本发明涉及用于生产微生物培养物，如微藻、蓝藻细菌、硅藻、酵母等的方法和生物反应器。
背景技术：
生物反应器是允许细胞或组织在给定培养基(通常为液体)中独立生长(没有操作人员持续干预)的设备。
人们已知，以机械换能形式由自然事件、其它形式的声污染(气候事件和动物相互作用)产生的被植物世界所感知的声音在空气中的作用和扩散。
知晓的是在生物反应器中通过由发射人类可听声域(100hz-20khz)的源所产生的声波辐射放置在其中的微生物培养物。然而，这种生物反应器需要声波具有高强度而不能以任何方式显著增加微生物的生长，以便至少从经济角度上满足市场需求。
技术实现要素：
本发明的目的是提供用于生产微生物培养物的方法，该方法能够加速培养物生长，继而获得比现有技术方法更高的生长速率。
本发明的另一目的是提供用于生产微生物培养物的生物反应器，该生物反应器易于制造且允许积极增加微生物生长动力学，以比已知的生物反应器更快地生产生物体培养物。
本发明通过根据权利要求1及各自的从属权利要求的用于生产微生物培养物的方法以及根据权利要求8及各自的从属权利要求的生物反应器解决了这些和其它目的。
具体地，通过生物反应器进行该生产微生物培养物的方法，该生物反应器包括至少一个圆柱形容器和摇动并混合容纳在所述容器中的所述微生物培养物的摇动混合装置。
该方法包括以下步骤：a)通过摇动混合装置摇动并混合所述微生物，和b)用声波辐射微生物培养物。
根据本发明的一个方面，在步骤b)期间，用声波辐射培养物，该声波的频率作为锯齿形函数随时间变化。声波的频率在包括在50hz和8khz之间、优选在100hz和6khz之间的范围内变化。
从而，所获得的声波(在术语中称为“扫描”)具有在包括在50hz和8khz之间、优选在100hz和6khz之间的范围内得到的两个值之间线性变化的频率。例如，可以从开始时间t0获得锯齿形函数(其中声波的频率等于例如100hz)，在给定时间段t之后，频率线性地达到6khz的值，然后返回(在比t短得多的时间段-理想地为零)到100hz，通过重复这样的操作，获得了频率是t周期的(锯齿形)函数的声波。
根据本发明的具体方面，锯齿形函数的t周期在包括在5和20秒之间，优选10秒。
申请人注意到，如上所述，相对于具有固定频率的声波获得的值，借助频率随时间变化的声波对微生物(例如微藻)的培养物的刺激产生了生长增长。
这样的结果可以是合理的，因为调制的非连续压力可能比连续且恒定的随时间的作用更好地被容忍。对密集和稀疏的声波频率的生物化学反应使得细胞以某种方式享受健康放松效果，其对保持微生物(例如微藻)的生理平衡更有效。
根据本发明的另一方面，作为具有相同周期t的锯齿形函数，声波的强度随时间从0db变化到70db。优选地，作为彼此同步并具有相同周期t(包括在5和20秒之间，优选地10秒)的锯齿形函数，声波的强度和频率可以随时间变化。因此，频率的增加对应于声波强度的增加。
根据本发明的另一方面，该方法包括以下步骤：c)通过至少部分地放置在微生物培养物内部的水听器检测由在所述微生物培养物内的所述声波辐射出的信号，和d)基于水听器检测到的信号确定液体培养物的浓度。
具体地，步骤d)包括以下步骤：d1)计算在步骤c)期间检测到的声波的傅里叶变换，和d2)计算在步骤c)期间检测到的声波的声压。
因此，申请人通过对由水听器检测到的声波的频域进行分析，观察到穿过培养物的声波具有关于培养物中微生物的细胞数目的信息。具体地，通过水听器测量到的声压与随时间变化的培养微生物的浓度成比例。由于本发明，可以连续并自动地随时间获得生物反应器中的每毫升细胞数量和微生物生长速率的测量量。
根据本发明的一个有利方面，步骤a)包括以下步骤：a1)通过摇动混合装置使微生物培养物以往复运动且沿着基本上竖直的方向移动。
优选地，步骤a1)持续约60秒且每10分钟重复一次。
根据本发明，将生物反应器进一步实施用于生产微生物培养物，该生物反应器包括至少一个圆柱形容器(优选具有椭圆形截面)和摇动并混合容纳在容器中的微生物培养物的摇动混合装置。
