新的抗病毒化合物、其制备工艺、以及其用于治疗病毒感染的用途的制作方法

文档序号:13985080

本发明涉及L-2’-脱氧苏糖核苷磷酸酯的新的前药,如氨基磷酸酯、磷二酰胺化物、和磷酸二酯前药。本发明还涉及制备这些核苷磷酸酯的新的前药工艺。本发明还涉及这些新的磷酸酯修饰核苷用于治疗或防止病毒感染的用途、以及制造药物以治疗或防止病毒感染的用途,特别是属于HBV家族的病毒的感染。



背景技术:

超过3.5亿的人被嗜肝DNA乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染。该疾病的范围是多样的和可变的,从无活性的携带者状态到进行性的慢性乙型肝炎(CHB)。然而,在多数HBV携带者中,肝病通过肝硬化发展为肝细胞癌,每年导致约1百万人的死亡,并且目前占肝移植病例的5~10%。因此,药物疗法的目标是阻止肝硬化的发展并阻断癌症的出现。目前用于治疗乙型肝炎感染的方法包括干扰素疗法和使用核苷类似物的治疗。(标准或PEG化的)干扰素疗法模拟了宿主的抗病毒免疫应答。干扰素必须以肠胃外给药的方式给予,且其使用与多种副作用(如流感样症状、厌食和抑郁)相关。核苷类似物疗法的主要目的是阻断病毒的DNA合成并由此减少被感染的肝细胞的数量。目前,五种核苷类似物被许可用于HBV感染的治疗。拉米夫定(LMV)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦、替比夫定、和富马酸替诺福韦酯(TDF)(图1)。TFV和ETV目前被认为是一线治疗,因为它们具有强抗病毒活性和高抗性。

图1:被FDA认可的抗HBV核苷和核苷酸

拉米夫定、恩替卡韦和替比夫定是传统的抗病毒核苷,其抗病毒活性取决于其在病毒感染细胞内的细胞内的代谢从而依次形成单磷酸盐或酯、二磷酸盐或酯和三磷酸盐或酯。这些核苷酸、尤其是三磷酸盐或酯是药理学上的活性物质,它们通过DNA聚合酶并入生长中的DNA链,导致链终止或伪DNA。导致核苷5’-单磷酸酯形成的第一个磷酸化步骤通常通过被宿主细胞或病毒感染的宿主细胞所编码的核苷激酶催化。通过核苷、核苷酸和核苷二磷酸激酶,核苷单磷酸分别被转化成相应的5'-二磷酸酯和三磷酸酯。因此,细胞激酶以及病毒编码的激酶在核苷药物的激活中起着至关重要的作用。

阿德福韦和泰诺福韦都是核苷磷酸酯,其可以为认为是核苷单磷酸酯类似物,具有代谢稳定的优点,因为磷-碳键不易水解切割。而且,磷酸酯基团的存在允许核苷激活所需的第一磷酸化步骤被跳过,因此绕过向三磷酸核苷的转化中的速率限制步骤。尽管代谢稳定,磷酸酯在生理pH下为负电荷,因此不能渗透富含脂质的细胞膜,这阻碍了它们的抗病毒活性。因此,这些化合物作为口服的可被生物利用的前药销售。

为了绕过核苷的生物活化中的第一个限制速率的磷酸化步骤,合成了环状核苷磷酸酯。一个例子包括已经合成的一系列L-2’-脱氧苏糖核苷磷酸酯类似物(见J.Am.Chem.Soc.2005,127,5056-5065)。两个同类物表现极佳的活性。PMDTA(膦酰基甲氧基脱氧苏糖基腺嘌呤)显示了对HIV-1和HIV-2的EC50值为2.53μM,而PMDTT(膦酰基甲氧基脱氧苏糖基胸腺嘧啶)对HIV-1和HIV-2具有6.59μM的IC50值。另外,这些类似物缺乏细胞毒性(PMDTA的CC50值>316μM且PMDTT的CC50值>343μM)。尽管其具有有前景的抗病毒谱,但磷酸酯部分的高电荷特性阻碍了它们的细胞渗透性。

