一种水稻粒长基因qGL3的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种水稻粒长基因qGL3的分子标记及其应用。

背景技术：

水稻是我国最主要的粮食作物之一，全国有超过一半的人口以稻米为主食。水稻谷粒形状是水稻的一个重要农艺性状，由谷粒的长、宽、厚等三维尺寸共同决定。在谷粒灌浆良好的情况下，谷粒形状大小决定了谷粒重量的大小进而影响到水稻产量。此外谷粒形状还是衡量稻谷质量的重要指标，国家标准规定优质籼稻的谷粒形状必须达到长宽比2.8以上(GB/T1789-1999,《优质稻谷》)。因此，粒型的改良一直是水稻遗传育种的目标之一。粒长性状由于与水稻产量和品质关系最为密切，尤其受到育种家重视。

水稻粒长是一个受多遗传位点控制的典型数量性状。目前已有超过75个和水稻粒长有关的数量性状位点被定位，其中一些遗传效应较大的位点已被克隆，例如qGL3基因(http://archive.gramene.org/qtl/)。qGL3基因是水稻粒长的负调控基因，属半显性基因，位于第3染色体长臂中部，登录号为LOC_Os03g44500。该基因全长8758核苷酸，编码区长3012核苷酸，由21个外显子和20个内含子组成，为组成型表达，编码一个含有两个Kelch结构域的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。该磷酸酶定位于细胞核与细胞质中，能够通过将底物Cyclin-T1；3去磷酸化参与抑制颖壳细胞分裂从而调控颖壳长度。在N411、WY3、CW23等品种中，qGL3基因编码区第1092位核苷酸由C突变为A，导致qGL3蛋白第二个Kelch结构域内保守的AVLDT模体中的D(天冬氨酸)被E(谷氨酸)所取代。该突变降低了qGL3蛋白的活性，导致颖壳细胞分裂加速，细胞增多，粒长增加。在不同遗传群体中qGL3基因的加性效应变幅范围为1.49mm-2.7mm，可解释粒长表型变异的36.6％-95.6％。测序分析发现突变型qGL3基因在栽培水稻中分布稀少，只存在于极少数长粒种质资源中，提示qGL3在水稻粒长性状改良中具有巨大潜力。(Zhang X，Wang J，Huang J，et al.Rare allele of OsPPKL1 associated with grain length causes extra-large grain and a significant yield increase in rice.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(52)：21534-21539；Qi P，Lin Y S，Song X J，et al.The novel quantitative trait locus GL3.1controls rice grain size and yield by regulating Cyclin-T1；3.Cell Res，2012，22：1666-1680；Hu Z，He H，Zhang S，et al.A Kelch motif-containing serine/threonine protein phosphatase determines the large grain QTL trait in rice.J Integr Plant Biol，2012，54(12)：979-990)

因为粒长是受到多基因控制的数量性状，仅通过测量表型很难对qGL3基因型进行选择，所以开发能鉴定qGL3不同基因型的分子标记并利用分子标记辅助选择成为提高选择效率的重要途径。目前已报道的能用于qGL3基因型筛选的标记大部分为连锁标记，不但使用范围受到标记在不同水稻种质间是否存在多态性的限制，而且对后代基因型鉴定的准确性也存在偏差(Zhang X，Wang J，Huang J，et al.Rare allele of OsPPKL1 associated with grain length causes extra-large grain and a significant yield increase in rice.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(52)：21534-21539)。张等根据qGL3基因编码区第1092位核苷酸C到A的突变设计了一个功能分子标记，能准确鉴定qGL3基因型。但该标记需要使用四条引物进行PCR并使用琼脂糖胶电泳检测PCR产物，这提高了检测成本，增加了PCR假阳性出现的概率，在检测通量上也受到限制(张亚东，周丽慧，郑佳，等。2016，一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法，专利号：CN103882145B；丁丹，张亚东，郑佳.水稻粒长基因GS3和qGL3功能标记的设计及应用.江苏农业学报，2014，30(6)：1191-1197)。因此，开发一种成本更低、检测准确性和通量更高的分子标记用于qGL3基因分型，将极大促进水稻长粒新种质的筛选和突变型qGL3基因在粒型改良中的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种水稻粒长基因qGL3的分子标记。

本发明的第二个目的是提供利用上述分子标记鉴定水稻粒长基因qGL3基因型的方法及其应用。

本发明的第三个目的是提供利用上述分子标记鉴定水稻粒长或同时鉴定水稻粒长基因qGL3基因型和水稻粒长的方法及其应用。

本发明提供的一种水稻粒长基因qGL3的分子标记，其通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。

本发明提供了上述分子标记在鉴定水稻粒长基因qGL3基因型中的应用。

本发明提供了上述分子标记在鉴定水稻粒长中的应用。

本发明提供了上述分子标记在水稻育种中的应用。

本发明提供了用于检测水稻粒长基因qGL3的特异性引物组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。

