一种具有生物活化作用的复合添加剂及其制备方法和用途与流程

本发明涉及干细胞培养领域与医药领域，特别是涉及一种具有生物活化作用的复合添加剂，其可用于细胞培养、皮肤修复与美容等。

背景技术：

间充质干细胞(MSCs)普遍存在于人体多种组织和器官中，并具有多向分化潜能，具有刺激组织再生、调节免疫等功能，在细胞治疗领域有着广阔的应用前景。

MSCs分泌的活性蛋白在体内外具有免疫调节活性，体内抑制移植物排斥反应，延长移植物存活时间。已发现MSCs分泌的活性蛋白在改善修复靶器官组织功能、抗炎、抗凋亡、免疫调节等发面发挥了重要作用；还有报道称MSCs分泌的活性蛋白具有美容养颜以及抗衰、减龄等功效。

技术实现要素：

基于对干细胞分泌蛋白的研究，本发明提供了一种可用于干细胞培养、皮肤修复、皮肤美容的复合添加剂。

因此，本发明的目的是提供一种具有生物活化作用的复合添加剂，其包含水、蛋白以及各种因子，可以添加到培养基中用于细胞培养，同时它还能直接使用或添加到皮肤修复或美容产品中来达到一定的皮肤修复与美容功效。

本发明的技术方案如下。

一方面，本发明提供了一种具有生物活化作用的复合添加剂，其包含水或磷酸盐缓冲液；以及溶解于其的以下成分：

人血白蛋白(Human Serum albumin)；

皮离蛋白(Dermcidin)；

载脂蛋白A(Apolipoprotein A)；

触珠蛋白(Haptoglobin)；

β-球蛋白(Beta-globin)；

膜联蛋白A1(Annexin A1)