本发明基于意想不到的发现,即这些PMDT的样本(英文:dome)前药显示出意想不到的生物学性质,尤其是对乙型肝炎病毒具有显着的抗病毒活性。

发明内发

本发明涉及膦酰基甲氧基脱氧苏糖基(PMDT)核苷磷酸酯的新的前药,及其作为药物治疗病毒疾病的用途。其基于意想不到的发现,即某些核苷前药显示出意想不到生物的性质,尤其是具有对乙型肝炎病毒的显显活性。

本发明的内发编号为:

1.一种式I的化合物:

其中

-B是任意的天然的或修饰的碱基

-R1具有通式II

其中

R3选自芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C3-C8-环烷基、C3-C8环烷基-烷基、芳基(C1-C6)烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、羟基C1-C10烷基、卤代C1-C10烷基、和烷氧基烷基;

R4选自芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C3-C8-环烷基、C3-C8环烷基-烷基、芳基(C1-C6)烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、羟基C1-C10烷基、卤代C1-C10烷基、烷氧基烷基、X-COOR5、X-OCO-R5

其中X为芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、或C3-C8-环烷基,且其中所述芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C8-环烷基任选地包括一个或多个独立地选自卤素、卤代烷基、氰基、C1-C7烷氧基的官能团、原子或自由基;并且

其中R5选自芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C3-C8-环烷基、C3-C8环烷基-烷基、芳基(C1-C6)烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、羟基C1-C10烷基、卤代C1-C10烷基、和烷氧基烷基;

-R2为O-Ar,其中Ar是稠合双环芳基部分或单环芳基部分,其中任一个芳基部分是碳环或杂环,且任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基所取代;

或R2具有通式II

其中R1和R2可相同或不同;

或R1和R2具有通式III,

其中R1和R2可相同或不同;

Z为O;

R选自H、芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C3-C8-环烷基、C3-C8环烷基-烷基、芳基(C1-C6)烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、羟基C1-C10烷基、卤代C1-C10烷基、烷氧基烷基;

和/或其药学上可接受的加成盐和/或其立体异构体和/或其溶剂化物。

2.根据内发1的化合物,其中B选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤。

3.根据内发1或2的化合物,其中R2为O-Ph。

4.根据内发1~3中任一项的化合物,其中R3选自C1-C10烷基。

5.根据内发1~4中任一项的化合物,其中X为C1-C10烷基且R5为C1-C10烷基。

6.根据内发1~5中任一项的化合物,其中R2为O-Ph,且其中R1选自

7.根据内发1或2的化合物,其中R1和R2相同且选自:

8.一种化合物,选自:

1′α-(腺嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N,N′-双(正丙基-L-苯丙氨酸酯)]甲基膦酰二酰胺化}-L-苏糖;1′α-(腺嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N-(异丙基-L-丙氨酸酯)](苯氧基)甲基膦酰基酰胺化]}-L-苏糖;1′α-(腺嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N-(二异戊基-L-天冬氨酸酯)](苯氧基)甲基膦酰基酰胺化}-L-苏糖;1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-[N,N′-双(正丙基-L-苯丙氨酸酯))甲基膦酰二酰胺化]-L-苏糖;1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N-(异丙基-L-丙氨酸酯)](苯氧基)甲基膦酰基酰胺化}-L-苏糖;1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-{[N-(二异戊基-L-天冬氨酸酯)](苯氧基)甲基膦酰基酰胺化}-L-苏糖;1′α-(胞嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N,N′-双(正丙基-L-丙氨酸酯)]甲基膦酰二酰胺}-L-苏糖;1′α-(胞嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N-(异丙基-L-丙氨酸酯)](苯氧基)甲基膦酰基酰胺化}-L-苏糖;1′α-(鸟嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-[N,N′-双(正丙基-L-苯丙氨酸酯)]甲基膦酰二酰胺化]-L-苏糖;1′α-(鸟嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-[N,N′-双(正丙基-L-丙氨酸酯)]甲基膦酰二酰胺化]-L-苏糖;和1′α-(鸟嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N-(异丙基-L-丙氨酸酯)](苯氧基)甲基膦酰基酰胺化}-L-苏糖,