根据本发明的一个方面，生物反应器还包括用声波辐射微生物培养物的声波源。具体地，该源适合于发射其频率作为锯齿形函数随时间在包括在50hz和8khz之间、优选在100hz和6khz之间的范围内变化的声波。
根据本发明的另一方面，锯齿形函数的周期t在包括在5和20秒之间，优选10秒。优选地，声波的强度至少在所述周期t期间从0db变化到70db。
根据本发明的另一方面，生物反应器包括至少部分地放置在微生物培养物内部的至少一个水听器，以检测微生物培养物内的声波源辐射的信号。如上所述，由水听器检测到的信号用于确定培养物的微生物浓度。
有利地，根据本发明的生物反应器的摇动混合装置包括设置有具有基本竖直的纵向轴线的杆的至少一个摇动元件和相对于杆的纵向轴线倾斜布置的至少一个第一盘。
优选地，摇动混合装置包括相对于杆的纵向轴线倾斜布置的至少一个第二盘。优选地，所述至少一个第一盘和所述至少一个第二盘以相对的角度布置。有利地，摇动混合装置还包括电动马达，以使摇动元件以杆的纵向轴线的方向往复运动而移动。因此微生物可以在生物反应器内连续均匀地分布，从而防止微生物生物膜形成在生物反应器壁上并且不干扰声波。
附图说明
从下面的描述中，本发明的其它方面和优点将变得更加明显的，参考示例性附图，以下描述仅用于说明的目的而不是限制性的，其中：
-图1是根据本发明的生物反应器的实施方式的操作图；
-图2a和2b分别是本发明实施方式中的辐射出的声波的频率和强度随时间的曲线图；
-图3是根据本发明的摇动混合装置的操作图；
-图4是本发明的实施方式中的用于产生声波的声音信号的t周期内的对数尺度声谱图。
具体实施方式
图1示出了根据本发明的用于生产微生物培养物的生物反应器1的操作图。在附图所示的具体实施方式中，生物反应器1已被用于生产微藻(例如斜生栅藻(scenedesmusobliquus))的培养物。在适合用于在本发明中使用的微藻菌株中，可以包括以下菌株、例如但不限于：斜生栅藻(scenedesmusobliquuus)、四尾栅藻(scenedesmusquadricaula)、栅藻(scenedesmussp.)、浮水小球藻(chlorellaemersonii)、普通小球藻(chlorellavulgaris)、蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)、耐热性小球藻(chlorellasorokiniana)、椭圆小球藻(chlorellaellipsoidea)、海水小球藻(chlorellasalina)、微小小球藻(chlorellaminutissima)、原始小球藻(chlorellaprotothecoides)、phaeodactulumtricornutum、三角褐指藻(phaeodactylumtricornutum)、紫球薄(porphyridiumcruentum)、钝顶螺旋藻(spirulinaplatensis)、杜氏盐藻(dunaliellasalina)、特氏杜氏藻(dunaliellatertiolecta)、盐生微拟球藻(nannochloropsissalina)、眼点微拟球藻(nannochloropsisoculata)、微拟球藻(nannochloropsissp.)、四肩突四鞭藻(tetraselmissuecica)、扁藻(tetraselmischuii)、海洋富油微拟球藻(nannochloropsisgaditana)、裸甲藻属nelsoni(gymnodiniumnelsoni)、球等鞭金藻(isochrysisgalbana)、纤细裸藻(euglenagracilis)、布朗葡萄藻(botrycoccusbraunii)、富油新绿藻(neochlorisoleoabundans)、盐生蓝隐藻(chroomonassalina)、隐秘小环藻(cyclotellacryptica)、平滑菱形藻(nitzschialaevis)、单针藻(onoraphidiumsp.)