一种阵列式高通量分离培养微生物装置制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种阵列式高通量微生物分离培养装置。揭示一种新型微生物分离培养装置，所述的装置可以实现实验室已培养和/或未培养微生物的高通量分离、培养，操作简化，且与现有实验室设备兼容性好。本发明的分离培养装置可以模拟自然环境对微生物进行原位培养，能高效分离难培养微生物(或称未培养微生物、不可培养微生物)。本发明的微生物分离培养装置可应用于从环境中分离培养难培养微生物；也可应用于研究微生物与微生物、微生物与环境因素、微生物与营养因子之间的相互作用关系；也可应用于微生物资源调查与研究、环境与生态关系、天然药物发现、生物技术研究等领域。
【专利说明】一种阵列式高通量分离培养微生物装置
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物培养领域；更具体地，本发明涉及一种阵列式微生物分离培养
>J-U ρ?α装直。
【背景技术】
[0002]自然环境中存在着丰富的微生物物种资源，是药物发现、功能微生物挖掘(如生物能源、生物化工、生物材料产生菌)和解决当今人类社会面临的资源、环境、人口与健康等重大可持续发展问题的资源宝库。已知人类可培养的微生物种类仅是海洋微生物的0.01-0.1%，陆地微生物的1%左右，许多微生物分类门(Phylum)或纲(Class)中至今还没有分离到一个代表性菌种(Rappe, M.S, et al.The uncultured microbial majority.Annual Review of Microbiology, .2003, 57:369 - 394)。然而一百多年以来米用针对已培养微生物(Cultured Microbes)的常规分离培养方法分离未培养微生物(UnculturedMicrobes)碰到了难以逾越的技术障碍。常规微生物分离培养方法采用平板稀释分离，费力、耗时，而且营养琼脂培养基具有明显的选择性和对某类微生物生长的偏好性，使得人类很难接近那些丰富多样的未培养微生物(Karsten, Z., et al.Cultivating theuncultured.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America, 2002，99 (24): 15681-15686)。微生物学和药物学筛选研究常常陷入重复分离、重复发现已知微生物和已知化合物的循环工作中。因此，未培养微生物的分离培养的新装置、新方法、新技术研究，是国际上微生物学基础研究和应用研究领域广受关注并且面临很大技术挑战的一项研究任务。
[0003]模拟自然环境培养法分离未培养微生物是一种行之有效的新方法，该方法通过设计一种扩散室(Diffusion Growth Chamber)来分离海水、淡水或土壤中的微生物新种,取得了很好的效果(Kaeberlein, T.，et al.1solating “uncultivable”microorganisms inpure culture in a simulated natural environment.Science,2002,296:1127-1129)。扩散室是由两层膜和一个不锈钢垫圈构成的原理性结构，下层膜(孔径为0.03 μ m)首先与垫圈粘牢，将取自近海沉积物上的微生物进行稀释后与融化后的温琼脂混合，倒入扩散室，再将上层膜粘固于垫圈的上方。将扩散室放回于原来取样点的环境中培养，或放于模拟这些微生物自然生存环境的水中培养。这种培养策略允许环境中的营养物种能够自由进出扩散室，而微生物则被限制于扩散室内部。培养一周后有大量形态各异的微菌落被监测到。该方法最大的菌落回收率达到了接种微生物数的40±13%。与标准的平板分离方法相比，利用扩散室稳定分离到的微生物是平板法的大约300倍。当把这种方法应用到其他环境来源的多种微生物样品，证明这是一种非常成功的分离培养微生物的策略。考虑到这个方法的劳动量很大，限制了它在药物发现中的应用，Nichols将扩散室发展为一种高通量的从未培养微生物中大量平行培养微生物装置，叫作分离芯片(Isolation Chip,或iChip)，他们在一个72X19X Imm尺寸的范围内构建了两个矩阵，每个矩阵有192个微孔，每个微孔直径为1mm，共384个微孔，相当于384个小扩散室。