一种高生长性多功能干细胞培养基的制作方法

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种高生长性多功能干细胞培养基。

背景技术：

在多功能干细胞的培养基研制领域，Stemcell公司的TeSR-E8培养基和Life公司的E8培养基是较为成熟多功能干细胞培养基。

TeSR-E8培养基主要存在的缺点包括但不限于：（1）TeSR-E8培养基中添加有促进重编程的小分子化合物或者β-巯基乙醇，其会造成明显的细胞毒性，限制了多功能干细胞的低密度培养；（2）TeSR-E8培养基中的细胞因子含量较高，导致该培养基的成本很高。

因此，开发可以促进多功能干细胞培养且所用添加物较少的培养基是本领域的研发方向之一。然而，现有的研究还未获得效果良好的成果。目前仅知柠檬酸铁可一定程度上替换TeSR-E8培养基中的人脱铁转铁蛋白。

在促进干细胞的培养方面，通常的方法是控制环境因素（如氧含量、培养空间）和添加一些功能因子（如EGF等）。《Enhancement of human neural stem cell self-renewal in 3D hypoxic culture》通过控制培养空间的维度、氧含量和添加一定浓度的EGF和FGF-2促进了 hNSCs的增值和分化。通过添加适量的活性氧可以起到促进干细胞功能的维持，在这一基础上，《活性氧对诱导多功能干细胞（iPS）的作用及功能研究》进行了比较深入研究。《Substance P enhances proliferation and paracrine potential of adipose-derived stem cells in vitro 》研究了Substance P对于ADSCs的体外培养的影响。

另外，目前较为急迫的是关于无动物制品的培养基的研发。在这方面，CN 103952374 B提供了一种很好的思路，并得到了不错的效果。不过，其缺点是添加组分过多，成本较高，产业化前景较差。

在无血清干细胞培养基方面，丙酮酸钠的添加是比较重要的，如申请号为201310134502.9的中国专利《一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基》和申请号为201410018678.2的中国专利《培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基》中均添加了丙酮酸钠。

申请号为201610570585.X的中国专利利用了四甲烯二胺作为活性因子之一，并配合其它添加成分制备出了一种可以促进干细胞增值速度的培养基。该物质在申请号为申请号为201210564154.4的中国专利中同样被采用，可用于培养和扩增间充质干细胞。

在一些已知的干细胞无血清培养基中，尼克酰胺也被作为添加剂之一。如申请号为201611087240 .5的中国专利利用了尼克酰胺作为添加剂。不过该专利需加入Ultroser G血淸替代物才能实现培养基的无血清化，成本较高。

综上所述，本领域亟需一种可以促进多功能干细胞增值的无血清培养基。

技术实现要素：

本发明的目的旨在解决本领域技术问题的一种高生长性多功能干细胞培养基，其成分为：

DMEM/F12培养基;

0.5~0.9 mg/L尼克酰胺、22~25 mg/L FGF-2、 0.001~0.003 mg/L硒酸钠、0.2~0.3 mg/L碳酸氢钠、350~400 μg/L 柠檬酸铁、200~300 μg/L IL-6 和 50~60 μg/L 四甲烯二胺；

上述组分的浓度均以添加至DMEM/F12培养基中的浓度计。

优选的，所述柠檬酸铁的浓度为360~380 μg/L 。

优选的，所述尼克酰胺的浓度为0.6~0.8 mg/L。

优选的，所述FGF-2的浓度为23 mg/L。

优选的，所述硒酸钠的浓度为0.002 mg/L。

优选的，所述IL-6的浓度为260 μg/L。

所述培养基在使用前配置，于0-8℃下保存。

本发明发现，利用四甲烯二胺和硒酸钠可以替换现有技术报道的丙酮酸钠，在不影响多功能性的同时，可以使得多功能干细胞更快的增殖。

成纤维细胞生长因子常用作细胞培养基的添加成分，无论是在多功能性干细胞和其它干细胞的已公布培养基中，均被当做主要的添加物之一（如中国专利201611087240 .5和中国专利201610508983 .9）。