甲状腺素运载蛋白(Transthyretin)；

转凝蛋白(Transgelin)；

血小板因子4(Human Platelet factor 4)；

人类血小板碱性蛋白(Human Platelet basic protein)；

血小板衍生因子-AB(PDGF-AB)；

血小板衍生因子-BB(PDGF-BB)；

胰岛素样生长因子-1(IGF-1)；

表皮细胞生长因子(EGF)；

血管内皮生长因子(VEGF)；

成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)。

优选地，所述复合添加剂包含水或0.005-0.01M磷酸盐缓冲液；以及溶解于其的以下成分：

人血白蛋白(Human Serum albumin) 500-1000ug/mL；

皮离蛋白(Dermcidin) 100-200ug/mL；

载脂蛋白A(Apolipoprotein A) 100-200ug/mL；

触珠蛋白(Haptoglobin) 200-500ug/mL；

β-球蛋白(Beta-globin) 200-500ug/mL；

膜联蛋白A1(Annexin A1) 100-200ug/mL；

甲状腺素运载蛋白(Transthyretin) 200-500ug/mL；

转凝蛋白(Transgelin) 20-200ug/mL；

血小板因子4(Human Platelet factor 4) 200-500ug/mL；

人类血小板碱性蛋白(Human Platelet basic protein) 50-200ug/mL；

血小板衍生因子-AB(PDGF-AB) 20-50ng/ml；

血小板衍生因子-BB(PDGF-BB) 20-50ng/ml；

胰岛素样生长因子-1(IGF-1) 10-20ng/ml；

表皮细胞生长因子(EGF) 200-500pg/ml；

血管内皮生长因子(VEGF) 100-200pg/ml；

成纤维细胞生长因子-2(FGF-2) 100-500ng/ml。

更优选地，所述复合添加剂包含水或0.0067M磷酸盐缓冲液；以及溶解于其的以下成分：

人血白蛋白(Human Serum albumin) 750ug/mL；

皮离蛋白(Dermcidin) 150ug/mL；

载脂蛋白A(Apolipoprotein A) 150ug/mL；

触珠蛋白(Haptoglobin) 250ug/mL；

β-球蛋白(Beta-globin) 250ug/mL；

膜联蛋白A1(Annexin A1) 150ug/mL；

甲状腺素运载蛋白(Transthyretin) 300ug/mL；

转凝蛋白(Transgelin) 100ug/mL；

血小板因子4(Human Platelet factor 4) 500ug/mL；

人类血小板碱性蛋白(Human Platelet basic protein) 100ug/mL；

血小板衍生因子-AB(PDGF-AB) 20ng/ml；

血小板衍生因子-BB(PDGF-BB) 20ng/ml；

胰岛素样生长因子-1(IGF-1) 10ng/ml；

表皮细胞生长因子(EGF) 200pg/ml；

血管内皮生长因子(VEGF) 200pg/ml；

成纤维细胞生长因子-2(FGF-2) 200ng/ml。

又一方面，本发明提供所述复合添加剂的制备方法。

其中，所述制备方法包括将所述成分溶解于水或磷酸盐缓冲液中。各成分均为常规可采购产品，可配制获得。

本发明提供的复合添加剂可以加入细胞培养基中。

因此，在另一方面，本发明还提供包含所述复合添加剂的细胞培养基。

根据本发明的具体实施方式，所述细胞培养基包含：0.1体积份的β-巯基乙醇，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)，94体积份的a-MEM/DMEM-F12和5体积份的复合添加剂。

本发明的复合添加剂或包含其的细胞培养基可以用于干细胞体外长期扩增培养，所述干细胞特别是从新生儿脐带中分离得到的脐带间充质干细胞。

因此，又一方面，本发明还提供复合添加剂或包含其的细胞培养基用于制备干细胞培养介质的用途。

其中，所述干细胞从哺乳动物、例如人的组织或器官中分离得到，所述组织或器官为骨髓、脐带和脂肪中的一种或多种；优选地，所述干细胞为哺乳动物来源的脐带间充质干细胞，更优选为人来源的脐带间充质干细胞；进一步优选地，所述干细胞是从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。

本发明提供的复合添加剂还可以加入皮肤美容组合物中。

因此，在另一方面，本发明还提供包含所述复合添加剂的皮肤美容组合物。

本发明提供的复合添加剂或包含其的皮肤美容组合物可促进皮肤吸收和循环，特别是添加到化妆水乳中时，更加利于融合和吸收，从而起到一定的美容功效。复合添加剂或包含其的皮肤美容组合物的使用方法为加入化妆品基质中使用，考虑复合添加剂的溶解性推荐使用甘油、乳液等水溶性基质。

因此，又一方面，本发明还提供复合添加剂或包含其的皮肤美容组合物用于制备皮肤美容产品的用途。

本发明提供的复合添加剂还可以加入皮肤修复组合物中。

因此，在另一方面，本发明还提供包含所述复合添加剂的皮肤修复组合物。

本发明提供的复合添加剂或包含其的皮肤修复组合物不仅可以对蚊虫叮咬处进行止痒、止痛、杀菌、消毒，而且可以对蚊虫叮咬处的皮肤进行修复，避免抓挠引起的激发感染。

因此，又一方面，本发明还提供复合添加剂或包含其的皮肤修复组合物用于制备皮肤修复产品的用途。

具体而言，本发明提供的复合添加剂，不仅具有安全、无毒等特性，还具有显著的生物活化作用。例如，本发明的添加剂在加入细胞培养基中用于培养干细胞时，不仅干细胞能正常增殖，还能维持干细胞的稳定性和多能性。另外，由于其显著的生物活化作用，该复合添加剂本身可以作为皮肤美容产品或修复产品使用：作为皮肤美容产品使用时，不仅不会出现过敏现象，还能具有抗皱抗衰老功效，同时使皮肤晶莹剔透；作为皮肤修复产品使用时，还能发挥止痒、止痛、杀菌、消毒、修复、防止感染等作用。基于其特殊作用，该复合添加剂不仅可以单独使用，还可加入化妆品或皮肤修复产品中作为添加剂使用，所得到的产品在体外渗透性能良好，可以透过皮肤发挥作用，同样具有上述美容或修复功能。因此，本发明提供的复合添加剂具有非常广泛的应用。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是使用本发明复合添加剂配制的无血清培养基培养脐带间充质干细胞的图片，其中图1A为接种2小时后的细胞形态，图1B为接种24小时后的细胞形态，图1C为接种48小时后的细胞形态。

