B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法与流程

本发明涉及胰岛素类似物(或人胰岛素前体)晶体的制备方法，尤其涉及一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素(desB30)晶体的制备方法，属于重组人胰岛素及其类似物晶体的制备领域。
背景技术：
：近年来随着人们生活水平的提升，糖尿病患者数量也持续增加。目前，糖尿病已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤后的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病。中国糖尿病患病人数已突破一亿，并取代印度成为世界第一，世界卫生组织(WHO)预测至2025年全球糖尿病人数将突破3.0亿。胰岛素制品是公认的最有效的糖尿病治疗手段之一。随着科学技术的发展，从提取动物胰岛素到有机合成胰岛素、半合成人胰岛素，到现如今占主要市场的重组人胰岛素，胰岛素的工业化生产过程已经历了翻天覆地的变化。去除B30位苏氨酸的胰岛素(desB30)是通过重组微生物发酵得到胰岛素前体经纯化、酶切后得到的重要中间体，后续通过不同的修饰反应和纯化后可制备得到地特胰岛素、德谷胰岛素或其它胰岛素类似物。地特胰岛素是一种中性、可溶的长效胰岛素，它是原型胰岛素去除了B链第30为苏氨酸，通过酰化作用在B29位赖氨酸侧链氨基结合一个14碳的直链脂肪酸而成，具有药效长并可减少低血糖的出现等优点。德谷胰岛素是新一代可溶性、超长效基础胰岛素类似物，其分子保留了绝大部分的人胰岛素氨基酸序列，仅是去掉人胰岛素B链30位的苏氨酸，并通过谷氨酸连接子将一个十六碳脂肪二酸侧链连接到B29位赖氨酸上，具有药效长，低血糖发生率低的特点。虽然desB30样品经过胰岛素前体发酵液微孔过滤、初级纯化、酶切和等电点沉淀，但由于发酵产物的成分相对复杂，酶切得到的desB30纯度约在80％左右，还是有很多可见和不可见的色素或其它蛋白或核酸等，影响后续工艺的开发，同时易造成对纯化介质的污染，影响其使用次数。除此之外，直接等电点沉淀的desB30还存在不稳定、易降解或脱氨等缺点，因此需要增加一步工艺去除这些杂质，提高澄清度和纯度以及储存稳定性。通过对desB30样品进行结晶工艺研究，获得晶型相对均一的晶体，desB30以固态晶体形式存在，样品更稳定，更易贮存。另外desB30晶体的纯度高，有利于后续修饰反应的开展。因此，进行desB30的结晶工艺研究具有重要意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素(desB30)晶体的制备方法，该方法操作简单，结晶的收率高，所制备的desB30晶体形状规则、大小均一，而且纯度高。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：本发明首先公开了一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法，包括以下步骤：(1)将B30位苏氨酸缺失人胰岛素溶解，加入有机溶剂、锌离子、柠檬酸三钠和无机盐，得到结晶液；(2)调节结晶液的pH值，进行结晶，即得。其中，步骤(1)所述结晶液中柠檬酸三钠的浓度为0.01-0.1M，优选为0.01-0.05M，更优选为0.025-0.05M，最优选为0.04-0.05M。步骤(1)所述结晶液中锌离子与B30位苏氨酸缺失人胰岛素的摩尔比为7-20：1，优选为10-15：1，更优选为10-12：1，最优选为10-11：1。所述锌离子来自于常见的锌源，优选的，所述锌离子来自于氯化锌、醋酸锌或碘化锌中的任意一种，优选为氯化锌或醋酸锌中的任意一种。