使用时每个小室内平均分配I个细胞，这样就实现了培养和分离一步完成(Nichols, D, et al.Use of ichip forhigh-throughput insitu cultivation of “uncultivable，，microbial species.Applied andEnvironmentalMicrobiology, 2010, 76 (8):2445-2450)。Gavrish 又将扩散室稍作改变成了一个捕获器(Trap)，专门用来分离丝状微生物，如放线菌、霉菌。与扩散室不同的是:下层膜改为0.2-0.6μπι的聚碳酸酯膜，在下层膜与垫圈紧固好后，将灭菌的不含菌的琼脂注入室内，盖上上层膜。将捕获器置于待分离的样品表面(如要分离的土壤样品)，紧密接触。该方法利用了丝状微生物的菌丝在蔓延生长时能够穿透滤膜而进入到捕获器室内的琼脂中，放线菌一般能穿透0.2 μ m的膜，而霉菌则能穿透0.4-0.6 μ m的膜，营养成分可以自由扩散到琼脂内。通过控制下层膜的孔径，就可以选择性地分离放线菌或霉菌。这两种分离培养方式都属于模拟自然环境的原位培养(in situ Cultivation)策略(Gavrish, E., et al.A trapfor in situ cultivation of filamentous actinobacteria.Journal ofMicrobiologicalMethods,2008,72:257-262)。
[0004]但是Nichols的方法仍存在不少技术问题，由于iChip上的孔非常小，往孔中分配培养基和分散在培养基中的微生物的办法是通过将iChip完全浸没到含菌的琼脂培养基中，使得呈融化状态的培养基扩散到小孔中，等从培养基溶液中取出iChip后，培养基固化在小孔中，达到分配培养基和微生物的目的(参考文献(Nichols，2010中图示)。但这种方式不可避免地会在整个iChip表面残留培养基和微生物细胞，这样很难避免这些孔外微生物的生长和对实验的干扰，所以这种分配培养基的方式不能克服孔间交叉污染，这是这种iChip结构本身带来的问题。其次,培养仅是整个微生物分离工作流程中的一个环节，iChip只是提供一个培养环境，培养后的微生物还需要进行样品分析和微生物分离、纯化等过程，iChip培养后的样品必须一个孔一个孔地转移出来，可以想想在这样小的芯片上把这么多小孔内样品转移 出来是一件非常不易的工作，如果仅凭手工操作，工作效率则大大降低，而且极易出错。这样这种原本希望提高工作效率的高通量设计理念，最终也由于后续工作流程的限速瓶颈而不能得以体现。高通量技术是需要整套流程的各步骤间的高通量匹配来实现，否则就会遇到“短板效应”问题，决定于通量大小的关键步骤就在于通量最低的一步。对于iChip这种非标设计，未见文献报道有专门的自动化或高通量设备匹配其使用。这些缺陷使得上述装置最终没有形成商品化产品。
[0005]因此，本领域迫切需要进行进一步的研究，来开发改进扩散室培养微生物的装置，克服以上技术缺陷。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种阵列式微生物分离培养装置。
[0007]在本发明的第一方面，提供一种微生物分离培养装置，所述分离培养装置包括:培养装置(2)和环境模拟装置(I)；
[0008]所述的培养装置(2)包括:
[0009]中间培养板(24)，其上分布有6-1536个通孔；
[0010]上过滤膜(23)，其覆盖于中间培养板(24)的上方；
[0011]下过滤膜(25)，其覆盖于中间培养板(24)的下方；
[0012]上固定板(21)，其覆盖于上过滤膜(23)的上方，其上分布有6-1536个通孔，各通孔的规格、数量及分布位置与中间培养板(24)上的通孔相一致；
[0013]下固定板(27)，其覆盖于下过滤膜(25)的下方，其上分布有6-1536个通孔，各通孔的规格、数量及分布位置与中间培养板(24)上的通孔相一致；
[0014]所述的上固定板(21)、上过滤膜(23)、中间培养板(24)、下过滤膜(25)、下固定板(27)从上至下层叠排列，以紧固件(28)固定；
[0015]所述的环境模拟装置(I)包括:
[0016]储液容器(11)，其可容纳所述的培养装置(2);
[0017]托架(12)，其位于储液容器(11)内(较佳地，所述的托架是水平的)，用于承载所述的培养装置⑵；
[0018]上盖(13)，其与储液容器(11)的开口相匹配。
[0019]在一个优选例中，所述的上固定板、上过滤膜、中间培养板、下过滤膜、下固定板在被紧固件紧固后，各通孔内培养物可透过过滤膜与环境模拟装置中的环境物进行物质(不包括细胞)交换，但各通孔之间不发生直接的物质(包括细胞)交换。
[0020]在另一优选例中，所述的储液容器是开口的。