分别具有以下结构式:

9.用于医药用途的根据内发1~8中任一项的化合物。

10.用于医药用途的根据内发1~8中任一项的化合物,用于防止或治疗动物、哺乳动物或人中的病毒感染。

11.根据内发10的化合物,其中所述病毒感染是HBV、HIV、HCV、RSV、登革热病毒、流感病毒、CMV、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、BK病毒、和/或HSV的感染。

12.根据内发1~8中任一项的化合物,用作防止或治疗动物、哺乳动物或人中的增殖性失调如癌症的药物。

13.一种药物组合物,其含有治疗有效量的根据内发1~8中任一项的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

14.根据内发13的药物组合物,还含有一种或多种选自抗病毒药物和/或抗增殖性药物的生物活性药物。

15.一种防止或治疗动物、哺乳动物或人中的病毒感染的方法,其包括给予治疗有效量的根据内发1~8中任一项的化合物,任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。

16.一种防止或治疗动物、哺乳动物或人中的增殖性失调的方法,其包括给予治疗有效量的根据内发1~8中任一项的化合物,任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。

17.制备根据内发1~8中任一项的化合物的方法,包括使相应的核苷磷酸酯或其盐与氨基酸酯或其盐以及任选的单环或稠合双环芳族或杂芳族羟基化合物反应,所述反应任选在活化体系如2,2’-二硫代二吡啶和三苯基膦的存在下进行。

以下进一步描述本发明。在下面的段落中,更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他方面或多个方面组合,除非明确地进行了相反指示。具体而言,被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他特征进行组合。

发明详述

方案1示意性地显示了用于制造PMDTA(膦酰基甲氧基脱氧苏糖基腺嘌呤)和PMDTT(膦酰基甲氧基脱氧苏糖基胸腺嘧啶)的前药的方法。化合物1按照文献中描述的步骤合成自L-抗坏血酸(Schoning,K.U;Scholz,P.;Wu,X.L.;Guntha,S.;Delgado,G.;Krishnamurthy,R.;Eschenmoser,A.Helv.Chim.Acta 2002,85,4111;Dumbre,S.G.,Jang,M.,Herdewijn,P.J.Org.Chem.2013,78,7137-7144)。化合物1的3'-羟基用TBSCl(88%)甲硅烷基化,然后用DIBAL-H介导的内酯还原成内半缩醛并乙酰化,得到关键中间体3,产率为73%。使用三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(TMSOTf)的甲硅烷基化的苯甲酰腺嘌呤和胸腺嘧啶的Vorbrüggen糖基化反应在65℃在乙腈中分别以56%和83%的收率得到化合物4和5。TBS基团通过在THF中用Et3N·3HF处理来去除,且使用三氟甲磺酸二异丙基膦酰基甲基酯和NaH在THF中在-15℃下引入磷酸酯官能团,分别以80%和85%的产率得到化合物8和9。用NaOH/THF/H2O或LiOH/MeOH/H2O去除3′位的苯甲酰基团。在标准Barton脱氧条件下进行2'-脱氧,分别以98%和97%的产率得到化合物12和13。化合物12的苯甲酰基团在甲醇中用氨去除,且13和14的膦酸酯官能团的水解在2,6-二甲基吡啶的存在下在室温下用TMSBr进行TMSI,提供目标化合物PMDTA15和PMDTT16。与制备核苷膦酸酯HIV逆转录酶抑制剂GS-9148的前药的文献(Mackman,R.L.,Ray,A.S.,Hui,H.C.,Zhang,L.,Birkus,G.,Boojamra C.G.,Desai,M.C,Douglas,J.L.,Gao,Y.,Grant,D.,Laflamme,G.,Lin,K.Y.,Markevitch,D.Y.,Mishra,R.,McDermott,M.,Pakdaman,R.,Petrakovsky,O.V.,Vela,J.E.,Cihlar,T.Bioorg.Med.Chem.2010,18,3606-3617)中所述的程序类似地合成PMDTA和PMDTT的单酰胺化物和膦酰二酰胺化物前药17-22。