步骤(1)所述结晶液中有机溶剂的体积百分比为5-20％，优选为8-18％，更优选为9-15％，最优选为10-15％；所述有机溶剂选自丙酮、乙腈或2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)中的任意一种，优选为丙酮。步骤(1)所述结晶液中无机盐的浓度为0.01-0.05M，优选为0.01-0.03M，最优选为0.01-0.02M。所述无机盐选自氯化钠、硫酸铵或醋酸铵中的任意一种或两种，优选为氯化钠。步骤(1)所述结晶液中B30位苏氨酸缺失人胰岛素的浓度为3-9g/L，优选为3-5g/L。步骤(1)所述溶解是用稀酸溶解B30位苏氨酸缺失人胰岛素；其中，所述稀酸的浓度为10-40mM，优选为15-30mM；最优选为20-25mM；所述稀酸选自盐酸、柠檬酸或醋酸中的任意一种。步骤(2)所述调节结晶液的pH值包括：先调节结晶液的pH值为7.6-8.5，然后加入有机酸调节pH值为5.7-6.2；优选为，先调节结晶液的pH值为7.8-8.0，然后加入有机酸调节pH值为5.8-6.0。其中，可采用常见的碱调节pH值至7.6-8.5，例如氨水或氢氧化钠，优选为氨水；所述有机酸为柠檬酸。步骤(2)所述结晶的方式选自①-②中的任意一种：①室温静置15-50min，低速搅拌3-6h，然后2-8℃静置5-9h，得到结晶；优选为，室温静置40-50min，低速搅拌3-4h，然后4℃静置8-9h，得到结晶；②室温静置5-6h，然后4℃静置8-10h。所述室温为10-25℃。B30位苏氨酸缺失胰岛素与人胰岛素相比，缺少一个氨基酸；与地特胰岛素相比，缺少在B29位赖氨酸侧链氨基酰化结合一个14碳的直链脂肪酸；与德谷胰岛素相比，缺少在B29位赖氨酸侧链通过谷氨酸连接子连接的16碳脂肪二酸侧链；所以，其结构和性质与人胰岛素、地特胰岛素或德谷胰岛素均不相同，其结晶方法需要进行探索。本发明desB30样品为等电点沉淀离心后收集的样品，纯度只有80％左右，可见和不可见的杂质较多，结晶难度大。本发明对desB30的结晶条件进行了优化。本发明试验发现，柠檬酸三钠对结晶体系影响较大，柠檬酸三钠浓度太低，结晶体系无法缓冲，会导致样品部分形成沉淀，无法结晶；柠檬酸三钠浓度过高，会导致上清中desB30样品的残余大幅增加，影响收率。本发明确定结晶液中柠檬酸三钠的浓度为0.025-0.05M，结晶效果好。结晶液中锌离子和desB30的摩尔比对结晶效率有显著的影响。锌离子和desB30的摩尔比在7-20：1范围内，desB30结晶效果较好，上清中残余的未结晶的desB30低于8.6％；而锌离子和desB30的摩尔比在10-15：1，desB30结晶效果更佳，上清残余比低于6.7％；锌离子和desB30的摩尔比为11：1，desB30结晶效果最佳；当锌离子和desB30的摩尔比超出上述范围，会导致上清中残余的未结晶的desB30量显著增加，影响收率。结晶液中有机溶剂浓度及desB30浓度对结晶的效果也有较大的影响。有机溶剂浓度虽对上清中残余的未结晶的desB30量影响不是很明显，但是对晶体大小影响明显。有机溶剂浓度过高，体积百分比超出20％后，晶体大小会明显变小。因此，本发明确定有机溶剂比例在10-15％，desB30结晶效果较好。结晶液中desB30的浓度较低时，结晶残余虽然比较低，但结晶效率比较低，不适合生产；当蛋白浓度比较高，达14g/L，会导致上清中残余的未结晶的desB30量明显增加；当蛋白浓度过高，达20g/L，会导致蛋白沉淀从而无法结晶。因此，本发明确定DesB30蛋白浓度在3-9g/L，结晶效果较好。酸调节结晶液的pH终点也会对上清中残余的未结晶的desB30比例产生影响，pH超出5.7-6.2，尤其是超出5.8-6.0的范围会导致desB30损失明显增加。结晶方式对最后晶体的形态以及收率影响很大。本发明试验发现，只是静置结晶，上清残余较多，损失较大，而且晶形较大；搅拌或者摇床结晶，上清残余少，收率高，但是晶形小，破碎的多。