[0021]在另一优选例中，所述的上固定板(21)与上过滤膜(23)之间，还包括上密封板
[22];其上分布有6-1536个通孔，各通孔的规格、数量及分布位置与中间培养板(24)上的通孔相一致；和/或
[0022]所述的下固定板(27)与下过滤`膜(25)之间，还包括下密封板(26);其上分布有6-1536个通孔，各通孔的规格、数量及分布位置与中间培养板(24)上的通孔相一致。
[0023]在另一优选例中，所述的上密封板与下密封板发挥隔离中间培养板各通孔内培养物的作用，使得各通孔内培养物透过过滤膜与环境模拟装置中的环境物进行物质(不包括细胞)交换，但各通孔之间不发生直接的物质(包括细胞)交换。
[0024]在另一优选例中，所述上固定板(21)、上密封板(22)、中间培养板(24)、下密封板(26)、下固定板(27)上，通孔的规格、数量及分布位置一致，通孔数量为6-1536个；和/或通孔的排列为矩阵式排列。
[0025]在另一优选例中，所述储液容器(11)的横截面形状与所述培养装置(2)的外周形状相匹配，所述培养装置(2)设置在所述储液槽内的托架上。
[0026]在另一优选例中，所述的中间培养板的厚度不低于0.5mm ;和/或所述的通孔的直径在 1-3 5mm。
[0027]在另一优选例中，所述的通孔的直径在2-22mm;更佳地，所述的通孔的直径是:2-9mm。
[0028]在另一优选例中,所述的中间培养板的厚度不低于Imm;更优选的厚度为l_5mm。
[0029]在另一优选例中，所述的紧固件(28)选自(但不限于):螺丝紧固件、磁吸式紧固件、夹固式紧固件。
[0030]在另一优选例中，所述上盖(13)的顶面内侧设有密封垫(14);和/或过滤膜。
[0031]在另一优选例中，所述上盖(13)的顶面可以设置一个或多个通孔；
[0032]所述密封垫上可以设置一个或多个通孔，该通孔与上盖的顶面的通孔的规格、数量及分布位置相一致；和
[0033]所述的上盖顶面与密封垫之间，还包括一层过滤膜。[0034]在另一优选例中，所述的上固定板(21)、上过滤膜(23)、中间培养板(24)、下过滤膜(25)、下固定板(27)、储液容器(11)、上盖(13)和托架(12)的材料选自(但不限于):不锈钢、铝、聚丙烯、聚碳酸酯；和/或
[0035]所述的上密封板(22)和下密封板(26)的材料选自(但不限于):硅胶、橡胶、聚四氟乙烯等。
[0036]在另一优选例中，所述材料的耐受高温；较佳地，耐受121°C的温度。
[0037]在另一优选例中，所述的上过滤膜(23)和下过滤膜(25)的滤膜孔径:0.01—10.0um0
[0038]在另一优选例中，滤膜材质可以是:纤维素酸酯类、聚酰胺类、聚砜类、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚烯烃类。
[0039]在另一优选例中，所述的中间培养板(24)上孔的排布格式为矩阵结构，通孔间距4_25mm,通孔直径2_25mm,中间培养板厚不低于Imm(较佳地，l_5mm)。
[0040]在另一优选例中，所述的中间培养板与通用384孔微量培养板一致，长128± 1mm，宽86 ± Imm ;通孔个数为384个，通孔间距及分布与通用384孔板一致，通孔直径2_4mm，培养板厚I_3mm。
[0041]在另一优选例中，所述的中间培养板与通用96孔微量培养板一致，长128 ± 1mm，宽86 ± Imm ;通孔个数为96个，通孔间距及分布与通用96孔板一致，通孔直径4_8mm，培养板厚I_3mm。
[0042]在另一优选 例中，所述的中间培养板与通用48孔微量培养板一致，长128 ± 1mm，宽86 ± Imm ;通孔个数为48个，通孔间距及分布与通用48孔板一致，通孔直径6_1 lmm,培养板厚2-4mm。
[0043]在另一优选例中，所述的中间培养板与通用24孔微量培养板一致，长128 ± 1mm，宽86 ± Imm ;通孔个数为24个，通孔间距及分布与通用24孔板一致，通孔直径9_19mm，培养板厚3_5mm。
[0044]在另一优选例中，所述的中间培养板与通用12孔微量培养板一致，长128 ± 1mm，宽86 ± Imm ;通孔个数为12个，通孔间距及分布与通用12孔板一致，通孔直径12_22mm，培养板厚3-5mm。
[0045]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1、本发明的微生物分离培养装置的整体结构示意图。
[0047]图2、培养装置(培养室)的结构示意图。
[0048]图3、环境模拟装置(模拟室)的结构示意图。
[0049]图4、环境模拟装置(模拟室)的装配示意图。
