本发明涉及生物发酵技术领域，尤其涉及一种发酵生产L-丙氨酸的方法。
背景技术：
L-丙氨酸，学名L-氨基丙酸(L-alanine；L-lactamine)，分子式CH3CH(NH2)COOH，分子量89.04，外观为无色至白色结晶，无毒无臭，溶于水(16.72g/100mL)，微溶于乙醇，不溶于乙醚和丙酮，密度1.401，理化性质稳定。具有特殊的甜味，甜度为甘氨酸的1.6倍，是一种最甜的氨基酸。当温度高于200℃时，可升华；达到264～295℃时可分解。
L-丙氨酸在食品、医药和化工领域均具有广泛的应用，并有日益增长的趋势。它的技术开发较晚，80年代初才在日本工业化生产。我国在80年代末有小批量生产，由于应用开发的滞后，产品内销不畅，工业化生产举步维艰。L-丙氨酸制备经历了由蛋白水解提取法、酶法到发酵法的过程。提取法由于原料来源的限制和成本的居高不下，无法大规模生产；酶法转化分为固定化细胞法和游离细胞法，生产工艺较为复杂；发酵法生产工艺简单，发酵液中杂质含量相对较少，有利于减少分离提取的成本和废水的用量。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种发酵生产L-丙氨酸的方法，技术方案如下：
一种发酵生产L-丙氨酸的方法，在发酵过程中采用向发酵培养基流加补糖的方式进行L-丙氨酸的发酵生产。
进一步地，流加补糖的糖液中含有葡萄糖、甘油及谷氨酸/谷氨酸钠。
作为优选，所述糖液中葡萄糖的质量浓度为60～80％，甘油的质量浓度为葡萄糖质量浓度的0.5～1.5％，谷氨酸/谷氨酸钠的浓度为5～10mM。
更为优选，所述糖液中葡萄糖的质量浓度65％，甘油的质量浓度为葡萄糖质量浓度的1％，谷氨酸/谷氨酸钠的浓度为5～10mM。
进一步地，所述发酵培养基的成分包括(质量百分比)：葡萄糖6～8％，牛骨蛋白胨0.1％，Na2HPO4·H2O 1％，KH2PO4 0.1％，NH4Cl 0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％。
更为具体地，发酵过程采用好氧及限氧两阶段发酵：
(1)好氧阶段：
将丙氨酸生产菌接种至发酵培养基中培养；50L发酵罐发酵条件为通风比1:0.6vvm，转速300rpm，温度35℃；
(2)限氧阶段：
当菌体OD600达到2.5～3.5时开始补糖，当丙氨酸产率小于0.02g·L-1·h-1时停止补糖，当葡萄糖质量浓度在小于0.1％时放罐；当菌体OD600达到4～6时，停止通风进气，并将转速降至200rpm，直至发酵结束。
进一步地，根据发酵培养基中的葡萄糖浓度来控制补糖流加速率。补糖后的前5～8h，通过补糖控制发酵培养基中葡萄糖质量浓度在0.4～0.6％，8h之后通过补糖控制发酵培养基中葡萄糖质量浓度在0.2～0.4％。
作为优选，所述丙氨酸生产菌接种至发酵培养基的接种量为10％。经试验发现，该接种量能够更好的利用发酵培养基，有利于L-丙氨酸的发酵生产。
本发明的有益效果在于：
本发明优选了特定的培养基，并在发酵过程中采用流加补糖的方式进行L-丙氨酸的发酵生产，有效的提高L-丙氨酸的产量，发酵水平达到135g/L，并有效缩短了L-丙氨酸的发酵周期。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
在下面所述实施例中，葡萄糖浓度采用SBA-40E葡萄糖生物传感仪(山东省科学院生物研究所)进行测定；L-丙氨酸含量的检测方法参照中国专利公开号CN102329765A公开的方法；菌体密度采用分光光度法，测定波长600nm处的吸光值(OD600)。以下实施例的发酵规模为50L发酵罐。其他如无特别说明，均采用本领域常用的知识和方法。
所述丙氨酸生产菌为E.coli FYFJ18，中国微生物菌种保藏中心的菌种保藏号为CGMCC No.12636。
实施例1
1、发酵培养基的配制：
所得发酵培养基包括(质量百分比)：葡萄糖6％，牛骨蛋白胨0.1％，Na2HPO4·H2O 1％，KH2PO4 0.1％，NH4Cl 0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％，其余为水。所述发酵培养基的pH自然。
采用50L发酵罐进行补料分批发酵，起始装液量为50％。将上述培养基于121℃灭菌30min后，降温至35℃备用。
2、发酵：
2.1好氧发酵
将丙氨酸生产菌以10％的接种量接种至上述培养基中，于通风比为1:0.6vvm，转速为300rpm，温度35℃的条件中进行培养。采用分光光度法，实时测定波长600nm处的吸光值(OD600)，检测菌体密度。
2.2限氧发酵
在OD600达到3时开始流加补糖，流加补糖的糖液中含有质量浓度为65％的葡萄糖，质量浓度为葡萄糖的1％的甘油，以及5～10mM的谷氨酸钠。
补糖后的前6h，通过补糖控制发酵培养基中葡萄糖质量浓度在0.4～0.6％，之后通过补糖控制发酵培养基中葡萄糖质量浓度在0.2～0.4％。
发酵周期40h，检测发酵液中的L-丙氨酸含量为135g/L。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：将谷氨酸钠替换为谷氨酸，发酵周期40h，检测L-丙氨酸含量为130g/L。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：补糖后的前8h，通过补糖控制发酵培养基中葡萄糖质量浓度在0.4～0.6％，发酵周期42h，检测L-丙氨酸含量为127g/L。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：所得发酵培养基包括(质量百分比)：葡萄糖8％，牛骨蛋白胨0.1％，Na2HPO4·H2O 1％，KH2PO4 0.1％，NH4Cl 0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％。发酵周期40，检测L-丙氨酸含量为125g/L。
对比例1
本实施例与实施例1的区别在于：所得发酵培养基包括(质量百分比)：葡萄糖12％，牛骨蛋白胨0.1％，Na2HPO4·H2O 1％，KH2PO4 0.1％，NH4Cl 0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％。好氧阶段通风比为1:0.6vvm，转速300rpm。当菌体OD600达到5时，停止进气，并将转速降至200rpm，发酵进入限氧阶段。发酵温度35℃，罐压0.05MPa，发酵过程中用氨水控制pH至7.0。发酵周期45h，L-丙氨酸含量为92g/L。
对比例2
本实施例与对比例1的区别在于：在限氧发酵过程中分三次补加质量浓度为65％的葡萄糖，每次补加200mL。发酵周期50h，L-丙氨酸含量为99g/L。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。