本发明通过多次试验，确定先静置让晶核变大，然后再低速搅拌促进结晶析出，最后低温静置，结晶效果较好。本发明通过对结晶条件的优化，所制备的desB30晶体形状规则、大小均一，desB30结晶的最终收率达到95％以上，纯度提高10％。同时，本发明获得的desB30结晶易于与上清分离，可通过直接吸取上清收集，或采用自然沉降或离心的方式收集，样品中残余的试剂不影响后续酰化工序，而且收集的晶体易冻干或冷冻保存，冷冻干燥时间短。同时，desB30以固态晶体形式存在，相比液体或以无定形的等电点沉淀的冻存形式，样品更稳定，更易贮存。另外，本发明制备的desB30晶体纯度高、溶解性好，且溶液澄清度高，可与后续修饰工艺直接衔接，制备地特胰岛素或德谷胰岛素等胰岛素类似物，适用于工业化生产。本发明B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法，利用等电点沉淀离心收集的desB30样品直接进行结晶，结晶后收集的样品可直接溶解用于后续修饰反应，能够很好的与上下游工艺相衔接。本发明方法将对后续desB30的修饰和纯化工艺产生有利的影响，例如减轻后续纯化上样压力，降低对纯化填料的污染，增加填料的可循环使用次数等。本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明B30位苏氨酸缺失人胰岛素(desB30)晶体的制备方法，结晶的收率高，操作简单，可用于desB30蛋白的工业化结晶。本发明所制备的desB30结晶形状规则、大小均一，而且纯度高，溶解性好，溶液澄清度高，有助于后续修饰反应的开发。附图说明图1是实施例1制备的desB30结晶放大200倍镜检图；图2是实施例2制备的desB30结晶放大200倍镜检图；图3是实施例3制备的desB30结晶放大200倍镜检图；图4是实施例4制备的desB30结晶放大200倍镜检图；图5是实施例5制备的desB30结晶放大200倍镜检图；图6是实施例6制备的desB30结晶放大200倍镜检图；图7是实施例7制备的desB30结晶放大200倍镜检图；图8是实施例8制备的desB30结晶放大200倍镜检图；图9为结晶前后desB30高效液相检测图谱对比；图10为试验例4中试验组4有机溶剂比例为20％制备的desB30结晶镜检图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。1、材料desB30苏氨酸缺失人胰岛素：昂德生物药业有限公司提供。柠檬酸(C6H8O7.H2O)购自国药集团化学试剂有限公司，批号20131120；氯化钠(NaCl)购自上海凌峰化学试剂有限公司，批号20160122；盐酸(HCl)购自国药集团化学试剂有限公司，批号20160301；氢氧化钠(NaOH)购自上海凌峰化学试剂有限公司，批号20160108；乙酸(C2H4O2)购自上海天莲化工科技有限公司，批号2015-06-15-149；乙腈(CH3CN，HPLC级)购自赛默飞世多科技(中国)有限公司，批号155757；丙酮(C3H6O)购自国药集团化学试剂有限公司，批号为20160615；柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)购自SangonBiotech，批号C226BA0012；氨水(NH3.H2O)购自上海凌峰化学试剂有限公司，批号20100720；氯化锌(ZnCl2)购自上海凌峰化学试剂有限公司，批号20130705；醋酸锌(C4H6O4Zn)购自默克股份两合公司，批号1.08802.0250；碘化锌(ZnI2)购自上海凌峰化学试剂有限公司，批号20110408；硫酸铵购自上海凌峰化学试剂有限公司，批号20120508；醋酸铵购自上海凌峰化学试剂有限公司，批号20110807；分析型高效液相仪器为安捷伦1260，分析型色谱柱为Kromasil300-5-C4(4.6mm×250mm)；pH计购自梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司，型号S210。