、雨生红球藻(haematococcuspluvialis)、单壳缝藻(monoraphidiumminutum)、单针藻(monoraphidiumsp.)、小环藻(cyclotellasp.)、ettliatexensis、巴夫藻(pavlovalutheri)、海链藻(thalassiosirasp.)、杆状裂丝藻(bacillarisstichococcus)，以单养培养或与不同物种竞争培养的微藻。还可以使用不同种类的蓝藻细菌的培养物：鱼腥藻(anabaenasp.)、多变鱼腥藻(anabaenavariabilis)、钝顶节旋藻(arthrospiraplatensis)、节旋藻(arthrospirasp.)、acaryochlorissp.、蓝杆藻属(cyanothecesp.)、铜锈微囊藻(microcystisaeruginosa)、微囊藻(microcystissp.)、红假单胞菌(rhodopseudomonassp.)、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、海洋原绿球藻(prochlorococcusmarinus)、聚球藻(synechococcussp.)、synechococcusallunga、念珠藻念珠藻(nostocsp.)、点形念珠藻(nostocpunctiforme)、嗜热聚球藻属allunga(thermosynechococcusallunga)、红海束毛藻(trichodesmiumerythraeum)、绿硫菌(chlorobiumtepidum)、绿棒菌(chlorobaculumsp.)、原绿球藻(prochlorococcussp.)、acaryochlorismarina、粘杆菌属(gloeobactersp.)、无类囊体蓝藻(gloeobacterviolaceus)、集胞藻(synechocystissp.)、拉氏拟柱孢藻(cylindrospermopsisraciborskii)、集胞藻(synechocystissp.)。还可以使用不同种类的硅藻的培养物：牡蛎海氏藻(hasleaostrearia)、牡蛎舟形藻(naviculaostrearia)、舟形藻(naviculasp.)(作为水的生物指示物)、爱氏楔形藻(licmophoraehrenbergii)、三点舟形藻(naviculatripunctata)、双生双楔藻(didimospheniageminata)、桥弯藻(cymbellasp.)以及示例性酵母：啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)、库维酵母(saccharomyceskudriavzevii)、酵母属cariocanus(saccharomycescariocanus)、奇异酵母(saccharomycesparadoxus)、巴氏酵母(saccharomycespastorianus)、贝酵母(saccharomycesbayanus)、摩纳酵母(saccharomycesmonacensis)、葡萄汁酵母(saccharomycesuvarum)、卡氏酵母(saccharomycescarlsbergensis)。
生物反应器1包括适合于容纳微生物培养物的圆柱形容器2。在微藻的情况下，生物反应器还包括一个或多个光照射源(未示出)，例如以给定间距(优选距离容器25cm)竖直布置的吊灯上的氖管。容器2优选由5mm厚的硼硅酸盐玻璃制成。
优选地，容器具有椭圆形截面，其较小直径等于等效管的半径。这样的特征允许沿着光源的整个轴线分布微藻培养物的量，并且通过将具有较小曲率的表面暴露于光照射，抵消了反射现象，因而仅在侧面轮廓附近(更弯曲的)限制分散效果。