图2是使用本发明复合添加剂配制的乳膏剂随时间的渗透曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

未注明具体条件的，按照本发明所属领域的常规条件或仪器试剂供应商的建议条件进行；未注明商购来源的，为可以市售购得的常规产品。

实施例1复合添加剂的制备及干细胞培养

复合添加剂的制备：

将准确称量或液体计量的75mg人血白蛋白(Human Serum albumin)、15mg皮离蛋白(Dermcidin)、15mg载脂蛋白A(Apolipoprotein A)、25mg触珠蛋白(Haptoglobin)、25mgβ-球蛋白(Beta-globin)、15mg膜联蛋白A1(Annexin A1)、30mg甲状腺素运载蛋白(Transthyretin)、10mg转凝蛋白(Transgelin)、50mg血小板因子4(Human Platelet factor)、10mg人类血小板碱性蛋白(Platelet basic protein)、2ug血小板衍生因子-AB(PDGF-AB)、2ug血小板衍生因子-BB(PDGF-BB)、1ug胰岛素样生长因子(IGF-1)，20ug成纤维细胞生长因子(FGF-2)、20ng表皮细胞生长因子(EGF)和20ng血管内皮生长因子(VEGF)，添加至75ml无菌水中，定容至100ml，置于4℃备用。

无血清培养基的制备：

配方：0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)、94体积份的a-MEM/DMEM-F12和5体积份的复合添加剂。

取β-巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、和a-MEM/DMEM-F12配制预混液，将复合添加剂与预混液混合。

细胞培养：

在生物安全柜内，取分离于自然分娩新生儿脐带华通式胶组织的第3代的人脐带血间充质干细胞(hUC-MSCs)，以2×10⁴个细胞/cm²密度接种于T175细胞培养瓶，加15mL无血清培养基，移入CO₂浓度为5％的37℃恒温培养箱中。接种2小时后观察细胞已贴壁，继续培养，约4小时后细胞即完全贴壁；在接种24小时后观察细胞，hUC-MSCs呈梭形旋涡状聚集，伸展度高，细胞明亮，汇合度达40-60％；接种48小时后观察细胞，hUC-MSC细胞明亮，达90％以上汇合，胰酶消化收集细胞冻存。结果参见图1。

实施例2含复合添加剂的乳膏剂的制备和效果

复合添加剂的制备：同实施例1。

复合添加剂乳膏的制备：

配方：硬脂酸20g，液状石蜡10g，甘油10g，三乙醇胺2g，羟苯乙酯0.1g，月桂氮卓酮3g，复合添加剂10ml，蒸馏水适量，总处方量为100g。其中甘油、三乙醇胺、复合添加剂、蒸馏水为水相，其余均是油相。