实施例1制备desB30结晶液，各组分浓度分别为：desB30浓度为3g/L，丙酮浓度为15％(体积百分比)、柠檬酸三钠浓度为0.05M，硫酸铵浓度为0.03M，锌离子与desB30的摩尔比为10:1。结晶过程：称取一定量的desB30样品，溶于20mM的盐酸，采用高效液相检测其浓度为13.91mg/ml，精确量取8.62mldesB30溶液加入锥形瓶中；加入19.4ml水混匀待用；加入丙酮6ml；加入1％ZnCl2溶液2.9ml；加入1M柠檬酸三钠2ml；加入硫酸铵0.16g；用氨水调节pH为8.0，然后加入柠檬酸调节pH值为5.95，终体积为40ml。室温静置5h，然后4℃温度下静置8h得到结晶。取上清液检测样品残余，结果为3.6％。取结晶悬浮液在200倍显微镜下镜检，结果见图1，可见结晶多数为规则的六棱体，有少量性状不规则晶体。实施例2制备desB30结晶液，各组分浓度分别为：desB30浓度为3g/L，丙酮浓度为15％(体积百分比)、柠檬酸三钠浓度为0.05M，氯化钠浓度为0.01M，锌离子与desB30的摩尔比为11:1。结晶过程：称取一定量的desB30样品，溶于20mM的盐酸，采用高效液相检测其浓度为13.91mg/ml，精确量取8.62mldesB30溶液加入锥形瓶中；加入16.5ml水混匀待用；加入丙酮6ml；加入1％ZnCl2溶液3.2ml；加入1M柠檬酸三钠2ml；加入0.023g氯化钠；用氨水调节pH为8.0，然后加入柠檬酸调节pH值为5.93，终体积为40ml。室温静置50min，然后低速搅拌3h后，再在4℃温度下静置9h得到结晶。取上清液检测样品残余，结果为3.6％。取结晶悬浮液在200倍显微镜下镜检，结果见图2，可见绝大多数晶体形状规整，大小均一且晶体较大。实施例3制备desB30结晶液，各组分浓度分别为：desB30浓度为4g/L，乙腈浓度为15％(体积百分比)、柠檬酸三钠浓度为0.025M，氯化钠浓度为0.03M，锌离子与desB30的摩尔比为11:1。结晶过程：称取一定量的desB30样品，溶于20mM的盐酸，采用高效液相检测其浓度为14.15mg/ml，精确量取11.31mldesB30溶液加入锥形瓶中；加入10.77ml水混匀待用；加入乙腈6ml；加入1％ZnI2溶液9.85ml；加入1M柠檬酸三钠1ml；加入0.07g氯化钠；用氨水调节pH为7.9，然后加入柠檬酸调节pH值为5.95，终体积为40ml。室温静置5h，然后4℃温度下静置8h得到结晶。取上清液检测样品残余，结果为3.5％。取结晶悬浮液在200倍显微镜下镜检，结果见图3，可见晶体大小均一，形状规则，极少量没有形成完整晶体。实施例4制备desB30结晶液，各组分浓度分别为：desB30浓度为3g/L，乙腈浓度为15％(体积百分比)、柠檬酸三钠浓度为0.05M，硫酸铵浓度为0.03M，锌离子与desB30的摩尔比为10:1。结晶过程：称取一定量的desB30样品，溶于15mM的盐酸，采用高效液相检测其浓度为13.91mg/ml，精确量取8.62mldesB30溶液加入锥形瓶中；加入20.1ml水混匀待用；加入乙腈6ml；加入1％ZnCl2溶液3.2ml；加入1M柠檬酸三钠2ml；加入3.96g硫酸铵；用氢氧化钠调节pH为8.0，然后加入柠檬酸调节pH值为5.85，终体积为40ml。室温静置6h，然后4℃温度下静置9h得到结晶。取上清液检测样品残余，结果为7.5％。取结晶悬浮液在200倍显微镜下镜检，结果见图4，可见有少部分未成形晶体，其余晶体形状规则，大小均一。实施例5制备desB30结晶液，各组分浓度分别为：desB30浓度为5g/L，MPD浓度为10％(体积百分比)、柠檬酸三钠浓度为0.05M，氯化钠浓度为0.02M，锌离子与desB30的摩尔比为11:1。