B=A 17:R1=R2=Phe-n-Pr

18:R1=Ala-i-Pr,R2=OPh

19:R1=Asp-i-amyl,R2=OPh

B=T 20:R1=R2=Phe-n-Pr

21:R1=Ala-i-Pr,R2=OPh

22:R1=Asp-i-amyl,R2=OPh

试剂和条件:(a)TBSCl,催化剂DMAP,Im,0℃到室温,过夜,97%;(b)DIBAL-H,无水THF,-70到-60℃,3小时;(c)乙酸酐,Et3N,无水CH2Cl2,0℃到室温,过夜,2步骤的产率为73%;(d)BSA,TMSOTf,MeCN,4为56%,5为83%;(e)Et3N·3HF,THF,6为97%,7为99%;(f)(iPrO)2POCH2OTf,NaH,THF,8为80%,9为85%;(g)NaOH,THF/H2O,10为80%;LiOH,H2O/MeOH,11为85%;(h)(1)TCD,DMAP,DCM;(2)Bu3SnH,AIBN,甲苯,12为98%,13为97%;(i)饱和NH3in MeOH,92%;(j)TMSBr,2,6-二甲基吡啶,MeCN,15为60%;TMSI,2,6-二甲基吡啶,MeCN,16为65%;(k)氨基酸酯,二硫代二吡啶-2,PPh3,吡啶,34%-73%。

方案1

方案2示意性地示出了制造PMDTC(膦酰基甲氧基脱氧苏糖基胞嘧啶)的前药的方法。在乙酰氯存在下用甲醇处理(根据文献Dumbre,S.et al.J.Org.Chem.2013,78,7137-7144中所描述的程序合成的)2b,以83%的收率得到甲基苏糖苷23。膦酸酯官能团使用THF中的三氟甲磺酸二异丙基膦酰基甲基酯和NaH在–5℃下引入,以87%的产率得到3′O-膦酰基甲基的24,作为对映异构体的混合物。该甲基苏糖苷24以83%的产率被转化为1′,2′-二酰基糖基供体25。使用三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)作为路易斯酸,在无水乙腈中0℃下进行预甲硅烷化的N-4-苯甲酰胞嘧啶的Vorbrüggen糖基化,以40%的产率得到胞嘧啶苏核苷26。其相应的前药31和32是根据方案1中PMDTA和PDMTT的前药中描述的方案由26合成的。

试剂和条件:(a)AcCl,MeOH,83%;(b)(iPrO)2POCH2OTf,NaH,THF,87%;(c)乙酸酐,H2SO4,CH2Cl2,83%;(d)N4-苯甲酰胞嘧啶,BSA,TMSOTf,MeCN,40%;(e)NaOH,THF/MeOH/H2O,80%;(f)(1)TCDI,DMAP,DCM;(2)Bu3SnH,AIBN,甲苯,70%;(g)MeOH中的饱和NH3,88%;(h)TMSI,2,6-二甲基吡啶,MeCN,48%;(I)氨基酸酯,二硫代二吡啶-2,PPh3,吡啶。

方案2

PMDTG(膦酰基甲氧基脱氧苏糖基鸟苷)的前药如方案3所示合成。使用三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)作为路易斯酸在70℃下在无水乙腈中用2-氨基-6-氯嘌呤进行苏糖衍生物3的Vorbrüggen糖基化,以67%的产率得到化合物33。TBS基团通过在THF中用Et3N·3HF处理来去除,且使用三氟甲磺酸二异丙基膦酰基甲基酯和NaH在THF中在-5℃下引入磷酸酯官能团,以67%的产率得到核苷35。2′位上的苯甲酰基团用2N NH3在甲醇中水解,Barton还原2′-脱氧,以68%的产率得到2′-脱氧核苷37。在37中的膦酸酯官能团水解后,通过用2-巯基乙醇和NaOMe在甲醇中回流,将6-氯基团转化为羟基,以49%的产率得到PMDTG 38。PMDTG的前药(39,40 and 41)是根据方案1中PMDTA和PDMTT的前药中描述的方案合成的。