[0050]图5、本发明的微生物分离培养装置的工作原理示意图。
[0051]图中的标记分别为:
[0052]1.环境模拟装置(环境模拟室)；11.储液容器(储液槽)；
[0053]12.托架；13.上盖；[0054]14.密封垫；15.环境水或混合物；
[0055]2.培养装置(培养室)；21.上固定板；
[0056]22.上密封板；23.上过滤膜；
[0057]24.中间培养板；25.下过滤膜；
[0058]26.下密封板；27.下固定板；
[0059]28.螺丝紧固件；29.半固体或液体培养基；
[0060]210.扩散室；211.扩散室。
【具体实施方式】
[0061] 为了解决现有技术中缺乏专门的分离培养未培养微生物的实验装置，本发明基于扩散室培养原理，设计制造了一种新型微生物高通量分离培养装置，本发明所述的装置可以实现高通量微生物扩散式培养方法，操作简化，且与现有实验室设备兼容性好，扩散室内除了可以在高通量方式下定量加入含有细胞的固态培养基、半固体培养基外，还可以定量加入含有细胞的液体培养基，克服了 iChip技术中很难实现高通量定量加入液体培养基的缺陷，也克服了 iChip技术中分配琼脂培养基操作易于带来孔外长菌和孔间交叉污染问题、培养后样品分析和处理过程中操作不简便而使工作效率大大降低等缺陷。本发明的分离培养装置可以模拟自然环境对微生物进行原位培养，并能高效分离未培养微生物；也可应用于研究微生物与微生物、微生物与环境因素、微生物与营养因子之间的相互作用关系；也可应用于微生物资源调查与研究、环境与生态关系、天然药物发现、生物技术研究等领域。
[0062]微生物分离培养装置
[0063]本发明提供一种可模拟自然环境的微生物培养装置，该装置包括两个主要功能模块:一个是微生物培养装置(微孔板扩散室)，提供微生物生长空间；另一个是环境模拟装置(环境模拟室)，模拟微生物天然生长环境或构建特定的微生物生态环境，与微生物培养装置进行物质交换，供应微生物生长所需要的营养成分。
[0064]培养装置
[0065]所述的培养装置是一种“三明治”式结构，包括培养板以及分别位于培养板上下两侧的过滤膜和固定板。自上而下具体包括:上固定板、上过滤膜、中间培养板、下过滤膜、下固定板。上述各层板和膜通过螺钉或其它紧固方式夹紧固定。除两层过滤膜外，在固定板和培养板上都设置有数量、分布位置、规格相应(相一致)的通孔，中间培养板上的通孔用作微生物培养容器，每一个孔即是一个扩散室。藉由上下固定板夹紧固定的情况下，培养板上的每一个扩散室通过上下两层紧贴其上的过滤膜将微生物或其它细胞与外界环境分隔开，细胞被限制在微孔板扩散室内，而外界环境中的营养物质可以自由扩散进出扩散室。中间培养板的各通孔各自作为独立的培养室，互相之间不能够发生直接的物质交换和细胞交换；但是，藉由通孔上下覆盖的过滤膜，各通孔可以与过滤膜外的环境发生物质交换(不含细胞交换)。
[0066]作为本发明的优选方式，所述的上固定板与上过滤膜之间，还包括上密封板；所述的下固定板与下过滤膜之间，还包括下密封板。密封板上也分布有通孔，各通孔的规格、数量及分布位置与中间培养板上的通孔相一致。密封板的应用可更有效地发挥密封作用，隔离中间培养板各通孔内培养物，使得各通孔内培养物透过过滤膜与环境模拟装置中的环境物进行物质(不包括细胞)交换，但各通孔之间不发生直接的物质(包括细胞)交换。当通过螺钉或其它方式将上下两层固定板之间夹紧时，密封板就将中间培养板上的孔与孔之间完全隔开，再通过上下两层过滤膜使得扩散培养室内细胞与外界环境分隔开，这样微生物细胞被完全限制在扩散室内，而外界环境中营养物质可以自由扩散进出扩散室，与扩散室内进行物质传递和交换。密封板的主要功能是起密封作用，因此这两层密封板也可以用密封圈(如当通孔为圆形时，采用O型圈)替代，即可以采用数量上与扩散室孔数相同、大小与扩散室孔径匹配的密封圈来密封，密封圈可分别设置在中间培养板上的扩散室上下两个端口，通过上下两层固定板夹紧；更佳地可以在上下两层固定板的通孔外周加工密封圈定位槽(与密封圈大小相同的槽)来定位每一个密封圈。所述的密封圈也可设置在上下两侧固定板上；可选地密封圈定位槽也可设置在中间培养板上。
[0067]所述上固定板、上密封板、中间培养板、下密封板、下固定板上，通孔的规格、数量及分布位置一致，通孔数量为6-1536个；更佳地为12-384个；如384孔、96孔、48孔、24孔、12孔等。通孔的排布及孔数可以根据需要来设定；较佳地，各通孔呈矩阵排列；更优选的，通孔间距与现在市场上通用的相同孔数的微孔板上的孔间距相同，便于与自动化液体工作站兼容。通孔的形状是可选的，例如横截面为圆形、方型、椭圆形等。作为本发明的优选方式，所述的通孔的横截面是圆形的。
