酶的活性也可能受到较大影 响，所以此方法也不能广泛地应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有酶活性检测技术的种种不足，从而应用一系列 的水溶性共轭聚合物、共轭寡聚物以及具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物作 为荧光探针，使用这种具有高荧光量子产率的聚合物或寡聚物作为荧光探针， 并对酶的底物进行单标记，在应用于检测酶活性和筛选抑制剂时，可以具有高200710122197.6
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效、灵敏、定量、直接、简便、快速、灵敏、普适等优点。 本发明的目的是通过如下的技术方案实现的
本发明在检测酶活性和筛选抑制剂中所使用的荧光探针为下列之一
(一)水溶性共轭聚合物或共轭寡聚物 优选的，所述的水溶性共轭聚合物或共轭寡聚物为式I， II或III所示的 化合物
R'
其中，R1代表链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的烷基(链长为2 —12个碳)或芳基，优选下列基团中的一种2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺 基己基、4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、 4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基；
RMt表氢或链长为2—12个碳的烷氧基，优选下列基团中的一种甲氧 基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、2-甲氧基乙氧基、2-(2-甲氧 基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(2-甲氧基 乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基；
Ar为芴基、苯基、或噻吩基；
其中，Ri为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳 原子的垸基或芳基，优选下列基团中的一种2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺 基己基、4-(2-磺基乙氧萄苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、 4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-
羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基；
B为乙烯基(-CH=CH-)或乙炔基(-C三C-);
为了淬灭式I或II所示的化合物，需要使用下述的淬灭剂
Ar为芴基或苯基时，或B为乙炔基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、 硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为 淬灭剂；
Ar为噻吩基或B为乙烯基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、吖啶、 联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。
其中，R3为含有2--12个碳原子的烷基或垸氧基，优选下列基团中的一 种甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2-甲氧基乙基、2-(2-甲氧基乙氧 基)-乙基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙基、2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙 氧基)-乙氧基)-乙基；
W为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的 烷基或垸氧基，优选下列基团中的一种2-磺基乙氧基、4-磺基丁氧基、6-磺 基己氧基、2-(2-磺基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-磺基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、 2-羧基乙氧基、3-羧基丙氧基、4-羧基丁氧基、5-羧基戊氧基、6-羧基己氧基、 2-(3-羧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(3-羧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(3-羧 基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、6-磷酸基己基；
Ar为芴基、苯基或噻吩基；
为了淬灭式III所示的化合物，需要使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝 基苯、多硝基苯、芘、吖锭、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为淬 灭剂。
(二)具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物 优选的，所述的具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物包括式IV所示的化 合物
<formula>formula see original document page 10</formula>
式IV