其中，SEQ ID NO.1所示的正向引物qGL3-F:TCCTCTAGAATGACAATATGCACTCC，SEQ ID NO.2所示的反向引物qGL3-R1:CACCAGACTCCAGCAGCAGTG，和SEQ ID NO.3所示的反向引物qGL3-R2:GTATAGCACCAGACTCCAGCAGATGTT。

本发明上述引物组合是针对qGL3基因编码区第1092位核苷酸C到A的SNP设计、筛选后获得。qGL3-R1和qGL3-R2的引物结合位置相同，但3’末端碱基分别为G和T，只能分别与野生型(短粒)和突变型(长粒)SNP配对。此外qGL3-R2的5’端增加了非特异序列GATATG用以引入扩增片段长度多态性，qGL3-R1的3’端第4个碱基引入了T到A的突变，qGL3-R2的3’端第5个碱基引入了C到A的突变用以扩大qGL3-R1和qGL3-R2对目标序列识别能力的差异。qGL3-F在C/A SNP上游，可以分别与qGL3-R1和qGL3-R2配对扩增出94bp和100bp的PCR产物。

本发明提供了前述特异性引物组合在鉴定水稻粒长基因qGL3基因型中的应用。

本发明提供了前述特异性引物组合在鉴定水稻粒长中的应用。

本发明提供了前述特异性引物组合在水稻种质资源改良中的应用。

进一步地，本发明提供了检测水稻粒长基因qGL3基因型的方法，首先对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1所示的正向引物、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，

若扩增产物只出现94bp条带，则表明待测样品的qGL3基因为野生型；若只出现100bp条带，则表明待测样品的qGL3基因为突变型；若同时出现94bp和100bp条带，则表明待测样品的qGL3基因为杂合型。

100bp条带的参考序列如SEQ ID NO.4所示，94bp条带的参考序列如SEQ ID NO.5所示。本领域技术人员应当理解，由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但这种差异通常不会影响标记的使用。

本发明还提供了一种检测水稻粒长的方法，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1所示的正向引物、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，

若扩增产物只出现94bp条带，则表明待测样品的谷粒粒长较短；若只出现100bp条带，则表明待测样品的谷粒粒长较长；若同时出现94bp和100bp条带，则表明待测样品的粒长介于较长和较短之间。

进一步地，上述PCR的反应体系为：Biomiga的2×Bench Top^TM Taq master mix 4μL，10μM的一个正向、两个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH₂O至10μL；

PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，20s，60℃，20s，72℃，25s，共35个循环；72℃，5min，16℃，1min。

在本发明的一个实施例中，是通过将PCR扩增产物进行PAGE胶电泳进行判断，PAGE胶电泳条件为：6％PAGE胶，U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳1h。

含有本发明所述的特异性引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述含有SEQ ID NO.1-3所示引物的试剂盒在长粒型水稻选育中的应用。

本发明提供了上述含有SEQ ID NO.1-3所示引物的试剂盒在水稻种质资源筛选和改良中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明基于水稻粒长基因qGL3编码区第1092位的SNP，设计开发了一种扩增片段短，特异性强的三引物分子标记。利用该分子标记，只需通过简单的PCR和PAGE凝胶电泳检测即可完成对qGL3的基因分型，预测水稻粒长。本发明具有分型更准确、成本更低廉、检测通量更高等优势，更适合在水稻大规模分子标记辅助选择中运用。

附图说明

图1是本发明分子标记的引物设计示意图。包括一条公共的正向引物qGL3-F，两条反向引物qGL3-R1和qGL3-R2。其中，qGL3-F可以分别与野生型qGL3基因(qGL3)序列和突变型qGL3基因(qgl3)序列完全匹配；qGL3-R1只能与qGL3匹配，并在3'端第四个碱基引入T到A的突变；qGL3-R2只能与qgl3匹配，并在3'端第五个碱基引入C到A的突变，在5'端添加六个非特异碱基GATATG。SNP位点用红色方框标出，引入的碱基突变用下划线标出，引物和引物结合位点碱基加粗表示。

图2是用本发明分子标记检测12个水稻品种/品系的PAGE胶电泳图。泳道1-10分别为N411、五丰B、华占、中香黄占、R51084、福丰恢1658、S-127、9311、岳4B、H28B。PCR产物大小标记在胶图右侧。

图3是用本发明分子标记检测N411/五丰B的F₁代单株的PAGE胶电泳图。泳道1-11为不同的F₁单株，12为N411，13为五丰B。PCR产物大小标记在胶图右侧。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1水稻qGL3基因分子标记的引物设计及扩增片段分析