结晶过程：称取一定量的desB30样品，溶于25mM的盐酸，采用高效液相检测其浓度为15.63mg/ml，精确量取7.68mldesB30溶液加入锥形瓶中；加入18.2ml水混匀待用；加入MPD4ml；加入1％醋酸锌溶液7.07ml；加入1M柠檬酸三钠2ml；加入0.05g氯化钠；用氢氧化钠调节pH为8.0，然后加入柠檬酸调节pH值为5.9，终体积为40ml。室温静置6h，然后4℃温度下静置10h得到结晶。取上清液检测样品残余，结果为2.5％。取结晶悬浮液在200倍显微镜下镜检，结果见图5，晶体形状完整规则，均一性好。实施例6制备desB30结晶液，各组分浓度分别为：desB30浓度为3.5g/L，乙腈浓度为10％(体积百分比)、柠檬酸三钠浓度为0.03M，氯化钠浓度为0.01M，锌离子与desB30的摩尔比为12:1。结晶过程：称取一定量的desB30样品，溶于25mM的盐酸，采用高效液相检测其浓度为15.63mg/ml，精确量取5.38mldesB30溶液加入锥形瓶中；加入20.6ml水混匀待用；加入乙腈4ml；加入1％醋酸锌溶液7.71ml；加入1M柠檬酸三钠1.2ml；加入0.02g氯化钠；用氢氧化钠调节pH为7.95，然后加入柠檬酸调节pH值为6.2，终体积为40ml。室温静置6h，然后4℃温度下静置9h得到结晶。取上清液检测样品残余，结果为7.8％。取结晶悬浮液在200倍显微镜下镜检，结果见图6，大部分晶体形状完整，但视野中分布密度较小。实施例7制备desB30结晶液，各组分浓度分别为：desB30浓度为5g/L，丙酮浓度为10％(体积百分比)、柠檬酸三钠浓度为0.04M，氯化钠浓度为0.02M，锌离子与desB30的摩尔比为11:1。结晶过程：称取一定量的desB30样品，溶于25mM的盐酸，采用高效液相检测其浓度为15.63mg/ml，精确量取32mldesB30溶液加入锥形瓶中；加入42.0ml水混匀待用；加入丙酮10ml；加入1％氯化锌溶液13.33ml；加入1M柠檬酸三钠4ml；加入0.05g氯化钠；用氨水调节pH为8.0，然后加入柠檬酸调节pH值为6.0，终体积为100ml。室温静置40min，然后低速搅拌4h后，再在4℃温度下静置8h得到结晶。取上清液检测样品残余，结果为2.6％，损失率较小。取结晶悬浮液在200倍显微镜下镜检，结果见图7，晶体形状规则且较完整。实施例8制备desB30结晶液，各组分浓度分别为：desB30浓度为5g/L，丙酮浓度为12％(体积百分比)、柠檬酸三钠浓度为0.02M，氯化钠浓度为0.03M，锌离子与desB30的摩尔比为11:1。结晶过程：称取一定量的desB30样品，溶于30mM的盐酸，采用高效液相检测其浓度为17.33mg/ml，精确量取145mldesB30溶液加入锥形瓶中；加入42ml水混匀待用；加入丙酮60ml；加入1％氯化锌溶液66.65ml；加入1M柠檬酸三钠10ml；加入0.07g氯化钠；用氨水调节pH为8.0，然后加入柠檬酸调节pH值为5.9，终体积为500ml。低速搅拌5h后，在4℃温度下静置9h得到结晶。取上清液检测样品残余，结果为2.2％。取结晶悬浮液在200倍显微镜下镜检，结果见图8，晶体破碎较多，且体积较小。实施例9对实施例1-8制备的desB30晶体再溶解检测其纯度。结晶前后desB30高效液相检测图谱对比见图9。本发明中desB30样品为等电点沉淀离心后收集的样品，desB30的纯度只有80％左右，可见和不可见的杂质较多，结晶难度大。本发明方法使结晶的最终收率达到95％以上，且纯度提高10％，410nm下的OD值从结晶前的0.486降低为0.059，效果非常明显。试验例1柠檬酸三钠浓度对上清中desB30残余比例的影响分析了柠檬酸三钠不同浓度对上清中desB30残余比例的影响，不同处理组desB30结晶的主要参数见表1，其余结晶参数同实施例2。