本发明属于药物化学领域，具体涉及式i所示的酸性鞘磷脂酶抑制剂的制备方法及其在细胞凋亡和炎症相关的疾病中的应用。
背景技术：
鞘磷脂酶(smase)水解脯乳动物体内鞘磷脂(sm)，生成神经酰胺和磷酸胆碱。其主要有3种表现形式：酸性鞘磷脂酶(asmase)、中性鞘磷脂酶(nsmase)和碱性鞘磷脂酶(alk-smase)。研究表明，酸性鞘磷脂酶的生物学活性占smase总活性的90％，是脯乳动物体内神经酰胺生成的最快和最直接的途径(国外医学.放射医学核医学分册，2005，29(1)，44-47)。
神经酰胺是一种重要的第二信使，可在信号转导过程中发挥作用，参与多种细胞功能，如调节细胞生长、增殖、变异，引起细胞凋亡，调节蛋白质分泌，参与免疫过程及炎症反应等作用(progressinlipidresearch，2016，61：51-62)。迄今为止，已发现多种内源性和外源性的因子包括肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-β(il-β)、干扰素-γ等，以及氧化应激、离子辐射、紫外线照射、热撞击、创伤、细菌感染和化学试剂等均可以激活asmase，导致神经酰胺的大量生成和聚集。
酸性鞘磷脂酶-神经酰胺通路参与体内炎症和细胞凋亡的过程，其过度激活导致神经酰胺的升高与聚集，参与多种相关疾病的发生发展(progressinlipidresearch，2016，61：51-62；apoptosis，2015，20：607-620)。所涉及疾病包括动脉粥样硬化(as)，糖尿病，肺气肿，肺水肿，肺部纤维化及囊性纤维化(cf)，非酒精性脂肪肝，阿尔兹海默(ad)，多发性硬化症(ms)，抑郁症等(thefasebjournal，2008，22：3419-3431；biol.chem.2015，396：707-736)。declin等发现asmase缺陷不但可以减少脂质沉积，还可以延缓斑块形成，酸性鞘磷脂酶基因敲除大鼠早期泡沫细胞斑块面积减少80％，粥样硬化斑块形成明显减少40-50％(arterioscler.thrombvasc.biol.，2008，28：1723-1730)。分泌于胞外的asm促进损伤细胞表面的脂蛋白大量累积，诱导巨噬细胞的内吞作用，最终导致泡沫细胞的形成。这些病理特征是动脉粥样硬化发生的关键因素(circulation，2007，116：1832-1844；progressinpharmaceuticalsciences，2013，37(8)：383-389)。asmase的激活还与心脏及脑的缺血再灌注损伤密切相关。在缺血再灌注模型中抑制asmase的活性，可以明显抑制缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡，改善心功能不全或脑卒中(febsj.，2009，276：5579-5588)。此外，在cf病人中，呼吸系统炎症和反复的细菌感染是其最主要的发病特征，asmase和神经酰胺是诱发这些病理过程的重要因素。临床研究证明，通过功能性抑制asmase，恢复神经酰胺的正常水平，可以明显改善cf患者的肺功能，延长存活时间(cellphysiol.biochem.，2016，39：565-572)。
通过抑制asmase恢复神经酰胺的正常水平，能够有效的缓解相关疾病的病症。但是已报道的asmase直接抑制剂只有底物类似物，二磷酸酯类，3，5-二磷酸肌醇类以及少数的天然产物类。并且已报到的分子具有选择性差，对磷酸酯酶稳定性差，透膜能力差等缺陷，不能应用到相关疾病的药物开发中(cellphysiol.biochem.2010，26：01-08)。
以上研究表明，酸性鞘磷脂酶是一个潜在的治疗靶点，asmase抑制剂在与炎症相关疾病和细胞凋亡相关疾病中有着很大的治疗潜力，目前亟需开发新型的抑制剂用于开发治疗相关疾病的候选药物。
技术实现要素：
本发明提供了作为新型酸性鞘磷脂酶直接抑制剂的化合物，制备方法及其在医药中的应用。
本发明提供的酸性鞘磷脂酶抑制剂是式i所示的化合物。
x代表o、s、ch2、nr4、r4选自h、c1-c3的直链烷基、c1-c3的支链烷基以及c3-c6的环烷基。
n为0、1、2、或3。
r1代表烷基、取代或无取代的芳基、取代或无取代的杂环基。
r1代表的烷基是c5-c14的直链烷基、c5-c14的支链烷基、c3-c7的环烷基中的一种；r1代表的芳基是苯基、联苯基、萘基；所述芳基带有或不带有取代基r5；所述取代基r5为单取代或双取代，代表h、f、cl、br、i、no2、nh2、cf3、cn、c1-c8的直链烷基、c3-c8的支链烷基、c3-c6的环烷基、or6、nhr6或杂环基中的一种；其中所述r6选自h、c1-c4的直链烷基、c1-c4的支链烷基或c3-c6的环烷基。