[0068]目前，微孔板(Mciro-Well Plate)用于微生物培养广泛应用，对微孔板的孔结构、培养体积、振荡频率、表面张力、气体传递效率、物料混合等综合参数已经研究的非常详细。微孔板具有阵列式排列、标准化、平行性、高通量和自动化仪器兼容的优势。因此，作为本发明的优选方式，本发明的中间培养板上，各通孔的规格、数量及分布位置与现有公知的微孔板(如通用384孔微量培养板,96孔微量培养板,48孔微量培养板,24孔微量培养板，12孔微量培养板)相一致；从而，使得本发明的微生物分离培养装置既能模拟自然环境的原位培养法高效分离未培养微生物的原理，又能实现与自动化液体处理装置高度兼容的高通量分离的微孔板格式的扩散室培养装置，形成可商品化的装置，满足本领域技术人员的研究需要。
[0069]环境模拟装置
[0070]本发明中，所述的环境模拟装置是由储液容器、上盖和托架组成。所述的储液容器可容纳所述的培养装置；所述的托架位于储液容器内(较佳地，所述的托架是水平的)，用于承载所述的培养装置；所述的上盖，其与储液容器的开口相匹配。较佳地，所述的培养装置与环境模拟装置可以紧密固定在一起，可通过限定培养装置与环境模拟装置内部的尺寸来实现紧密固定，也可通过在储液容器内部或托架上设置卡口、卡槽等元件来实现紧密固定。
[0071]作为本发明的优选方式，所述的储液容器形状呈长方体或正方体，上端呈完全敞开，侧壁垂直于底面。
[0072]作为本发明的 优选方式，储液容器底部外部长宽尺寸与现有公知的微孔板(如通用384孔微量培养板,96孔微量培养板,48孔微量培养板,24孔微量培养板,12孔微量培养板)长宽尺寸相同或略小，便于兼容市场上用于微孔板的设备仪器，在不需要与其它设备仪器兼容的情况下，也可以采 用其它各种形状和大小；储液容器的内部深度大于微孔板扩散室的总高度与托架总高度之和。
[0073]所述的托架可以直接设置于储液容器中，例如设置于储液容器的壁上；或者，所述的托架与储液容器是可拆分的。应理解，只要能够发挥承托培养装置的作用，所述的托架的形状、结构是没有特别限制的。作为本发明的优选方式，所述的托架可构成一个水平面，储液容器可以水平状态置于其上。当然，为了培养的需要，托架也可设置成非水平的状态；例如，该托架可以是可调节高低的托架。作为本发明的优选方式，托架由一个水平框和四个长度相等的支脚组成(也可以是其它数量的支脚，但至少三个以上，并且不在同一直线上分布)，托架放于储液容器内，托架用来放置所述的培养装置。通过托架支撑来达到培养装置下端与储液容器底部之间有一定的空间容纳取自环境中的液体或液体与固体的混合物。
[0074]所述的上盖与储液容器的开口是相匹配的，其可以直接设置于储液容器上，例如可通过铰链结构来与储液容器相连接；或者，所述的上盖与储液容器是可拆分的。只要能够发挥盖子的封闭作用，任何形状结构的上盖均是可用的。
[0075]作为本发明的优选方式，所述的上盖由顶面和侧面围成，侧面垂直于顶面；上盖侧面的水平切面内侧形状与储液容器侧面水平切面的外侧形状相同，而且其水平切面内部尺寸略大于储液容器侧面水平切面的外部尺寸。更优选地，上盖顶面内侧有一过滤膜和一密封垫，上盖顶面无孔或打孔，打孔可打一个或数个通孔，若上盖顶面打孔，则在上盖顶面内侧的密封垫上对应位置也设置数量、形状、分布位置相一致的通孔，以过滤膜夹在盖子和密封垫中间。
[0076]更优选地，上盖顶面内侧有一层过滤膜和一层硅胶材质或其它材质的密封垫，盖子上不打孔或打一个或数个通孔，在盖子内侧的密封垫上对应位置设置有相同数量和形状的通孔，过滤膜就夹在盖子和密封垫中间。
[0077]材料
[0078]本发明装置的上下固定板、中间培养板、微环境模拟装置储液容器、上盖、托架等部件可以采用不锈钢材质、铝材、聚丙烯材料、聚碳酸酯等材料加工或铸造，只要它们有一定强度。较佳地，这些材质能够耐高温消毒；更佳地能耐受121°C或以上高温。本发明的装置的各部分可以通过机械加工、铸造、注塑、拉模等多种方式制造。各配件采用上述材质加工制造，属于耐用产品，不存在类似于市场上微孔板的一次性使用带来的资源消耗和环境污染等问题。
[0079]所述的上下密封板、可选地设置于中间培养板或上下固定板上的密封圈可以采用各种材质的硅胶板或其它有一定弹性的材料，只要其能够实现密封的效果。较佳地，其能耐高温消毒；更佳地能耐受121°C或以上高温。
[0080]由于本发明装置采用了更加灵活的过滤膜固定方式，使得膜的替换、膜材质的筛选非常容易，通过更换不同孔径的膜材料，微孔板扩散室就可以变成高通量Trap，用于专门分离样品中的微生物(如放线菌或真菌)。