表1desB30结晶的参数从表1可以看出，在其他参数一致的条件下，柠檬酸三钠浓度过高，达到0.1M以上，会导致上清中残余的未结晶的desB30量大幅增加；而柠檬酸三钠浓度过低，在0.01M以下，导致desB30无法结晶。柠檬酸三钠浓度在0.025-0.05M，desB30结晶效果好，上清残余比仅2.8％-3.2％。试验例2锌离子和desB30摩尔比对上清中desB30残余比例的影响分析了锌离子和desB30不同摩尔比对上清中desB30残余比例的影响。不同处理组desB30结晶的主要参数见表2，其余结晶参数同实施例2。表2desB30结晶的参数试验组1234567DesB30浓度(g/L)3333333有机溶剂比例(％)15151515151515锌离子：desB30摩尔比2:17:110:111:115:120:130:1柠檬酸三钠浓度(M)0.050.050.050.050.050.050.05碱调节pH8.08.08.08.08.08.08.0酸调节pH5.935.935.935.935.935.935.93上清残余比(％)15.77.95.83.76.78.614.3从表2可以看出，锌离子和desB30的摩尔比在7-20：1范围内，desB30结晶效果较好，上清中残余的未结晶的desB30低于8.6％；而锌离子和desB30的摩尔比在10-15：1，desB30结晶效果更佳，上清残余比低于6.7％；但锌离子和desB30的摩尔比超出上述范围，导致上清中残余的未结晶的desB30量显著增加。试验例3desB30蛋白浓度对上清中desB30残余比例的影响分析了desB30蛋白浓度的不同对上清中desB30残余比例的影响。不同处理组desB30结晶的主要参数见表3，其余结晶参数同实施例2。表3desB30结晶的参数试验组1234567DesB30浓度(g/L)135891420有机溶剂比例(％)15151515151515锌离子：desB30摩尔比11:111:111:111:111:111:111:1柠檬酸三钠浓度(M)0.050.050.050.050.050.050.05碱调节pH8.08.08.08.08.08.08.0酸调节pH5.955.955.955.955.955.955.95上清残余比(％)3.64.54.75.35.520.5无法结晶从表3可以看出，DesB30蛋白浓度比较低时，在1g/L以下，结晶残余虽然比较低，但是结晶效率也比较低，不适合生产；当蛋白浓度比较高，达14g/L，会导致上清中残余的未结晶的desB30量明显增加；但当蛋白浓度过高，达到20g/L，会导致蛋白沉淀从而无法结晶。因此，DesB30蛋白浓度在3-9g/L，结晶效果好。试验例4有机溶剂比例对上清中desB30残余比例的影响分析了有机溶剂比例的不同对上清中desB30残余比例的影响。不同处理组desB30结晶的主要参数见表4，其余结晶参数同实施例2。表4desB30结晶的参数试验组1234DesB30浓度(g/L)3333有机溶剂比例(％)5101520锌离子：desB30摩尔比11:111:111:111:1柠檬酸三钠浓度(M)0.050.050.050.05碱调节pH8.08.08.08.0酸调节pH5.955.955.955.95上清残余比(％)4.5％2.5％2.6％5.3％从表4可以看出，有机溶剂比例对上清中残余的未结晶的desB30量影响不是很明显，但是对晶体大小影响明显；当有机溶剂比例过高，达到20％，晶体大小会明显变小(图10)。因此，有机溶剂比例在10-15％，desB30结晶效果较好。试验例5酸调节pH终点对上清中desB30残余比例的影响分析了酸调节pH终点的不同对上清中desB30残余比例的影响。不同处理组desB30结晶的主要参数见表5，其余结晶参数同实施例2。表5desB30结晶的参数从表5可以看出，最终酸调节结晶液的pH终点，会对上清中残余的未结晶的desB30比例产生影响，pH超出5.7-6.2，尤其是超出5.8-6.0的范围，desB30损失会明显增加。当前第1页1 2 3