图1的容器2通常填充有双蒸水3，其中微生物培养物4浸没在其中(在这种情况下是微藻)。在容器底部附近，存在声源5(声音致动器)以用声波10辐射和刺激微生物培养物4。优选地，声源5在外部接触容器2的底壁。
申请人进一步指出，借助lvd(激光多普勒测振仪(laserdopplervibrometer))激光干涉分析，在各个外部轮廓附近，容器2的椭圆形部分为生物反应器提供了比在声波传输步骤中更高的刚度，放大了容器2的侧表面本身的振动，使其比类似圆柱形结构的振动更显著，在类似圆柱形结构中由于令人讨厌的径向运动的上升而使声音振动的传递效果抵消。
然而，本发明的其它实施方式可以提供被放置在容器2内且浸没在双蒸水中的声源，其仍然保持在本发明的保护范围内。
声源5可以是具有磁致伸缩技术、20w最大功率和4欧姆阻抗的声音致动器(例如ottonetm致动器)。
声源5优选地被连接到放大器7，放大器7又被连接到信号发生器6。信号发生器6优选地被连接到电子处理器8，通过该电子处理器8可以上传给定类型的电信号以由发生器6生成，另外发生器和电子处理器可以被认为是单一的操作单元(例如，作为具有声卡的pc)。借助于电子处理器和/或发生器，由此可以生成给定的电信号，并且在由放大器7方便地进行放大之后，由声音致动器5转换为声波10。
在优选的实施方式中，生物反应器还包括至少部分浸没在培养物4内的水听器9(优选地与自由水面相距约5-10cm)。致动器5产生的声波穿过培养物4，然后被水听器9检测到。因此水听器9被连接到电子处理器8(例如通过连接到pc的采集卡)。声波10在穿过培养物4之后，包含一些有用的信息，可以通过对由水听器9检测到的信号进行频率分析来提取这些信息。电子处理器8计算由水听器9检测到的信号的傅立叶变换(例如通过fft算法)并计算检测到的声波的声压。处理器8基于这些数据确定培养物4内包含的微生物的浓度。
对于声波在水中的强度测量，经过一系列转换得到的用于说明温度和介质特性的测量单位是db(以1mpa作为参考)。
具体地，通过实验测试，可以实现数据库，其中根据微生物的每个浓度(通过已知技术测量的)，将与一系列样品声音(具有确定的强度和频率)有关的数据相关联。在确定细胞穿越时投射在仪器的光学路径上的等效球体的直径(在斜生栅藻(scenedesmusobliquus)是长椭球体的情况下)之后，以激光粒度技术由自动稀释单颗粒激光检测粒度仪(accusizer780/adautodiluter)和具有一次性吸头的自动细胞计数器sceptertm2.0手持式自动细胞计数器进行浓度(细胞/ml)测量。
通过将与检测到的声波有关的数据与数据库中包含的数据进行比较，处理器可以准确地追踪容器中微生物的浓度。因此可以实时进行这种测量，以保持在生产周期期间监测的微生物培养物4的生长。
优选地，在不考虑其面容比的情况下，按照1-3μm、3-7μm、7-10μm、10-13μm的等级而不是计数burker室中的细胞来进行尺寸生长的监测。
优选地，所产生的声波10(例如正弦曲线)的频率作为锯齿形函数随时间变化。图2a示出了声波10的频率的时间模式。声波的频率在包括在50hz和8khz之间、优选在100hz和6khz之间的范围内变化。锯齿形函数的周期t优选地在包括在5和20秒之间，优选为10秒。
优选地，声波的强度作为锯齿形函数随时间在包括在0和70db之间的范围内变化。图2b示出了由致动器5产生的声波10的声强(以分贝表示)的时间模式。在所示的实施方式中，强度(i)和频率(f)根据具有相同周期t的锯齿形函数随时间同步变化。然而，其它实施方式可以使声波的强度保持恒定(例如，约62db的值)且仅改变频率，这仍然保持在本发明的保护范围内。
图4更详细地示出了在本发明的优选实施方式中的用于产生声波的声音信号的十秒的t周期内的对数尺度声谱图。