[0081]应用
[0082]使用时，将所述的培养装置置于环境模拟装置内的托架上，盖上上盖后，形成一套完整的分离培养装置。本装置可用于静置培养，也适用于震荡培养。
[0083]所述的培养装置与环境模拟装置紧密固定在一起，培养装置的微孔板扩散室与环境模拟装置之间通过过滤介质(膜)可以交换营养物质，微生物被限制在扩散室的通孔内，每个通孔内的微生物数量可以根据研究设计人为控制，通孔内培养基可根据研究目的选择不同的形态或组成，培养基的加注可以匹配多道移液器或自动化移液工作站。下层环境模拟装置内可以是来自取样环境中的海水、淡水、土壤等，也可以是根据这些环境特点人工模拟的溶液或固体介质。下层环境模拟装置可以是不分割的一个模拟室，也可以是分割成更多个环境的带分割的模拟室。所述培养装置也可以不与环境模拟装置配合，直接放在取样点或其它环境培养。
[0084]工作状态下，所述培养装置放置于储液容器(储液槽)内的托架上，在微孔板扩散室底部与储液容器内底部之间形成一个空腔，即作为环境模拟装置，环境模拟装置内可填充液体或半固体溶液(来自待分离微生物所处自然环境中的海水、河水、湖水；或水与泥的混合物；或人工配制的培养液等，在图中以“环境水或混合物”表示)。由于培养板上的每一个扩散室通过上下两层紧贴其上的过滤膜将微生物(或其它细胞)与外界环境分隔开，细胞被限制在微孔板扩散室内(扩散室内为半固体培养基或液体培养基)，而外界环境中的营养物质(即注入到储液容器内的环境水或混合物中含有的各种小分子物质等)可以透过过滤膜自由扩散进出扩散室；而扩散室内的细胞代谢物也可以自由扩散进出扩散室。这样，通过扩散，特别在摇动培养方式下，各个扩散室之间可以通过同一环境模拟室发生物质交换，因此，该装置可以用来研究微生物与环境之间、微生物与微生物之间、微生物与营养因子之间的相互作用关系，可以在微生物各自纯培养状态下研究微生物共培养等关系。
[0085]由于是高通量培养方式，可以根据需要控制中间培养板的每个孔中的微生物细胞数量(如平均每孔I个细胞)，能实现微生物分离和纯化同步进行。
[0086]已知目前可人工培养的微生物仅是海洋微生物的0.01-0.1%，陆地微生物的1%左右，自然环境中超过99%不可培养的微生物，是药物发现、功能微生物挖掘和解决重大可持续发展问题的资源宝库。然而采用常规的平板稀释分离等微生物分离培养方法，不仅费力、耗时，而且营养琼脂培养基具有明显的选择性和对某类微生物生长的偏好性，使得人类很难接近那些丰富多样的未培养微生物。因此，开发微生物分离培养新技术和新装置为打破这一僵局提供了一种技术手段。本发明的`装置即为实现这一目标成为可能。本装置的应用可以达到提高微生物分离效率，获得更加多样性的未培养的微生物新种和新化合物，为药物发现、难培养微生物分离、合成生物学元件筛选等研究提供一种技术手段，并适用于研究这些难培养微生物与环境、生物、化学分子之间的生态生理机制。因此，本装置在生命科学基础研究、应用研究方面用处相当之广。这种新方法、新技术、新装置的应用可以推动相关行业的技术进步，并带来间接的经济效益。
[0087]本发明的有益效果是:
[0088](I)与传统的平板分离培养方法相比，本发明装置设计了专门的结构来实现模拟自然环境和分离培养微生物，特别在分离培养自然界中未培养微生物方面，具有明显优势。
[0089](2)本发明的培养装置具有高通量、微型化的特点，提高了分离微生物的科研工作效率，降低了科研劳动强度和减少实验场地、设备和材料试剂的投入。
[0090](3)本发明可以用来研究微生物与环境、微生物与微生物、微生物与营养因子之间的相互作用机理研究，如共生关系、敏感因子发现等；
[0091](4)本发明的装置较佳地为标准微孔板规格，可与现有配套常规微孔板的一些自动化设备兼容，充分提高工作效率和现有设备的利用率；而且只要改变微孔板扩散室上的打孔方式，就可以在市场上标准的384、96、48、24、12、6孔之间切换，通用性很高。
[0092](5)本发明可采用不锈钢等金属材质加工制造，装置属于耐用产品，不存在类似于市场上微孔板的一次性使用带来的资源消耗和环境污染等问题。
[0093](6)装置结构小巧，通用性强，适合批量化生产制造。
[0094]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0095]实施例1、一种矩阵型扩散式微生物培养装置[0096]参见图1，提供一种矩阵型分离培养装置包括环境模拟装置I和设置在环境模拟装置I内的培养装置2 (培养室2)，培养室2提供微生物生长空间；环境模拟装置I用于供应微生物生长相关的环境成分。使用时，将培养室2置于环境模拟装置I内，盖上盖子后，形成一套完整的装置。