试剂和条件:(a)2-氨基-6-氯嘌呤,DBU,TMSOTf,MeCN,67%;(b)Et3N·3HF,THF,97%;(c)(iPrO)2POCH2OTf,NaH,THF,67%;(d)MeOH中的2N NH3,75%;(e)(1)TCDI,DMAP,DCM;(2)Bu3SnH,AIBN,甲苯,68%;(f)TMSBr,2,6-二甲基吡啶,MeCN;(g)2-巯基乙醇,NaOMe,MeOH,两步的产率为49%;(h)氨基酸酯,二硫代二吡啶-2,PPh3,吡啶。

方案3

根据一实施方式,本发明包括通式I的化合物

其中

-B是如下定义的任意的天然的或修饰的碱基

-R1具有通式II

其中

R3选自芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C3-C8-环烷基、C3-C8环烷基-烷基、芳基(C1-C6)烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、羟基C1-C10烷基、卤代C1-C10烷基、和烷氧基烷基;

R4选自芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C3-C8-环烷基、C3-C8环烷基-烷基、芳基(C1-C6)烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、羟基C1-C10烷基、卤代C1-C10烷基、烷氧基烷基、X-COOR5、X-O(C=O)-R5

其中X为芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C8-环烷基,且其中所述芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C8-环烷基任选地包括一个或多个独立地选自卤素、卤代烷基、氰基、C1-C7烷氧基的官能团、原子或自由基;

其中R5选自芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C3-C8-环烷基、C3-C8环烷基-烷基、芳基(C1-C6)烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、羟基C1-C10烷基、卤代C1-C10烷基、和烷氧基烷基;

-R2为O-Ar,其中Ar是稠合双环芳基部分或单环芳基部分,其中任一个芳基部分是碳环或杂环,且任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基所取代;

或R2具有通式II

其中R1和R2可相同或不同;

或R1和R2具有通式III,

其中R1和R2可相同或不同;

Z为O;

R选自H、芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C3-C8-环烷基、C3-C8环烷基-烷基、芳基(C1-C6)烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、羟基C1-C10烷基、卤代C1-C10烷基、烷氧基烷基;

和/或其药学上可接受的加成盐和/或其立体异构体和/或其溶剂化物。

所述碱基(B)选自嘧啶和嘌呤碱基。这样的碱基包括天然碱基,如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤和经修饰的碱基或所述天然碱基的修饰。在本发明的某些实施方式中,所述碱基为鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、或尿嘧啶。在本发明的一更具体的实施方式中,所述碱基是胞嘧啶或尿嘧啶。在本发明的另一具体的实施方式中,所述碱基是尿嘧啶。在本发明的另一具体的实施方式中,所述碱基是胸腺嘧啶。在本发明的另一具体的实施方式中,所述碱基是腺嘌呤。在本发明的另一具体的实施方式中,所述碱基是鸟嘌呤。

在另一实施方式中,本发明涉及根据本发明的化合物,其包括式I的化合物,其中Ar为稠合双环芳基部分或单环芳基部分,其中任一个芳基部分是碳环或杂环,且任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基所取代。在更具体的实施方式中,所述Ar是苯基。在本发明的一具体的实施方式中,式I的化合物可取此处所述的R1和R2的任意值,其中Ar为苯基。

在更具体的实施方式中,所述R3为C1-C10烷基。在另一具体的实施方式中,所述R3为C3-C10烷基。在另一具体的实施方式中,所述R3为C1-C5烷基。在又一具体的实施方式中,所述R3为C3-C5烷基。