在微生物生长需要人工照明的情况下(例如在微藻的情况下)，优选将培养物在24小时的周期内循环照明14小时、10小时黑暗。优选地仅在十四小时的照明内进行声刺激。更优选地，以被140分钟的准备期间隔的40分钟的时段进行声刺激。换句话说，交替地进行持续40分钟的声刺激时段和持续140分钟的“沉默”时段。
生物反应器1还包括用于摇动并混合容纳在容器2中的微生物培养物4的装置11。在图1中，为了更好的可视化，优选地未示出装置11。图3示出了根据本发明的用于摇动并混合微生物培养物4的装置11的实施方式。
摇动混合装置11包括设置有具有基本竖直的纵向轴线的杆12的至少一个摇动元件11a(位于容器2内)和相对于杆12的纵向轴线倾斜布置的至少一个第一盘13a。在所示的实施方式中，摇动元件11a设置有两个固定在杆12上的盘13a，13b，并且优选相对于杆12的纵向轴线倾斜布置，更优选地以相对的角度布置。该盘相对于容器2底部的角度优选为约20°。
然而，其它的实施方式可以提供设置有大量盘(例如三个或更多个盘)的杆12，其中至少一个盘与其它盘相对地成角度定向，其仍然保持在本发明的保护范围内。
杆12优选地由钢制成。优选地，盘13a和13b由聚四氟乙烯制成(优选具有约4mm的厚度)，以确保滑动能力并使与容器2内壁的可能摩擦最小化。
因此，如图3中的箭头14所示的，摇动元件11a以往复运动且沿着基本上竖直的方向移动。通过以往复自下而上运动的方式移动在容器2内的摇动元件11a，反之亦然，申请人注意到引起了旋转运动(即在不存在湍流下的微涡旋)，通过其获得了培养物4内均匀分布的微生物以及微生物沿着水柱3更好地再悬浮。
纵向往复运动可以例如借助电动马达m通过围绕水平地放置在容器2上方的铝棒16将尼龙线15(固定在杆12的端部)卷绕和展开并且顺时针地和逆时针地移动(如箭头17所示的)而获得。由交替的脉冲(正的和负的)驱动电动马达m，每次脉冲持续六秒钟。然后使摇动元件11a移动，以便在12秒内完成完整的“上下”循环(上升6秒，下降6秒)。这种操作每隔十分钟重复一次(五次完整的“上下”循环)，即摇动1分钟和准备9分钟。
优选地，在培养物4为微藻的情况下，在照明期间和黑暗期间以及类似地在声刺激期间和沉默期期间，均连续地重复摇动1分钟和准备9分钟的步骤。
图3所示的实施方式允许减小装置11的体积，然而另外的实施方式可以提供用于以不同方式获得摇动元件11a的纵向往复运动，例如可以借助刚性元件将杆12移动，例如与由电动马达m旋转的小齿轮连接的齿条(代替螺纹)。
一个替代实施方式提供了包括多个容器2的生物反应器1，每个容器2配备有声波10的源5。在该实施方式中，每个容器2设置有摇动元件11a。通过围绕由马达m旋转的棒16将相应的尼龙线15卷绕和展开以移动每个摇动元件11a。以这种方式，通过单个电动马达m，可以将不同摇动元件11a纵向地同步移动，从而获得简单且便宜的实施结构。
通常，根据本发明的生产微生物培养物的方法包括以下步骤：
a)通过所述摇动混合装置11摇动并混合所述微生物4，
b)用声波10辐射所述微生物培养物4，所述声波的频率(f)作为锯齿形函数随着时间在包括在50hz和8khz之间、优选在100hz和6khz之间的范围内变化。
优选地，锯齿形函数的周期t在包括在5和20秒之间，优选10秒。
优选地，该方法包括以下步骤：
c)通过至少部分地放置在所述微生物培养物4内的水听器9检测穿过所述微生物培养物4的所述声波10，
d)基于由所述水听器9提供的信号确定所述培养物4的浓度。
优选地，在步骤b)期间，所述声波10的强度(i)作为锯齿形函数随着时间在包括在0db和70db之间的范围内变化。
步骤a)包括以下步骤：a1)通过所述摇动混合装置11，以往复运动且沿着基本竖直的方向14使所述微生物培养物4移动。优选地，步骤a1)持续约60秒并且每隔10分钟重复一次。
优选地，步骤d)包括以下步骤：d1)计算在步骤c)期间检测到的声波10的傅立叶变换，和d2)计算在步骤c)期间检测到的声波10的声压。