本发明属于微生物发酵技术领域，特别是涉及一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产效率的方法，偏向于改造维生素C二步发酵工艺。
背景技术：
维生素C二步混菌发酵体系，包括两个发酵步骤，称二步发酵法：第一步是在黑醋酸杆菌作用下，将D-山梨醇氧化成L-山梨糖，俗称醇糖转化；此步发酵工艺成熟且转化率高，现已能达98%以上；目前国内外对其相关基因和转化基质的研究已经比较清楚；第二步是将L-山梨糖进一步氧化成2-酮基-L-古龙酸，俗称糖酸转化；第二步是两种菌的混合发酵，L-山梨糖在普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌组成的混合菌系作用下，被生物氧化成2-酮基-L-古龙酸，生酮基古龙酸菌是产酸菌俗称小菌，巨大芽孢杆菌是伴生菌俗称大菌，混合发酵时伴生菌先行生长，代谢释放出具有生物活性的蛋白，随之作用于产酸菌，启动其生长、产酸。即产酸菌的生长和产酸能力很大程度上受伴生菌生长代谢的制约，因此通过改进原有生产工艺、改善大菌生长环境、调节大菌生理状态，促进混菌代谢，对于提高2-KLG发酵生产效率、提高产能、降低生产成本具有决定性的作用。
技术实现要素：
本发明是针对现有维生素C生产过程中，第二步发酵生产效率低下的问题，提供中一种通过提高L-山梨糖转化成2-酮基-L-古龙酸的生产效率，进而提高提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产效率的方法。
通常来说，接种方式作为工业发酵过程中的一项重要因素，它关系到延滞期的持续、对数期的生长速率、生物质的积累以及终产物的产率等方面。
基于此，建立本发明的技术方案，具体为：
一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产效率的方法，其特征是：在以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌组成的混合菌系发酵生产2-酮基-L-古龙酸的发酵过程中，将培养至对数生长期的中、后期种子液接种至发酵罐优化培养基中进行发酵培养；同时，自发酵0h开始流加山梨糖，并在发酵对数生长前期流加补入小料培养基；
所述发酵罐优化培养基组成为：尿素0.05～0.10、玉米浆 0.5～1.0、磷酸二氢钾0.02～0.05、硫酸镁0.01、 碳酸钙0.05、pH 6.7～7.4，以重量百分比计；
所述小料培养基组成为：山梨糖5.0、尿素0.1～0.2 、玉米浆2.0～5.0、磷酸二氢钾0.02～0.05、碳酸钙0.05、pH 6.7～7.4，以重量百分比计。
所述中对数生长中、后期的种子液是指将种子液培养至对数生长期20±5h，古龙酸含量≥5mg/ml时接种至发酵罐优化培养基中，此时可获得生命力旺盛的菌体，同时还可确保获得较高的菌体浓度，有利于发酵过程中菌体生长延迟期的缩短。
发酵过程中，控制山梨糖浓度12～35mg/ml，放罐残糖低于0.6mg/ml，在放罐前4～8h结束山梨糖的流加。
发酵过程中，小料培养基的流加总量是接种后发酵液体积的10～20%，并且在10h~15h内结束流加。
发酵过程中，流加20～25%无菌碳酸钠溶液调节发酵液pH值在6.7～7.4之间。
所述小料培养基中的山梨糖与其它原料分开灭菌，冷却至40℃以下混合，控制小料培养基中初始山梨糖浓度为25～40mg/ml。
本发明是在普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌组成的混合菌系生产2-酮基-L-古龙酸过程中优化发酵培养基，其目的在于：通过降低发酵基础料浓度来降低菌体生长环境的渗透压；解除高浓度底物对菌体生长的抑制性，使得菌体在适宜的环境中迅速增长，缩短发酵前期所需时间；克服因基质浓度高造成细胞大量生长、耗氧过多，以致通风（搅拌）设备不能匹配的状况，来改善混菌生长代谢环境。具体来说就是将培养至对数生长中、后期的种子液移入优化发酵培养基中，自0h起开始流加补山梨糖，并在发酵对数生长前期以流加的方式补入小料于10-15h内结束流加，以刺激大菌生长，缩短其延滞期、延长其平衡期，为小菌的生长繁殖以及产酸提供更优的环境保障。通过本发明可提升2-酮基-L-古龙酸生产强度、提高效率、优化产能。通过本发明的方法，可使发酵液中2-酮基-L-古龙酸含量达115.6～150.3mg/ml，产酸速率2.89～3.76g.(L.h)-1，糖酸转化率为87.2～95％。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述对照例和实施例中菌种为普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌组成的混合菌系。
对照例：
1菌种制备：将按常规方法取菌种一支，按一定接种量接入摇瓶种子培养基中，180～220rpm、29±1℃恒温振荡培养20±4h，至古龙酸含量≥5mg/ml，按此活化三代后得到三代种液，将三代种液按2～10%的接种量接种于灭菌好的种子培养基中。
2种液制备：