本发明所用术语杂环基指含有从氧、氮、硫原子中任选一个或一个以上的杂原子的饱和杂环基和芳香杂环基。
r2与r3相同或不相同，分别独立代表h、f、cl、br、cn、ch3、cf3、och3、ocf3、och2ch3、sch3、sch2ch3、nhch3、nhch2ch3、n(ch3)2、n(ch2ch3)2、以及c2-c4的直链烷烃、c2-c4的支链烷烃、c3-c6的环烷烃中的一种。
本发明所用术语烷烃包括饱和烷烃和不饱和烷烃。
本发明另一个目的是提供式i所示的化合物的制备方法：
式i所示化合物的合成方法如下：
y＝cl，br，i，otforots；r8＝ch3，ch2ch3，ch(ch3)2，c(ch3)3orbn
起始原料1或2在碱和催化剂条件下，与卤代烃发生取代反应或与烯烃发生heck反应得到中间体3；其中取代反应所用的碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的一种，用量为1-3当量，所用催化剂选自碘化钾、碘化钠中的一种，用量为0.01-0.1当量，溶剂为丙酮，温度为回流温度；heck反应所用催化剂选自醋酸钯、二三苯基膦氯化钯、氯化钯、四三苯基膦钯中的一种，用量为0.01-0.1当量，所用碱选自碳酸钾、碳酸钠、磷酸三钾、碳酸铯、三乙胺、吡啶中的一种，用量为1-3当量，溶剂选自甲苯、二甲苯、n，n-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷中的一种，温度为所用溶剂的回流温度。
化合物3在碱性条件下水解得到4。其中所用碱选自氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂中的一种，用量为3-10当量，溶剂为水和甲醇(体积比1∶1)，温度为50-100℃。
中间体4与酰化试剂反应得到化合物5。其中酰化试剂选自氯化亚砜、草酰氯中的一种，用量为1-5当量，溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃中的一种，温度为溶剂回流温度。
中间体5与羟胺和碱在室温下反应得到式i化合物。其中所用的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠，氢氧化锂中的一种，用量为4-6当量，溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃中的中的一种，温度为室温。
本发明的又一目的是提供了上述酸性鞘磷脂酶抑制剂在医药中的应用。
本发明的又一目的提供上述酸性鞘磷脂酶抑制剂或其药学上可以接受的盐、酯或前药在制备治疗与凋亡和炎症相关疾病药物中的应用，包括动脉粥样硬化(as)、糖尿病、肺气肿、肺水肿、肺部纤维化、囊性纤维化、非酒精性脂肪肝、阿尔兹海默(ad)、多发性硬化症(ms)、脑卒中、抑郁症。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但是本发明不限于下述的实施例。
实施例1本发明部分化合物合成，包括ia-ie和iia-iif，以化合物ia为例
4-甲氧基-3-辛氧基苯甲酸的制备：
将3-羟基-4-甲氧基苯甲酸甲酯1g(5.49mmol)溶于20ml丙酮中，加入碳酸钾2.27g(16.4mmol)，碘化钾91mg(0.549mmol)，溴辛烷1.27g(6.59mmol)，升温至回流反应10h，冷却至室温。将反应液过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤3次，合并有机相，旋干溶剂得到白色固体，将得到的白色固体用10ml甲醇溶解，加入10ml水和2.20g(54.9mmol)氢氧化钠，回流1h后冷却至室温，加入15％hcl水溶液调至酸性，析出产物4-甲氧基-3-辛氧基苯甲酸，为白色固体1.43g，收率94.2％。1h-nmr(300mhz，cdcl3)，δ：0.90(t，3h，-ch3)；1.28-1.46(m，10h，-(ch2)5-)；1.82-1.92(m，2h，-ch2-)；3.96(s，3h，-och3)；4.091(t，2h，-ch2oar)；6.93(m，1h，ar-h)；7.25(m，2h，ar-h)；esi-ms(m/z)：295[m+h]+.