在本发明中，发明人发现利用如述添加量的成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）和白介素-6（IL-6），再辅以如述添加量的四甲烯二胺、硒酸钠和尼克酰胺，便可以实现较好的多功能干细胞的增值效果。在此基础上，添加如述添加量的柠檬酸铁，可以起到替换TeSR-E8中的人脱铁转铁蛋白的效果，避免了向培养基中加入人脱铁转铁蛋白或者重组人乳铁蛋白。

如本发明的一个对比实施例所示，当缺少四甲烯二胺时，细胞在培养84小时后，生长速率出现大幅下降，过早的进入生长平台期。

另外，将硒酸钠替换为丙酮酸钠后，细胞的增值速度出现较大幅度的下降。

值得说明的是，本发明的培养基对于多功能干细胞的培养效果较好，但对于其他干细胞的培养效果却没有那么优异。

产生上述情况的部分原因可能在于不同的干细胞中，影响其增值和一些重要功能的因子不同。

目前，随着基因编辑技术的兴起（相关报道如《The concerted action of type 2 and type 3 deiodinases regulates the cell cycle and survival of basal cell carcinoma cells》和《ERK Kinases Phosphorylate Lin28a to Modulate P19 Cell Proliferation and Differentiation》），对于不同细胞的增值和生物学功能的控制因素将被不断的被发现，可以为日后不同干细胞的培养基的研究提供更为坚实的理论基础。

附图说明

图1为本发明培养基对多功能干细胞培养的细胞增殖曲线图；

图2为对比组1培养基对多功能干细胞培养的细胞增殖曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步对本发明进行说明，值得一提的时，下述实施例仅仅起到示例作用，并非旨在对本发明有所限定，本领域的技术人员应该理解，凡是符合本发明精神的技术方案均属于本发明的保护范围。

实施例1

DMEM/F12培养基;

0.5 mg/L尼克酰胺、22 mg/L FGF-2、 0.002 mg/L硒酸钠、0.2 mg/L碳酸氢钠、400 μg/L 柠檬酸铁、300 μg/L IL-6 和 50 μg/L 四甲烯二胺；

上述组分的浓度均以添加至DMEM/F12培养基中的浓度计。

实施例2

DMEM/F12培养基;

0.9 mg/L尼克酰胺、25 mg/L FGF-2、 0.001~0.003 mg/L硒酸钠、0.3 mg/L碳酸氢钠、400 μg/L 柠檬酸铁、200 μg/L IL-6 和 60 μg/L 四甲烯二胺；

上述组分的浓度均以添加至DMEM/F12培养基中的浓度计。

实施例3

DMEM/F12培养基;

0.6 mg/L尼克酰胺、23 mg/L FGF-2、 0.002 mg/L硒酸钠、0.2~0.3 mg/L碳酸氢钠、360 μg/L 柠檬酸铁、260 μg/L IL-6 和 55 μg/L 四甲烯二胺；

上述组分的浓度均以添加至DMEM/F12培养基中的浓度计。

对比实施例1

除不添加四甲烯二胺之外，其余与实施例3一致。

对比实施例2

仅将硒酸钠替换为丙酮酸钠之外，其余与实施例3一致。

应用实施例1

对复苏人的IPS细胞系HIPS，接种至Matrigel培养皿里，加入配置好的实施例3的培养基，每天进行换液培养，培养条件为：温度为37℃，5%的CO₂氛围。当多功能干细胞汇合度到70%时，进行消化处理，进行传代培养，连续培养40代。绘制增值曲线，如图1所示。

以同样的处理方式处理对比实施例2，作为对比组1。绘制增值曲线，如图2所示。

以同样的处理方式处理对比实施例1，作为对比组2。发现在第3天时，细胞个数为80万个/每孔左右，在第3.5天后，细胞的生长速率出现大幅下降，至第4天后，基本不生长，细胞个数为180万个/每孔左右。

由图1可知，本发明相对于商业培养基而言，具有显著高的生长效率，所得培养基更加的适于多功能干细胞的培养。

由图2和对比组的培养情况可知，本发明的添加物的选择对于多功能干细胞的增值具有显著的影响。

应用实施例2

利用实施例3的培养基培养充质干细胞，与含有胎牛血清的常规培养基相比，所得细胞数未能达到其60%。