在另一具体的实施方式中,所述R4选自C1-C10烷基或X-COOR5,其中R5可取此处所述的任何值。在更具体的实施方式中,所述R5选自芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C3-C8-环烷基、C3-C8环烷基-烷基、芳基(C1-C6)烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、羟基C1-C10烷基、卤代C1-C10烷基、和烷氧基烷基。在更具体的实施方式中,R5为C1-C7烷基或C3-C8环烷基;在更具体的实施方式中,R5为C1-C5烷基,在另一更具体的实施方式中,R5为C3-C7烷基,在再一更具体的实施方式中,R5为C3-C5烷基。在又一更具体的实施方式中,R5为C5烷基。在另一具体的实施方式中,R5为芳基-(C1-C2)烷基;在另一更具体的实施方式,R5为苄基或苯基甲基。

在另一具体的实施方式中,X选自芳基、杂芳基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基或C3-C8-环烷基,其中所述芳基、杂芳基、C1-C10烷基、和C3-C8-环烷基任选地包括一种或多种独立地选自卤素、羰基、硫代羰基、羟基、巯基、醚、硫醚基、缩醛基、硫代缩醛基、氨基、亚氨基、肟基、烷基肟基、氨基酸、氰基、酰氨基、硫代酰氨基、氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基、脲基、硫代脲基、羧酸酯或羧酸卤化物或羧酸酐或羧酸酰胺、硫代羧酸或硫代羧酸酯或硫代羧酸酯或硫代羧酸卤化物或硫代羧酸酐或硫代羧酸酰胺、硝基、硫代C1-7烷基、硫代C3-C10环烷基、羟基氨基、巯氨基、烷基-氨基、环烷基氨基、烯基氨基、环烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、芳基烷基氨基、羟基烷基氨基、巯基烷基氨基、被杂环取代的烷基氨基、杂环氨基、被杂环取代的芳基氨基、肼、烷基肼、苯基肼、磺酰基、亚磺酰基和磺酰胺的官能团、原子或自由基。在更具体的实施方式中,X选自芳基、杂芳基、C1-C10烷基、或C3-C8-环烷基,更具体地,所述X为C1-C6烷基,进一步具体地,所述X为C1-C3烷基或C1-C2烷基或-CH2-。

根据本发明的特别的新化合物包括其制备在所附实施例中描述的每种化合物及其药学上可接受的盐和溶剂化物。

本发明还涉及制造结构式I所表示的化合物、或其任何子群的方法,包括所示的方案1的步骤(k)中的的最终步骤,方案2的步骤(l),或方案3的步骤(h)。所述最终步骤包括使(化合物15、16、30、和38的结构式所表示的)相应的核苷膦酸酯或其盐与以下结构式所表示的氨基酸酯反应

其中R3和R4如上文所定义,或是其盐,且任选地为由结构式HO-Ar(其中Ar如上文所定义)表示的单环或稠合双环芳族或杂芳族羟基化合物,例如苯酚或取代的苯酚。所述的最终反应步骤任选发生,但优选在用于对膦酸酯部分进行活化的活化体系的存在下进行。活化体系可以但不限于2,2’-二硫代二吡啶和三苯基膦的活化组合。所述最终反应步骤优选发生在反应溶剂中,例如但不限于,且优选在惰性气氛下(例如但不限于氮气),在约40℃到约80℃,取决于反应溶剂的沸点温度,并且持续足以基本上转化所有膦酸酯基团的时间。

本发明还涉及用作药物的具有式I的化合物、其任何子群或其立体异构形式。

本发明还涉及用作药物的具有式I的化合物、其任何子群或其立体异构形式,其用于防止或治疗动物、优选哺乳动物中的病毒性的失调和肿瘤失调。在一实施方式中,所述失调是病毒性的失调,包括病毒感染导致的疾病,例如HBV、HIV、HCV、RSV、登革热病毒、流感病毒、CMV、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、BK病毒、和/或HSV的感染;在另一实施方式中,所述失调是肿瘤失调,其可以是急性的或慢性的,包括增殖性失调,尤其是癌症。在一实施方式中,所述哺乳动物是人。

