本发明涉及生物发酵技术领域,尤其涉及一种发酵生产L-丙氨酸的方法。
背景技术:
L-丙氨酸,学名L-氨基丙酸(L-alanine;L-lactamine),分子式CH3CH(NH2)COOH,分子量89.04,外观为无色至白色结晶,无毒无臭,溶于水(16.72g/100mL),微溶于乙醇,不溶于乙醚和丙酮,密度1.401,理化性质稳定。具有特殊的甜味,甜度为甘氨酸的1.6倍,是一种最甜的氨基酸。当温度高于200℃时,可升华;达到264~295℃时可分解。
L-丙氨酸在食品、医药和化工领域均具有广泛的应用,并有日益增长的趋势。它的技术开发较晚,80年代初才在日本工业化生产。我国在80年代末有小批量生产,由于应用开发的滞后,产品内销不畅,工业化生产举步维艰。L-丙氨酸制备经历了由蛋白水解提取法、酶法到发酵法的过程。提取法由于原料来源的限制和成本的居高不下,无法大规模生产;酶法转化分为固定化细胞法和游离细胞法,生产工艺较为复杂;发酵法生产工艺简单,发酵液中杂质含量相对较少,有利于减少分离提取的成本和废水的用量。
技术实现要素:
本发明的目的是提供一种发酵生产L-丙氨酸的方法,技术方案如下:
一种发酵生产L-丙氨酸的方法,在发酵过程中采用向发酵培养基流加补糖的方式进行L-丙氨酸的发酵生产。
进一步地,流加补糖的糖液中含有葡萄糖、甘油及谷氨酸/谷氨酸钠。
作为优选,所述糖液中葡萄糖的质量浓度为60~80%,甘油的质量浓度为葡萄糖质量浓度的0.5~1.5%,谷氨酸/谷氨酸钠的浓度为5~10mM。
更为优选,所述糖液中葡萄糖的质量浓度65%,甘油的质量浓度为葡萄糖质量浓度的1%,谷氨酸/谷氨酸钠的浓度为5~10mM。
进一步地,所述发酵培养基的成分包括(质量百分比):葡萄糖6~8%,牛骨蛋白胨0.1%,Na2HPO4·H2O 1%,KH2PO4 0.1%,NH4Cl 0.5%,MgSO4·7H2O 0.05%。
更为具体地,发酵过程采用好氧及限氧两阶段发酵:
(1)好氧阶段:
将丙氨酸生产菌接种至发酵培养基中培养;50L发酵罐发酵条件为通风比1:0.6vvm,转速300rpm,温度35℃;
(2)限氧阶段:
当菌体OD600达到2.5~3.5时开始补糖,当丙氨酸产率小于0.02g·L-1·h-1时停止补糖,当葡萄糖质量浓度在小于0.1%时放罐;当菌体OD600达到4~6时,停止通风进气,并将转速降至200rpm,直至发酵结束。
进一步地,根据发酵培养基中的葡萄糖浓度来控制补糖流加速率。补糖后的前5~8h,通过补糖控制发酵培养基中葡萄糖质量浓度在0.4~0.6%,8h之后通过补糖控制发酵培养基中葡萄糖质量浓度在0.2~0.4%。
作为优选,所述丙氨酸生产菌接种至发酵培养基的接种量为10%。经试验发现,该接种量能够更好的利用发酵培养基,有利于L-丙氨酸的发酵生产。
本发明的有益效果在于:
本发明优选了特定的培养基,并在发酵过程中采用流加补糖的方式进行L-丙氨酸的发酵生产,有效的提高L-丙氨酸的产量,发酵水平达到135g/L,并有效缩短了L-丙氨酸的发酵周期。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
在下面所述实施例中,葡萄糖浓度采用SBA-40E葡萄糖生物传感仪(山东省科学院生物研究所)进行测定;L-丙氨酸含量的检测方法参照中国专利公开号CN102329765A公开的方法;菌体密度采用分光光度法,测定波长600nm处的吸光值(OD600)。以下实施例的发酵规模为50L发酵罐。其他如无特别说明,均采用本领域常用的知识和方法。
所述丙氨酸生产菌为E.coli FYFJ18,中国微生物菌种保藏中心的菌种保藏号为CGMCC No.12636。
实施例1
1、发酵培养基的配制:
所得发酵培养基包括(质量百分比):葡萄糖6%,牛骨蛋白胨0.1%,Na2HPO4·H2O 1%,KH2PO4 0.1%,NH4Cl 0.5%,MgSO4·7H2O 0.05%,其余为水。所述发酵培养基的pH自然。
采用50L发酵罐进行补料分批发酵,起始装液量为50%。将上述培养基于121℃灭菌30min后,降温至35℃备用。
2、发酵:
2.1好氧发酵
将丙氨酸生产菌以10%的接种量接种至上述培养基中,于通风比为1:0.6vvm,转速为300rpm,温度35℃的条件中进行培养。采用分光光度法,实时测定波长600nm处的吸光值(OD600),检测菌体密度。
2.2限氧发酵
在OD600达到3时开始流加补糖,流加补糖的糖液中含有质量浓度为65%的葡萄糖,质量浓度为葡萄糖的1%的甘油,以及5~10mM的谷氨酸钠。
补糖后的前6h,通过补糖控制发酵培养基中葡萄糖质量浓度在0.4~0.6%,之后通过补糖控制发酵培养基中葡萄糖质量浓度在0.2~0.4%。
发酵周期40h,检测发酵液中的L-丙氨酸含量为135g/L。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于:将谷氨酸钠替换为谷氨酸,发酵周期40h,检测L-丙氨酸含量为130g/L。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于:补糖后的前8h,通过补糖控制发酵培养基中葡萄糖质量浓度在0.4~0.6%,发酵周期42h,检测L-丙氨酸含量为127g/L。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于:所得发酵培养基包括(质量百分比):葡萄糖8%,牛骨蛋白胨0.1%,Na2HPO4·H2O 1%,KH2PO4 0.1%,NH4Cl 0.5%,MgSO4·7H2O 0.05%。发酵周期40,检测L-丙氨酸含量为125g/L。
对比例1
本实施例与实施例1的区别在于:所得发酵培养基包括(质量百分比):葡萄糖12%,牛骨蛋白胨0.1%,Na2HPO4·H2O 1%,KH2PO4 0.1%,NH4Cl 0.5%,MgSO4·7H2O 0.05%。好氧阶段通风比为1:0.6vvm,转速300rpm。当菌体OD600达到5时,停止进气,并将转速降至200rpm,发酵进入限氧阶段。发酵温度35℃,罐压0.05MPa,发酵过程中用氨水控制pH至7.0。发酵周期45h,L-丙氨酸含量为92g/L。
对比例2
本实施例与对比例1的区别在于:在限氧发酵过程中分三次补加质量浓度为65%的葡萄糖,每次补加200mL。发酵周期50h,L-丙氨酸含量为99g/L。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。