4-甲氧基-3-辛氧基-n-羟基-苯甲酰胺的制备(ia)：
4-甲氧基-3-辛氧基苯甲酸1g(3.57mmol)溶于30ml无水二氯甲烷中，加入氯化亚砜1.28g(10.7mmol)，n，n-二甲基甲酰胺1滴，升温至回流反应1h后，冷却至室温，旋干溶剂，用无水四氢呋喃溶解，滴加到含有naoh0.43g(10.7mmol)和盐酸羟胺0.74g(10.7mmol)的四氢呋喃溶液中。滴加完毕后室温搅拌5min，旋干的粗品，柱层析纯化的白色固体n-羟基-4-甲氧基-3-辛氧基苯甲酰胺0.63g，收率60％。m.p.168-171℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)：δ11.06(s，1h)，8.89(s，1h)，7.38-7.34(m，，2h)，7.01-6.98(m，1h)，3.99-3.95(t，j＝6.60hz，2h)，3.79(s，3h)，1.74-1.67(m，2h)，1.41-1.39(m，2h)，1.27(m，8h)，0.87-0.84(m，3h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：δ164.41，151.85，148.12，125.37，120.49，111.81，111.71，68.72，56.08，31.70，29.17，29.15，29.13，25.97，22.54，14.41；hrms(esi-tof)：calcdforc16h26no4[m+h]+296.1856，found296.1860.
3-癸氧基-n-羟基苯甲酰胺(ib)
参照ia的合成方法，产物为白色固体，收率77.8％.m.p.107-108℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)，δ：11.16(s，1h)，9.01(s，1h)，7.38-7.29(m，3h)，7.07-7.03(m，1h).4.01-3.96(t，j＝6.30hz，2h)，1.74-1.69(m，2h)，1.41-1.37(m，2h)，1.25(m，12h)，0.88-0.83(t，j＝6.30hz，3h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：δ164.34，159.03，134.57，129.93，119.42，117.85，113.01，68.04，31.75，29.47，29.41，29.22，29.15，29.09，25.95，22.54，14.38；hrms(esi-tof)：calcdforc17h28no3[m+h]+294.2064，found294.2067.
3-十二烷氧基-n-羟基苯甲酰胺(ic)
参照ia的合成方法，产物为白色固体，收率72.4％.m.p.115-117℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)：δ11.18(s，1h)，9.02(s，1h)，7.36-7.29(m，2h)，7.06-7.04(m，1h)，4.00-3.96(t，j＝6.60hz，2h)，1.73-1.69(m，2h)，1.41(m，2h)，1.24(m，16h)，0.85-0.83(m，3h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：δ164.34，159.03，134.57，129.93，119.42，117.85，112.99，68.03，31.76，29.48，29.24，29.18，29.10，25.96，22.56，14.39；hrms(esi-tof)：calcdforc19h32no3[m+h]+322.2377，found322.2384.
3-辛氧基-n-羟基苯甲酰胺(id)
参照ia的合成方法，产物为白色固体，收率68.9％.m.p.85-87℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)，δ：11.18(s，1h)，，9.01(s，1h)，7.34-7.29(m，3h)，7.06-7.04(m，1h)，4.01-3.96(t，j＝6.3hz，2h)，1.74-1.69(m，2h)，1.41(m，2h)，1.26(m，8h)，0.86-0.38(m，3h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：δ164.37，159.03，134.58，129.94，119.43，117.86，113.02，68.05，31.69，29.19，29.12，29.09，25.96，22.54，14.48；hrms(esi-tof)：calcdforc15h24no3[m+h]+266.1751，found266.1747.
4-甲氧基-3-十二烷氧基-n-羟基苯甲酰胺(ie)
参照ia的合成方法，产物为白色固体，收率74.7％.m.p.128-129℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)，δ：11.05(s，1h)，8.88(s，1h)，7.36(m，2h)，7.00(m，1h)，3.97(m，2h)，3.80(s，3h)，1.72(m，2h)，1.25(m，18h)，0.86(m，3h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：δ164.04，151.88，148.15，125.39，111.88，111.74，68.74，56.08，31.76，29.48，29.17，25.97，22.54，14.37；hrms(esi-tof)：calcdforc20h34no4[m+h]+352.2482，found352.2482
3-苄氧基-n-羟基苯甲酰胺(iia)
参照ia的合成方法，产物为白色固体，收率65.7％.m.p.174-176℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)，δ：11.22(s，1h)，9.06(s，1h)，7.48-7.31(m，8h)，7.18-7.14(m，1h)，5.15(s，2h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：δ164.33，158.71，137.32，134.66，130.03，128.92，128.35，128.15，119.77，118.19，113.55，69.81；hrms(esi-tof)：calcdforc14h14no3[m+h]+244.0968，found244.0969.