其中，Rs为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2 — 12个碳 原子的垸基或芳基，优选下列基团中的一种2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺 基己基、4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、 4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基；
W为氢或含有2—12个碳原子的烷氧基，优选下列基团中的一种氢、 甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、2-甲氧基乙氧基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(2-甲 氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基；
Ar为芴基、苯基或噻吩基；
L为含有2—12个碳原子的烷基或环垸基，优选下列基团中的一种亚甲 基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、 3-氧杂亚戊基、3,6-二氧杂亚辛基、环己基；
为了淬灭式IV所示的化合物，需要使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝 基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、联吡啶、卟啉中的一 种作为淬灭剂。
本发明提供一种上述荧光探针在检测酶活性中的应用，该酶活性定量检测 方法，包括如下的步骤
第一步，对酶底物进行化学修饰通过共价键合，在酶底物上连接一个与 荧光探针所匹配的淬灭剂基团，得到修饰过的酶底物；
第二步，绘制标准检测曲线将修饰过的酶底物与上述的荧光探针反应， 完全淬灭荧光探针的荧光分批将第一步得到的修饰过的酶底物加入含有荧光
探针的缓冲液中，修饰过的酶底物与荧光探针通过静电作用在缓冲液中形成静 电复合物并淬灭荧光，直至荧光探针的荧光淬灭至99%以上，记录此过程中酶
底物浓度[Q]和荧光强度F，以(F(/F-l)为纵坐标，[Q]为横坐标，绘制 Stem-Volmer淬灭曲线，以此作为标准检测曲线，建立了荧光强度与酶底物浓 度的定量关系；
该淬灭曲线是直线的情况下，Stern-Volmer方程为
F。/F陽卜K卿[Q〗 其中，F。是加入酶底物之前的荧光强度， F是加入酶底物之后的荧光强度， [Q]是混合液中酶底物浓度， K，是表观系数，为一常数值； 该淬灭曲线是抛物线的情况下，Stem-Volmer方程为
(F0/F-l) =A[Q]+B[Q]2 其中，Fo是加入酶底物之前的荧光强度， F是加入酶底物之后的荧光强度， [Q]是混合液中酶底物浓度， A、 B为常数；
第三步，待测酶的活性分析将不同浓度的修饰过的酶底物与荧光探针反
应后，分别加入待测的酶，荧光信号随着酶的加入量逐渐恢复，进行一系列荧 光发射光谱测定混合液的荧光强度值，然后根据第二步得到的标准检测曲线将 荧光强度值转换为底物浓度值，并以此底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为 横坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线，斜率即为反应初
速度；
再以反应初速度的倒数为纵坐标Y，酶底物初始浓度的倒数为横坐标X， 绘制Lineweaver-Burk曲线，该曲线接近直线，且符合方程
Y= 61.067 + 241.90445 X，通过斜线的横截距-1/《m求出Xm，可以计算 出酶促反应过程中某时刻在溶液中的酶底物的浓度，从而计算酶的活性。
所述的待测的酶可以是酯酶、磷酸酶、半乳糖核苷酶等。
本发明提供一种上述荧光探针在酶抑制剂的筛选中的应用，该酶抑制剂的 筛选方法，包括如下的步骤
第一步，如前所述，先绘制荧光强度与酶底物浓度的标准检测曲线； 第二步，在酶促反应缓冲液中加入酶和待筛选的抑制剂，平行进行多个反
应，每个反应缓冲中酶的浓度相同，抑制剂的浓度为从零开始的不同的浓度，
温育0-20分钟时间；
第三步，向第二步的混合液中加入前述的荧光探针，测定初始荧光强度后
加入经淬灭剂修饰的酶底物，继续温育0 - 120分钟时间后，测定荧光光谱，
取荧光强度值，并按第一步的标准曲线将荧光强度值转换成酶底物浓度；按照
下列公式，计算抑制率正％;
IE% = (C,(inhibitor) — C"noinhibitor))/(C。
一 C《no inhibitor)) X 100%
其中，c。为底物的初始浓度，
C—hibitor)禾口 C"no i nhibitor) 分别是加了抑制剂和不加抑制剂的底物浓度。
第四步，然后以计算出的正％为纵坐标、抑制剂浓度为横坐标绘制曲线，
求出正％为50%时对应的抑制剂浓度，即酶活性被抑制50%时的抑制剂浓度，
得到该抑制剂的IC50值。
本发明基于利用具有优越的荧光性能的荧光探针与共价连接酶底物的淬 灭剂分子先形成复合物淬灭荧光，然后再用耙酶分子使荧光信号恢复，可以连 续、均相、定量且实时地混合即测定("mix and detect")地观察底物被酶消化 的过程。
与一般的荧光染料分子相比，本发明应用的水溶性共轭聚合物、共轭寡聚 物和具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物在水溶液中具有更高的荧光量子产 率，是一种可以在低浓度下使用的荧光探针。
本发明使用了这种荧光检测体系检测酶的活性时，荧光探针的荧光淬灭达 到99%以上，即深度淬灭(Superquenching)，可以显著降低荧光背景，从而可 以大幅度地提高检测方法的灵敏度。此外，本发明应用的这种荧光探针还可大 幅提高荧光信号恢复倍数，甚至可恢复达100倍以上。
应用了本发明的这种荧光探针的检测酶活的方法，还可拓展到抑制剂的筛 选研究中。例如，乙酰胆碱酯酶(AChE)、 丁酰胆碱酯酶(BuChE)、 0-半乳 糖苷酶等，是阿尔茨海默氏症、肿瘤等相关的靶酶或标志酶，与人类自身许多 疾病密切相关，可以使用本发明的方法来对其进行酶活性的检测，在疾病诊断