[0097]参见图2，培养室2是一种“三明治”式结构，由两层固定板、两层密封板、一层培养板和两层过滤膜组成；从上到下依次为上固定板21、上密封板22、上过滤膜23、中间培养板24、下过滤膜25、下密封板26、下固定板27。上述各层板和膜通过螺丝紧固件28夹紧固定。除培养室2的两层过滤膜外，上述各层固定板、密封板和培养板上都设置有上下相通的通孔，通孔设置为呈矩阵排列的96孔(12X8);孔径为6mm;孔间距为9mm(两个孔的中心点之间距离)。中间培养板24上的每一个通孔即为一个扩散室。培养板上的每一个扩散室通过上下两层紧贴其上的过滤膜将微生物或其它细胞与外界环境分隔开，细胞被限制在扩散室内，而外界环境中的营养物质可以自由扩散进出扩散室。过滤膜为聚碳酸酯膜，孔径0.1um,厚度3-5um,可高温灭菌。
[0098]两层密封板(上密封板、下密封板)采用医用硅胶板，其能耐121°C以上高温，能够耐受蒸汽湿热灭菌，当通过螺钉或其它方式将上下两层固定板之间夹紧时，硅胶密封板就将中间培养板上的孔与孔之间完全隔开(即将扩散室与扩散室隔开)，再通过上下两层过滤膜使得扩散室与外界环境分隔开，这样微生物细胞被完全限制在扩散室内，而外界环境中营养物质可以自由扩散进出扩散室，与扩散室内进行物质传递和交换。
[0099]参见图3-4，环境模拟装置I是由下部储液容器11 (储液槽11)、上部上盖13和中部托架12组成。储液槽11形状呈长方体，上端呈完全敞开，侧面垂直于底面；储液槽11底部内部长宽尺寸与市场上标准的微孔板长宽尺寸相同，图中外部长宽尺寸为130mmX90mm。储液槽11的内部深度大于培养室的总高度与托架12的总高度之和；图中，储液槽11的内部深度为45mm ;培养室总高度为Ilmm ;托架12高度为15mm。
[0100]上盖13由顶面和侧面围成，侧面垂直于顶面，上盖侧面的水平切面内侧形状与储液槽11侧面水平切面的外侧形状相同，而且其水平切面内部尺寸略大于储液槽11侧面水平切面的外部尺寸；上盖13顶面内侧有一层过滤膜和一层硅胶材质的密封垫14，上盖13上设置有数个通孔，与上盖13相应地在盖子内侧的密封垫14上设置有相同数量和形状的通孔，过滤膜就夹在盖子和密封垫中间。
[0101]托架12由I个矩形水平框和分布于水平框的两个长边上接近四个角上的4个长度相等的支脚组成；托架12放于储液槽11内，托架12上放置培养室2，托架12水平框的外围水平尺寸略小于储液槽11的内部水平尺寸，通过托架12支撑来达到培养室2下端与储液槽底部之间有一定的空间容纳取自环境中的液体或液体与固体的混合物。
[0102]图中装置的上固定板21和下固定板27采用不锈钢材质；中间培养板24采用不锈钢材质；环境模拟装置I的储液槽11采用不锈钢材质；上盖13采用不锈钢材质、托架12采用不锈钢材质。过滤膜采用聚碳酸酯材质。
[0103]实施例2、矩阵型扩散式微生物培养装置各部件的组合
[0104]参见图1，培养装置2与环境模拟装置I固定在一起，两室之间通过过滤介质(上下过滤膜)可以交换营养物质，微生物被限制在扩散室的孔内，每个孔内的微生物数量可以根据研究需要人为控制，孔内培养基可根据研究目的选择不同的形态或组成(如半固态或液态)，培养基的加注可以匹配多道移液器或自动化移液工作站。
[0105]环境模拟装置I内可以是来自取样环境中的海水、淡水、土壤等，也可以是根据这些环境特点人工配制的溶液。环境模拟装置I可以是不分割的一个大槽，也可以是分割成更多个微环境的带分割的模拟室；图1中，环境模拟装置是一个大槽。
[0106]另一种方式下，可将培养装置2脱离环境模拟装置，直接放在取样点或其他环境培养。
[0107]实施例3、矩阵型扩散式微生物培养装置的工作方式
[0108]参见图5，本发明的装置的工作过程是，培养室2放置于储液槽11内的托架12上，在培养室2的底部与储液槽11内底部之间形成一个空腔，储液槽11内充满液体或半固体溶液，即环境水或混合物15，其来自待分离微生物所处自然环境中的海水、河水、湖水；或水与泥的混合物；或人工配制的培养液等。由于中间培养板24上的每一个扩散室通过上下两层紧贴其上的过滤膜将微生物(或其它细胞)与外界环境分隔开，细胞被限制在扩散室210,211内，扩散 室210、211内为半固体培养基29或液体培养基，而外界环境中的营养物质(即注入到储液槽11内的环境水或混合物15中含有的各种小分子物质等，如图5中c、d、e……等)可以透过过滤膜自由扩散进出扩散室210、211等；而扩散室210、211内的细胞代谢物也可以自由扩散进出扩散室210、211 (如扩散室210中的细胞A产生的代谢物a、扩散室211中的细胞B产生的代谢物b等可以扩散到储液槽11内，并且可以再次扩散到其他扩散室内)。这样，通过扩散，特别在摇动培养方式下，各个扩散室之间可以发生物质交换，因此，该装置可以用来研究微生物与环境之间、微生物与微生物之间、微生物与营养因子之间的相互作用关系，可以在微生物各自纯培养状态下研究微生物共培养等关系。