1、引物设计

通过对水稻粒长基因qGL3在长粒和短粒品种中等位基因的序列比对，分析得到了长粒和短粒品种在qGL3编码区第1092位造成粒长变异的C/A SNP。根据该SNP位点上下游的序列设计引物组合：

qGL3-F:TCCTCTAGAATGACAATATGCACTCC(SEQ ID NO.1)，

qGL3-R1:CACCAGACTCCAGCAGCAGTG(SEQ ID NO.2)，和

qGL3-R2:GTATAGCACCAGACTCCAGCAGATGTT(SEQ ID NO.3)(见图1)。

2、扩增片段分析

用上述引物组合对水稻粒长基因qGL3进行扩增，短粒材料将只能扩出一条94bp条带。长粒材料将只能扩出一条100bp条带。而粒长介于短粒和长粒之间的材料可同时扩出一条100bp和一条94bp条带。100bp和94bp条带的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

实施例2用本发明分子标记鉴定水稻品种/品系的qGL3基因型

1、水稻粒长测量方法：每个品种/品系随机挑选3株，每株挑选10粒饱满籽粒测量平均粒长代表各株的粒长，3株粒长的平均值代表该品种/品系粒长。

2、水稻基因组DNA的提取

用N411、五丰B、华占、中香黄占、R51084、福丰恢1658、S-127、9311、岳4B、H28B等12个水稻品种/品系为材料，采用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下：取3cm长的水稻叶片，在800μL抽提缓冲液[1.5％(w/v)CTAB，1.05mol/L NaCl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/L EDTA(pH 8.0)]中磨碎，收集到一个1.5mL离心管中。65℃水浴30min，间或颠倒混匀。加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，颠倒混匀15min。12000r/min室温离心10min。吸上清450μL，转移到一个新的1.5mL离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后-20℃沉淀30min。12000r/min离心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μL灭菌ddH₂O溶解DNA。

3、PCR扩增

利用实施例1筛选得到的特异性引物组合(qGL3-F，qGL3-R1，qGL3-R2)对本实施例所述12个水稻品种/品系的DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系为：Biomiga的2×Bench Top^TMTaq master mix 4μL，10μM的一个正向、两个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH₂O至10μL；

PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，20s，60℃，20s，72℃，25s，共35个循环；72℃，5min，16℃，1min。

4、PCR产物检测

扩增产物经6％PAGE胶电泳检测，电泳条件为：U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳1h。电泳完成后用0.1％AgNO₃染色，观片灯上观察拍照。

5、结果与分析

粒长测量表明水稻品种/品系N411的粒长为13.77±0.29mm，其它品种的粒长为8.73±0.09-9.87±0.09mm，N411的粒长明显大于其它品种的粒长(表1)。用本发明实施例1的分子标记的引物组合扩增这些品种/品系，发现只有N411扩增出了一条100bp的带，为纯合突变基因型，而所有其它品种/品系都只扩增出了一条94bp的带，为纯合野生基因型(见图2和表1)。这些结果表明突变型qGL3在现有水稻栽培品种中分布稀少，只存在于少数特异的长粒种质资源中。此外，和野生型qGL3相比，突变型qGL3确实有使谷粒增长的效应。最后，野生型和突变型qGL3与粒长的对应关系验证了本发明分子标记在鉴定qGL3基因型时的准确性和可靠性。

表1 10份水稻品种/品系的qGL3基因型和谷粒长度

实施例3本发明分子标记的应用

1、水稻材料水稻品种N411与五丰B的F₁代11个单株。

2、水稻基因组DNA的提取在苗期提取叶片基因组DNA，具体方法同实施例2。

3、PCR扩增和产物判断标准参见实施例2。

4、水稻粒长测量方法参见实施例2。

5、结果与分析用本发明实施例1的分子标记(特异性引物组合qGL3-F，qGL3-R1，qGL3-R2通过PCR扩增得到)在苗期检测N411与五丰B的12个F₁单株中qGL3的基因型，发现全部11个单株同时扩增出了94bp和100bp条带，结果见图3。收种后对所述F₁单株的粒长进行鉴定，发现平均粒长为10.68±0.13mm，比N411粒长短，但比五丰B粒长长。说明本发明分子标记能在N411的杂交后代中有效区分qGL3的基因型，并能准确预测水稻粒长变化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种水稻粒长基因qGL3的分子标记及其应用

<130> KHP161118973.6Q

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcctctagaa tgacaatatg cactcc 26

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caccagactc cagcagcagt g 21

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtatagcacc agactccagc agatgtt 27

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 4

tcctctagaa tgacaatatg cactcctata aatttcttat aagttgcacg attctatctg 60

gttcagtgct agaaacatct gctggagtct ggtgctatac 100

<210> 5

<211> 94

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 5

tcctctagaa tgacaatatg cactcctata aatttcttat aagttgcacg attctatctg 60

gttcagtgct agacactgct gctggagtct ggtg 94