3-(4-溴苄基)-氧基-n-羟基苯甲酰胺(iib)
参照ia的合成方法，产物为浅红色固体，收率72.3％，m.p.160-161℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)，δ：11.18(s，1h)，9.00(s，1h)，7.62-7.59(m，2h)，7.44-7.35(m，4h)，7.16-7.14(m，1h)，5.14(s，2h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：164.26，158.51，136.80，134.66，131.85，130.24，121.46，119.88，118.19，113.58，68.99；hrms(esi-tof)：calcdforc15h16no4[m+na]+343.9897，found343.9893.
3-((4-腈基)苄基)-氧基-n-羟基苯甲酰胺(iic)
参照ia的合成方法，产物为白色固体，收率70.8％.m.p.160-162℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)，δ：11.21(s，1h)，9.05(s，1h)，7.89-7.86(m，2h)，7.67-7.64(m，2h)，7.41-7.37(m，3h)，7.19-7.15(m，1h)，5.27(s，2h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：164.21，158.36，143.16，134.73，132.90，130.12，128.51，120.04，119.20，118.21，113.58，111.00，68.85；hrms(esi-tof)：calcdforc15h13n2o3[m+h]+269.0921，found269.0923.
3-((4-甲氧基)苄基)-氧基-n-羟基苯甲酰胺(iid)
参照ia的合成方法，产物为白色固体，收率70.0％.m.p.170-172℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)，δ：11.20(s，1h)，9.04(s，1h)，7.40-7.34(m，5h)，7.16-7.13(m，1h)，6.97-6.94(m，2h)，5.06(s，2h)，3.76(s，3h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：164.34，159.50，158.76，134.61，129.97，129.16，119.19，118.19，114.30，113.55，69.60，55.55；hrms(esi-tof)：calcdforc15h16no4[m+h]+274.1074，found274.1076.
3-苄氧基-4-甲氧基-n-羟基-苯甲酰胺(iie)
参照ia的合成方法，产物为白色固体，收率81.3％.m.p.178-179℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)，δ：11.06(s，1h)，8.90(s，1h)，7.47-7.34(m，7h)，7.34-7.02(m，1h)，5.12(s，2h)，3.82(s，3h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：δ164.37，152.03，147.79，137.39，128.87，128.34，128.26，125.39，120.88，112.59，111.85，70.48，56.16；hrms(esi-tof)：calcdforc17h16no4[m+h]+274.1074，found274.1079.
3-(4-溴苄基)-氧基-4-甲氧基-n-羟基苯甲酰胺(iif)
参照ia的合成方法，产物为白色固体，收率85.8％.m.p.149-151℃，1h-nmr(300mhz，dmso-d6)，δ：11.06(s，1h)，8.99(s，1h)，7.62-7.42(m，5h)，7.05-7.03(m，1h)，5.11(m，2h)，3.82(s，3h)；13cnmr(75mhz，dmso-d6)：164.26，151.99，147.55，136.88，131.82，130.31，125.36，121.46，120.99，112.63，111.85，69.65，56.17；hrms(esi-tof)：calcdforc15h16no4[m+h]+352.0185，found352.0179.
实施例2化合物ia-ig，iia-iif抑制酸性鞘磷脂酶活性实验。
酸性鞘磷脂酶可在细胞内水解鞘磷脂生成神经酰胺，针对一定量的荧光标记的反应底物，不同的酶活性催化生成不同量的产物，通过检测产物的含量可以考察酶活性的高低。本发明依据此原理进行实验设计。提取已培养好的细胞中的蛋白，加入缓冲液、荧光标记的反应底物，然后分别加入不同浓度的化合物ia-ie，iia-iif，设置空白对照组，反应结束后进行荧光分析，最后计算化合物的ic50值。
具体结果如表所示：
表：本发明部分化合物的酸性鞘磷脂酶抑制活性