2.1种子罐培养基配方(%)：L-山梨糖1.5、葡萄糖0.2、硫酸镁0.02、 酵母膏0.5、 尿素0.4、玉米浆0.3、碳酸钙0.4、磷酸二氢钾0.5、pH 6.7～7.4。
2.2种子罐培养条件：培养温度28～30℃，通气比1：1.0～1.5v/v/min并搅拌，培养过程中控制溶氧30～50%，培养至对数生长期20±5hr，古龙酸含量≥5mg/ml。
3发酵：
3.1发酵罐培养基配方(%)：山梨糖8.0、尿素0.1 、玉米浆 2.0、磷酸二氢钾0.05、硫酸镁0.01、 碳酸钙0.05、pH 6.7～7.4。
3.2发酵罐培养基灭菌方式：山梨糖与其它原料分开灭菌，待冷却至40℃以下混合，并使发酵培养基初始山梨糖浓度为20～40mg/ml。
3.3发酵罐接种方式：待种液培养至对数生长期20±5hr、古龙酸含量≥5mg/ml、镜检无杂菌时，按20～40%的接种量移入发酵培养基中。
3.4发酵罐培养条件：
培养温度28～31℃，通气量1：0.5～1.2v/v/min，搅拌、补料，发酵过程保证发酵过程溶氧20%以上，培养40hr放罐。
3.5发酵过程补料：浓度在12～35mg/ml，放罐残糖低于0.6mg/ml，依据发酵培养液中L-山梨糖的浓度，在放罐前4～8h流加L-山梨糖结束；发酵过程流加20～25%无菌碳酸钠溶液,调节PH值在6.7～7.4之间。
3.6发酵培养终点：2-酮基-L-古龙酸浓度为111.6g.L-1，发酵周期40h，产酸速率2.79g.(L.h)-1，糖酸转化率为87.8％。
实施例1：
1菌种制备、种液制备步骤同对照例。
2发酵：
2.1发酵罐优化培养基配方(%)：尿素0.05～0.10、玉米浆 0.5～1.0、磷酸二氢钾0.02～0.05、硫酸镁0.01、 碳酸钙0.05、pH 6.7～7.4。
2.2小料培养基配方(%)：山梨糖5.0、尿素0.1～0.2 、玉米浆2.0～5.0、磷酸二氢钾0.02～0.05、碳酸钙0.05、pH 6.7～7.4。
2.3小料培养基灭菌方式：L-山梨糖与其它原料分开灭菌，待冷却至40℃以下混合，并使初始山梨糖浓度为25～40mg/ml。
2.4发酵罐接种方式及培养条件：同对照例。
2.5发酵过程补料：发酵0h起流加山梨糖，并流加补小料于10h内结束，小料补入总量为接后体积的10～20%；发酵过程山梨糖浓度控制在12～35mg/ml，放罐残糖低于0.6mg/ml，依据发酵培养液中L-山梨糖的浓度，在放罐前4～8h流加L-山梨糖结束；发酵过程流加20～25%无菌碳酸钠溶液调节pH值在6.7～7.4之间。
2.6发酵终点：2-酮基-L-古龙酸浓度为126.81g.L-1，发酵周期40h，产酸速率3.17g.(L.h)-1，糖酸转化率为89.4％。
实施例2：
1菌种制备、种液制备步骤同对照例。
2发酵：
2.1发酵罐优化培养基配方(%)、小料培养基配方(%)及灭菌方式：同实施例1.
2.2发酵罐接种方式及培养条件：同对照例。
2.3发酵过程补料：发酵0h起流加山梨糖，并流加补小料于12h内流加结束，小料补入总量为接后体积的10～20%；发酵过程山梨糖浓度控制在12～35mg/ml，放罐残糖低于0.6mg/ml，依据发酵培养液中L-山梨糖的浓度，在放罐前4～8h流加L-山梨糖结束；发酵过程流加20-25%无菌碳酸钠溶液调节pH值在6.7～7.4之间。
2.4发酵终点：2-酮基-L-古龙酸浓度为133g.L-1，发酵周期40h，产酸速率3.33g.(L.h)-1，糖酸转化率为91.8％。
实施例3：
1菌种制备、种液制备步骤同对照例。
2发酵：
2.1发酵罐优化培养基配方(%)、小料培养基配方(%)及灭菌方式：同实施例1.
2.2发酵罐接种方式及培养条件：同对照例。
2.3发酵过程补料：发酵0h起流加山梨糖，并流加补小料于15h内流加结束，小料补入总量为接后体积的10～20%；发酵过程山梨糖浓度控制在12～35mg/ml，放罐残糖低于0.6mg/ml，依据发酵培养液中L-山梨糖的浓度，在放罐前4～8h流加L-山梨糖结束；发酵过程流加20～25%无菌碳酸钠溶液调节pH值在6.7～7.4之间。
2.4发酵终点：2-酮基-L-古龙酸浓度为150.3g.L-1，发酵周期40h，产酸速率3.76g.(L.h)-1，糖酸转化率为95.0％。
实施例4：
1菌种制备、种液制备步骤同对照例。
2发酵：
2.1发酵罐优化培养基配方(%)、小料培养基配方(%)及灭菌方式：同实施例1.
2.2发酵罐接种方式及培养条件：同对照例。
2.3发酵过程补料：发酵0h起流加山梨糖，并流加补小料于20h内流加结束，小料补入总量为接后体积的10～20%；发酵过程山梨糖浓度控制在12～35mg/ml，放罐残糖低于0.6mg/ml，依据发酵培养液中L-山梨糖的浓度，在放罐前4～8h流加L-山梨糖结束；发酵过程流加20～25%无菌碳酸钠溶液调节pH值在6.7～7.4之间。
2.4发酵终点：2-酮基-L-古龙酸浓度为115.6g.L-1，发酵周期40h，产酸速率2.89g.(L.h)-1，糖酸转化率为87.2％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明可以提供一种构思方式，对不同菌属的伴生菌也可以在本构思的前提下做出相应的调整，这些调整也应视为本发明的保护范围。