方面具有重要意义。而且，许多酶抑制剂在医学上是研究疾病药物的一个重要 方向和途径，酶抑制剂筛选的工作无疑具有不可或缺的作用，本发明为其提供 了另一种新的途经。
本发明在检测酶活性和筛选抑制剂中应用了具有优越的荧光性能的荧光 探针，使得这些方法具有操作简便、响应快、灵敏度高等特点。
图1为实施例1中向PFP-S(V加入经修饰的酶底物后的荧光光谱；
图2为实施例1得到的Stem-Volmer淬灭曲线；其中，Fo是加入酶底物之 前的荧光强度，F是加入酶底物之后的荧光强度，[Q]是混合液中酶底物浓度， 即修饰的酶底物浓度；
图3为实施例1中不同底物初始浓度和反应时间的曲线；
图4为实施例1中的Lineweaver-Burk曲线；
图5为实施例1中的酶抑制曲线；
图6为实施例2中向PFP-COOH加入经修饰的酶底物后的荧光光谱；
图7为实施例2得到的Stem-Volmer淬灭曲线；
图8为实施例2中不同底物初始浓度和反应时间的曲线；
图9为实施例2中的Lineweaver-Burk曲线； 。
具体实施例方式
以下结合附图及本发明的技术方案提供实施例。 实施例1、荧光探针PFP-S03-在酶活性分析及抑制剂筛选中的应用
化学修饰的酶底物制备在氮气保护下，向装有二甲基亚砜(0.5 mL)的 10mL二口瓶中加入6-(对甲基红)氨基己酸(38mg， 0.1 mmol)和羰基二咪唑 (24mg， 0.15mmo1)，室温下磁力搅拌30分钟。用注射器将反应液转移到装 有溴乙酰胆碱(10mg， 0.08mmo1)、 二氮双环H^—碳-7-烯(21 ^L, 0.14 mmol) 和二甲基亚砜(0.25 mL)的5mL单口瓶中，于40。C搅拌反应24小时。减压 浓縮后，经硅胶柱分离(洗脱剂二氯甲烷/甲醇/水=65/25/4， v/v/v)，得到目 标产物6-(对甲基红)氨基己酰胆碱溴(15mg， 34%),即在酶底物上连接了与 荧光探针PFP-S03'所匹配的淬灭剂基团。 式V
标准检测曲线的绘制向3 mL比色池加入1.0 mL磷酸缓冲溶液(25 mM， pH8)，加入作为荧光探针的聚合物PFP-S03—(式V)至2.0pM，在376 nm
激发波长下测定其荧光发射光谱。然后持续滴加上述修饰过的酶底物至0.80 pM，每次滴加酶底物后测定荧光发射光谱(如图1所示)。记录荧光发射光谱 424 nm处的荧光强度值，以(Fq/F-1 )为纵坐标，[Q]为横坐标，绘制Stem-Volmer 曲线，以此作为标准检测曲线，建立了荧光强度与酶底物浓度的定量关系如图 2所示。
乙酰胆碱酯酶(AChE)活性分析向3mL比色池中加入1.0 mL磷酸缓 冲溶液(25mM， pH8)，加热至37。C，加入聚合物PFP-SCV至2.0 ^M，记录 荧光发射光谱424 nm处的荧光强度值，再加入上述修饰过的酶底物至0.2 pM，记录荧光发射光谱424 nm处的荧光强度值，加入1.0单位AChE，荧 光信号逐渐恢复，80秒内测定一系列荧光发射光谱，并记录荧光发射光谱424 nm处的荧光强度值。改变上述修饰过的酶底物初始浓度值分别为0.25， 0.3， 0.4， 0.6 ^M，重复上述实验。按标准检测曲线(图2)将荧光强度值转换为底 物浓度值，以底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横坐标，在同一张图上绘 制不同底物浓度下的浓度变化曲线(图3)，斜率为反应初速度。再以反应初 速度的倒数为纵坐标，酶底物初始浓度的倒数为横坐标，绘制Lineweaver-Burk 曲线(图4)，曲线接近直线，方程为Y= 61.067 +241.90445 X，横截距-1/Km =-0.252，求出《m=4.0 (iM。
乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂ICs。值测定按照上述标准检测曲线的绘 制方法，在pH7.4的磷酸缓冲液中绘制标准检测曲线。向1.0mL磷酸缓冲液
(25mM， pH7.4)加入1.0单位AChE，和不同浓度的抑制剂(加兰他敏 0, 0.002， 0.01， 0.02, 0.1， 0.3 ^M;多奈派奇0, 0.005， 0.01, 0.05， 0.1 (xM),在25°C 温育15分钟，然后加入PFP-S03—至2.0 (iM，加入酶底物至0.3 pM，在37°C
温育10分钟后，测定荧光光谱。按标准检测曲线将荧光强度值转换为底物浓 度值，按公式正％ = (C"
inhibitor) —C"no i油ibitor))/(Co — C,(no inhibitor)) X 100%
计算抑制率正％，公式中Q为底物的初始浓度，C一hto一和C《
no inhibitor)分另U为
加入抑制剂和不加抑制剂的底物浓度。然后以抑制率为纵坐标、抑制剂浓度为
横坐标绘制曲线(图5)，求出抑制率为50%对应的抑制剂浓度，即该抑制剂
的IC50值。
实施例2、荧光探针PFP-COOH在酶活性分析中的应用
先按照实施例1中的方法制备相同的化学修饰的酶底物。 绘制标准检测曲线向3 mL比色池加入1.0 mL磷酸缓冲溶液(25 mM， pH8)，加入聚合物PFP-COOH (式VI)至2.0pM， 376 nm激发波长下测定 其荧光发射光谱。然后持续滴加上述修饰过的酶底物，每次滴加上述修饰过的 酶底物后测定荧光发射光谱。记录荧光发射光谱424 nm处的荧光强度值，以 (F0/F-l)为纵坐标，[Q]为横坐标，绘制Stem-Volmer曲线，以此作为标准检 测曲线，如图7所示。
式VI
AChE活性分析向3 mL比色池加入1.0 mL磷酸缓冲溶液(25 mM， pH 8)，平衡至37。C，加入聚合物PFP-COOH(式VI， m = n = 0.5)至2.0 ^M，记 录Xem = 424 nm处的荧光强度值，加入修饰的上述修饰过的酶底物至0.2 (iM， 荧光发射光谱424 nm处的荧光强度值，加入1.0单位AChE， 80s内测定一 系列荧光光谱，记录荧光发射光谱424 nm处的荧光强度值。改变底物初始浓 度值分别为0.25， 0.3， 0.4， 0.6(iM，重复上述实验。按标准检测曲线(图7) 将荧光强度值转换为底物浓度值，以底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横 坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线(图8)，斜率为反 应初速度。再以反应初速度的倒数为纵坐标，酶底物初始浓度的倒数为横坐标，