本发明还涉及式I的化合物、其任何子群、或其立体异构形式在制造用于防止或治疗动物中的病毒性的失调和/或肿瘤失调的药物中的用途。在一实施方式中,所述动物是哺乳动物,优选所述哺乳动物是人类。

本发明还涉及一种药物组合物,其包括治疗有效量的式I的化合物、其任何子群或其立体异构形式,以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。所述组合物还可包括选自抗病毒药物和抗肿瘤药物的一种或多种生物活性药物。

本发明还涉及防止或治疗动物中的病毒性的失调的方法,其包括给予治疗有效量的式I的化合物、其任何子群、或其立体异构形式,任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂结合。

本发明还涉及防止或治疗动物中的肿瘤失调的方法,其包括给予治疗有效量的式I的化合物、其任何子群、或其立体异构形式,任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂结合。

为了用于药物,式(I)的化合物的盐将是药学上可接受的盐。然而,其它盐可用于制备本发明化合物或其药学上可接受的盐。本发明化合物的合适的药学上可接受的盐包括酸加成盐,例如通过将本发明化合物的溶液与药学上可接受的酸如盐酸、硫酸、甲磺酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸或磷酸溶液混合来形成。而且,当本发明化合物携带酸性部分例如羧基时,其合适的药学上可接受的盐可以包括碱金属盐,如钠盐或钾盐;碱土金属盐,如钙或镁盐;和与合适的有机配体形成的盐,如季铵盐。

本发明在其范围内包括上述式(I)化合物的溶剂化物。这种溶剂化物可以用以下溶剂形成:普通的有机溶剂例如苯或甲苯这样的烃溶剂;氯化溶剂如氯仿或二氯甲烷;醇溶剂如甲醇、乙醇或异丙醇;醚溶剂如二乙醚或四氢呋喃;或酯溶剂如乙酸乙酯。或者,式(I)化合物的溶剂化物可以与水形成,在这种情况下它们将是水合物。

根据本发明的化合物有益于治疗和/或防止各种动物、哺乳动物或人类的疾病。这些疾病包括病毒性疾病,如由病毒感染引起的疾病,如HBV、HIV、HCV、RSV、登革热病毒、流感病毒、CMV、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、BK病毒和/或HSV的感染;和肿瘤失调如增殖性失调(如癌症)。

病毒性疾病包括由各种病毒家族造成的感染,包括嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、黄病毒科(Flaviviridae),小核糖核酸病毒科(Picornoviridae)。嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)中的各种属包括正肝去氧核糖核酸病毒属(Orthohepadna)病毒和禽肝病毒属(Avihepadna)病毒;正肝去氧核糖核酸病毒属的成员包括乙肝病毒(HBV)和土拨鼠肝炎病毒。禽肝病毒属的成员包括鸭乙型肝炎病毒。逆转录病毒科内的各种属包括α逆转录病毒、β列病毒、γ马尿病毒、δ逆转录病毒、ε逆转录病毒、慢病毒和泡沫病毒。慢病毒属的成员包括人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)和人类免疫缺陷病毒2(HIV-2)。黄病毒科中的各种属包括黄病毒、瘟病毒、肝炎病毒和庚型肝炎病毒。黄病毒属的成员包括登革热病毒、黄热病病毒、西尼罗河脑炎病毒和日本脑炎病毒。瘟病毒属的成员包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、古典猪瘟病毒和边界病病毒2(BDV-2)。肝炎病毒属的成员包括丙型肝炎病毒(HCV)。庚型肝炎病毒属的成员包括庚型肝炎病毒。小核糖核酸病毒科中的各种属包括口蹄疫病毒、艾滋病病毒、心脏病毒、肠道病毒、虫媒病毒、肝病毒、柯布病毒、帕雷赫病毒、沙佩鲁病毒、塞内卡病毒、特斯克病毒和曲马病毒。肠道病毒属的成员包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A病毒、柯萨奇B病毒和鼻病毒。