取培养复合添加剂、硬脂酸、甘油、液状石蜡、羟苯乙酯、月桂氮卓酮一起加入烧杯中，100℃水浴，搅拌，待其完全溶解后加入三乙醇胺，搅拌至其冷凝得白色乳膏。

稳定性实验：

1.离心实验

取上述培养上清浓缩液乳膏10g。装于带刻度的离心管中，以2500r/min离心30min。

2.耐热实验

取上述培养上清浓缩液乳膏10g，装于密闭待刻度的离心管中，置于55℃恒温水浴箱中恒温6小时。

3.耐寒实验

取上述培养上清浓缩液乳膏10g，装于密闭待刻度的离心管中，置于-20℃的冰箱中放置24小时。

4.体外释药实验

将SD大鼠处死，除去腹毛，钝性分离腹部皮肤，机械去除皮下脂肪后，用生理盐水洗净，-20℃保存备用。临用前解冻，并用生理盐水清洗干净。

本实验的实验装置采用的是改良的Franz扩散池，上池为一内径为1.6cm的试管作为释放池，下室为一带塞锥形瓶做接收池，将100ml生理盐水加入接收池中，将鼠皮固定在供给池的下端，角质层面向上，在角质层上分别均匀涂抹含培养上清浓缩液的乳膏，供给池内装入10ml生理盐水，封口后将供给池固定在接收池上，接收池内置搅拌子，真皮一侧与接收液完全接触，不能有气泡，最后将整个系统放置于加热磁力搅拌器上，37℃、300r/min搅拌，此装置的有效扩散面积为2.0cm²。在3、4、5、6、7、8、9、10小时分别将接收池内液体全部排出，重新加入空白接收液。将每个时间点所得的接收液用0.45μm的滤膜滤过，代入标准曲线，计算出接收液中扩散出的蛋白量，与总蛋白量相比求出累积扩散百分率。

在药物的体外渗透实验中，普遍认为药物通过皮肤的过程是一个被动扩散的过程，因此常用Fick扩散定律来描述这个扩散过程。把皮肤看做均质膜，药物经过皮肤扩散达到稳态时，其稳态渗透速率的表达公式为：

J_S＝(dQt/S)/dt＝P_S(C_d-C_i)/s

式中，J_S：药物渗透速率，ug·cm^-2·h^-1

S：有效渗透面积(cm²)

T：时间(h)

P_S：渗透系数；

C_d：给药池中药物的浓度(ug)

在本实验中，给药池中的药物浓度远大于接收池中的药物浓度，因此将上式改写为：

J_S＝(dQ/S)/dt＝P_sC_d

以每次取样的时间为横坐标，累积渗透率为纵坐标，绘制取样时间-累积渗透率曲线。

结果：

该乳膏剂白色、细腻、均匀，基质为W/O性的，利用硬脂酸与三乙醇胺的乳化反应，可以将复合添加剂中的细胞因子和蛋白完全溶解在基质中。并且，所得乳膏性质稳定，在离心、耐热、耐寒实验中均未出现分层，但考虑到复合添加剂中的活性成分多为蛋白质，容易被高温破坏，因此不建议在高热条件下储存。发现含复合添加剂的乳膏剂在体外渗透性能较好，可以透过皮肤发挥作用，结果如图2。

实施例3本发明的复合添加剂对蚊虫叮咬的治疗效果观察

1.试验材料：实施例1中的复合添加剂。

2.叮咬诊断标准：所有病例

(1)均有蚊子或其他昆虫叮咬；

(2)叮咬后局部剧烈瘙痒。

3.疗效标准：

治愈：全身及局部症状消失，皮肤红肿、热、痛、痒消退。

有效：全身和局部症状减轻，肿胀消退。

无效：全身和局部病症未控制，甚至加重。

4.试验方法：

选取蚊虫叮咬患者50例，无年龄、性别限制，蚊虫叮咬皮肤后，将该复合添加剂均匀涂抹于红肿处，用量根据肿块大小调节，每天两次，观察治疗效果。

5.治疗效果(以疗效示出)：

观察发现，治愈23例，有效25例，无效2例，总有效率96％。

实施例4本发明的复合添加剂对皮肤美容与修复的效果观察

1.试验材料：实施例1中的复合添加剂。

2.疗效判断标准(0-10分)：

效果不明显：0-3分。

效果一般：4-6分。

效果显著：7-10分。

3.试验方法：

选取受试者60例，无年龄、性别限制，随机分为实验组和安慰剂组，实验组：受试者每天早晚洁面后涂抹本发明的产品，连续使用30天。安慰剂组：受试者每天早晚洁面后涂抹纯水，连续使用30天。

4.治疗效果(以效果得分示出)：

实验组：8.0±0.8。

安慰剂组：2.6±0.9。

结果表明，受试者评价该复合添加剂美容效果显著。

5.具体例：受试者，曹某，女，50岁，受试前，眼角鱼尾纹深，眼袋大，黑眼圈明显，试用本发明的复合添加剂后鱼尾纹变浅，眼袋变小，黑眼圈淡化。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。