绘制Lineweaver-Burk曲线(图9)，曲线接近直线，方程为Y= 8.54621 + 74.51479X,横截距-l/《m = -0.115，求出/^^8.7(iM。
权利要求
1、一种荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，所述的荧光探针为式I，II或III所示的水溶性共轭聚合物或共轭寡聚物 式I其中，R1代表链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的烷基或芳基；R2代表氢或链长为2—12个碳的烷氧基；Ar为芴基、苯基、或噻吩基； 式II其中，R1为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的烷基或芳基；B为乙烯基(-CH＝CH-)或乙炔基(-C≡C-)；式III其中，R3为含有2—12个碳原子的烷基或烷氧基；R4为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2—12个碳原子的烷基或烷氧基；Ar为芴基、苯基或噻吩基。
1、 一种荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，所述的荧光探针 为式I， II或III所示的水溶性共轭聚合物或共轭寡聚物其中，W为含有2—12个碳原子的垸基或烷氧基；R"为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2 — 12个碳原子的 烷基或烷氧基；Ar为芴基、苯基或噻吩基。
2、根据权利要求1所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用， 其特征在于所述的Ri选自下列基团中的一种2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺基己基、4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基) 苯基、4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁 基、6-羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基；所述的W选自下列基团中的一种甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、 戊氧基、己氧基、2-甲氧基乙氧基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-甲氧 基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧 基。
3、 根据权利要求1所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，其特征在于所述的W选自下列基团中的一种甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2-甲氧基乙基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙基、 2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙基；所述的R"选自下列基团中的一种2-磺基乙氧基、4-磺基丁氧基、6-磺基 己氧基、2-(2-石黄基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-石黄基乙氧基>乙氧基)-乙氧基、2-羧基乙氧基、3-羧基丙氧基、4-羧基丁氧基、5-羧基戊氧基、6-羧基己氧基、 2-(3-羧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(3-羧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(3-羧 基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、6-磷酸基己基。
4、 根据权利要求1或2所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的 应用，其特征在于为了淬灭式I或II所示的化合物，使用的淬灭剂为Ar为芴基或苯基时，或B为乙炔基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、 硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为 淬灭剂；Ar为噻吩基或B为乙烯基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、吖啶、 联吡啶、n卜啉中的一种作为淬灭剂。
5、 根据权利要求1或3所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，其特征在于为了淬灭式m所示的化合物，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一 种作为淬灭剂。
6、 一种荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用，所述的荧光探针 为式IV所示的具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物<formula>formula see original document page 4</formula>其中，RS为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2 — 12个碳 原子的烷基或芳基；R6为氢或含有2—12个碳原子的烷氧基；Ar为芴基、苯基或噻吩基；L为含有2—12个碳原子的垸基或环垸基。