[0109]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种微生物分离培养装置，其特征在于，所述分离培养装置包括:培养装置(2)和环境模拟装置⑴； 所述的培养装置(2)包括: 中间培养板(24)，其上分布有6-1536个通孔； 上过滤膜(23)，其覆盖于中间培养板(24)的上方； 下过滤膜(25)，其覆盖于中间培养板(24)的下方； 上固定板(21)，其覆盖于上过滤膜(23)的上方，其上分布有6-1536个通孔，各通孔的规格、数量及分布位置与中间培养板(24)上的通孔相一致； 下固定板(27)，其覆盖于下过滤膜(25)的下方，其上分布有6-1536个通孔，各通孔的规格、数量及分布位置与中间培养板(24)上的通孔相一致； 所述的上固定板(21)、上过滤膜(23)、中间培养板(24)、下过滤膜(25)、下固定板(27)从上至下层叠排列，以紧固件(28)固定； 所述的环境模拟装置(I)包括: 储液容器(11)，其可容纳所述的培养装置(2); 托架(12)，其位于储液容器(11)内，用于承载所述的培养装置(2); 上盖(13)，其与储液容器(11)的开口相匹配。`
2.如权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述的上固定板(21)与上过滤膜(23)之间，还包括上密封板(22);其上分布有6-1536个通孔，各通孔的规格、数量及分布位置与中间培养板(24)上的通孔相一致；和/或 所述的下固定板(27)与下过滤膜(25)之间，还包括下密封板(26);其上分布有6-1536个通孔，各通孔的规格、数量及分布位置与中间培养板(24)上的通孔相一致。
3.如权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述上固定板(21)、上密封板(22)、中间培养板(24)、下密封板(26)、下固定板(27)上，通孔的规格、数量及分布位置一致，通孔数量为6-1536个；和/或 通孔的排列为矩阵式排列。
4.如权利要求1所述的微生物扩散培养装置，其特征在于，所述的中间培养板的厚度不低于0.5mm ;和/或 所述的通孔的直径在l_35mm。
5.如权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述的紧固件(28)选自:螺丝紧固件、磁吸式紧固件、夹固式紧固件。
6.如权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述上盖(13)的顶面内侧设有密封垫(14);和/或 过滤膜。
7.如权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述上盖(13)的顶面可以设置一个或多个通孔； 所述密封垫上可以设置一个或多个通孔，该通孔与上盖的顶面的通孔的规格、数量及分布位置相一致；和 所述的上盖顶面与密封垫之间，还包括一层过滤膜。
8.如权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述的上固定板(21)、上过滤膜(23)、中间培养板(24)、下过滤膜(25)、下固定板(27)、储液容器(11)、上盖(13)和托架(12)的材料选自:不锈钢、铝、聚丙烯、聚碳酸酯；和/或 所述的上密封板(22)和下密封板(26)的材料选自:硅胶、橡胶、聚四氟乙烯等。
9.如权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述的上过滤膜(23)和下过滤膜(25)的滤膜孔径:0.01-10.0um0
10.如权利要求1所述的微生物分离培养装置，其特征在于，所述的中间培养板(24)上孔的排布格式为矩 阵结构，通孔间距4-25mm,通孔直径2_25mm,中间培养板厚不低于1mm。
【文档编号】C12M1/12GK103865751SQ201210548502
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月17日 优先权日:2012年12月17日
【发明者】王勇, 郝玉有 申请人:中国科学院上海生命科学研究院