7、 根据权利要求6所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用， 其特征在于所述的RS选自下列基团中的一种2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺基己基、 4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-羧基 己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基；所述的W选自下列基团中的一种氢、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧 基、戊氧基、己氧基、2-甲氧基乙氧基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基、2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙 氧基；所述的L选自下列基团中的-种亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、 亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、3-氧杂亚戊基、3，6-二氧杂亚辛 基、环己基。
8、 根据权利要求6或7中所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中 的应用，其特征在于为了淬灭式IV所示的化合物，使用选自对甲基红、苯 醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、联吡啶、 卟啉中的一种作为淬灭剂。
9、 根据权利要求1所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用， 所述的酶活性定量检测方法包括如下的步骤第一歩，对酶底物进行化学修饰通过共价键合，在酶底物上连接一个与 荧光探针所匹配的淬灭剂基团，得到修饰过的酶底物；第二步，绘制标准检测曲线将修饰过的酶底物与上述的荧光探针反应， 完全淬灭荧光探针的荧光分批将第一步得到的修饰过的酶底物加入含有荧光 探针的缓冲液中，修饰过的酶底物与荧光探针通过静电作用在缓冲液中形成静 电复合物并淬灭荧光，直至荧光探针的荧光淬灭至99%以上，记录此过程中酶底物浓度[Q]和荧光强度F，以(F。/F-l)为纵坐标，[Q]为横坐标，绘制 Stem-Volmer淬灭曲线，以此作为标准检测曲线，建立了荧光强度与酶底物浓 度的定量关系；该淬灭曲线是直线的情况下，Stem-Volmer方程为F0/F-l=Kapp[Q] 其中，F。是加入酶底物之前的荧光强度， F是加入酶底物之后的荧光强度， [Q]是混合液中酶底物浓度， K，是表观系数，为一常数值； 该淬灭曲线是抛物线的情况下，Stem-Volmer方程为(F0/F-l) =A[Q] + B[Q]2 其中，F。是加入酶底物之前的荧光强度， F是加入酶底物之后的荧光强度， [Q]是混合液中酶底物浓度， A、 B为常数；第三步，待测酶的活性分析将不同浓度的修饰过的酶底物与荧光探针反应后，分别加入待测的酶，荧光信号随着酶的加入量逐渐恢复，进行一系列荧 光发射光谱测定混合液的荧光强度值，然后根据第二步得到的标准检测曲线将 荧光强度值转换为底物浓度值，并以此底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为 横坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线，^"率即为反应初速度；再以反应初速度的倒数为纵坐标Y，酶底物初始浓度的倒数为横坐标X， 绘制Lineweaver-Burk曲线，该曲线接近直线，且符合方程 Y= 61.067 + 241.90445 X，通过斜线的横截距-1/《 1求出^1，可以计算 出酶促反应过程中某时刻在溶液中的酶底物的浓度，从而计算酶的活性。
10、根据权利要求1所述的荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应 用，所述的酶抑制剂的筛选方法包括如下的步骤第一歩，绘制荧光强度与酶底物浓度的标准检测曲线；第二步，在酶促反应缓冲液中加入酶和待筛选的抑制剂，平行进行多个反 应，每个反应缓冲中酶的浓度相同，抑制剂的浓度为从零开始的不同的浓度， 温育0-20分钟时间；第三步，向第二歩的混合液中加入前述的荧光探针，测定初始荧光强度后 加入经淬灭剂修饰的酶底物，继续温育0 - 120分钟时间后，测定荧光光谱， 取荧光强度值，并按第一步的标准曲线将荧光强度值转换成酶底物浓度；按照 下列公式，计算抑制率正％;IE% = (C,(inhibitor) — C,(noinhibitor))/(Co — C,(no inhibitor)) X 100%其中，Q为底物的初始浓度，C《inhibitor)禾卩C,(n0 inhibitor) 分别是加了抑制剂和不加抑制剂的底物浓度。 第四步，然后以计算出的IE。^为纵坐标、抑制剂浓度为横坐标绘制曲线， 求出正％为50%时对应的抑制剂浓度，即酶活性被抑制50%时的抑制剂浓度， 得到该抑制剂的ICw值。
全文摘要
本发明涉及一种荧光探针在检测酶活性和筛选抑制剂中的应用。本发明应用一系列的水溶性共轭聚合物、共轭寡聚物以及具有发色团的非共轭聚合物或寡聚物作为荧光探针，使用这种具有高荧光量子产率的聚合物或寡聚物作为荧光探针，并对酶的底物进行单标记，在应用于检测酶活性和筛选抑制剂时，可以具有高效、灵敏、定量、直接、简便、快速、灵敏、普适等优点。
文档编号C09K11/06GK101393128SQ20071012219
公开日2009年3月25日 申请日期2007年9月21日 优先权日2007年9月21日
发明者冯福德, 树 王 申请人:中国科学院化学研究所