肿瘤失调可以是急性或慢性的,包括动物、包括哺乳动物、尤其是人的增殖性失调,尤其是癌症。癌症的具体种类包括血液系统恶性肿瘤(包括白血病和淋巴瘤)和非血液系统恶性肿瘤(包括实体瘤、肉瘤、脑膜瘤、多形性成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、黑色素瘤、胃癌和肾细胞癌)。慢性白血病可以是髓样或淋巴样的。白血病的种类包括淋巴母细胞性T细胞白血病、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性/淋巴性白血病(CLL)、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征、慢性嗜中性白血病、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、浆细胞瘤、免疫母细胞性大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性成巨核细胞白血病、急性巨核细胞白血病、早幼粒细胞白血病和红白血病。淋巴瘤的种类包括恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成淋巴细胞性T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT1淋巴瘤和边缘区淋巴瘤。非血液系统恶性肿瘤包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、淋巴结癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、脑癌、皮肤癌、骨癌、胃癌和肌肉癌。

本发明还提供药物组合物,其包含如上所述的根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及一种或多种药学上可接受的载体。

根据本发明的药物组合物可以采取适于口服、口腔、肠胃外、鼻腔、局部、眼部或直肠给药的形式、或适于通过吸入或吹入给药的形式。

预防或治疗特定病症或疾病所需的本发明中使用的化合物的量将根据所选择的化合物和待治疗的动物、哺乳动物或人类患者的状况而变化。但是,通常而言,日剂量可以在约10ng/kg至1000mg/kg范围内,典型的是100ng/kg至100mg/kg,例如口服或口腔给药大约0.01mg/kg至40mg/kg体重,非肠道给药大约10ng/kg至50mg/kg体重,和鼻腔给药或通过吸入或吹入给药大约0.05mg至大约1000mg从约0.5mg至约1000mg。

定义

本文使用的术语“嘧啶和嘌呤碱基”包括但不限于腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤和2,6-二氨基嘌呤及其类似物。本文使用的嘌呤或嘧啶碱基包括如上所述天然中存在的核苷中发现的嘌呤或嘧啶碱基。其类似物是以这样的方式模拟这种天然存在的碱基的碱基,即它们(原子的种类和排列)的结构类似于天然存在的碱基,但是可以具有另外的或不具有某些天然存在的碱基的功能性质。这样的类似物包括通过用氮原子取代CH部分(例如5-氮杂嘧啶如5-氮杂胞嘧啶)或相反(例如7-脱氮嘌呤如7-脱氮腺嘌呤或7-脱氮鸟嘌呤)或两者(例如,7-脱氮,8-氮杂嘌呤)。这样的碱基或类似物的衍生物是指其中环取代基被引入、除去、或被本领域已知的常规取代基如卤素、羟基、氨基、(C1-C6)烷基等修饰。这样的嘌呤或嘧啶碱基及其类似物是本领域技术人员公知的,例如WO 03/093290的第20-38页所示。

特别地,嘌呤和嘧啶类似物B可以以用于本发明目的为目的,选自由结构式(IV)表示的嘧啶碱基:

和由结构式(V)表示的嘌呤碱基:

其中:

R7和R9独立地选自H、–OH、-SH、-NH2、和-NH-Me;

R8和R10独立地选自H、甲基、乙基、异丙基、羟基、氨基、乙基氨基、三氟甲基、氰基和卤素;以及

X1和Y1独立地选自CH和N。

正如嘧啶类似物的一些非限制性实例,可以命名为具有式(IV)的取代的尿嘧啶,其中X1是CH,R7是羟基,并且R8选自甲基、乙基、异丙基、氨基、乙基氨基、三氟甲基、氰基、氟、氯、溴和碘。

本文所用的术语“烷基”是指具有所示碳原子数的直链(正常)或支链(例如仲或叔)烃链(或未指出,优选具有1-20个,更优选1个~6个碳原子)。术语“C1-C6烷基”是指这样的具有1至6个碳原子的烃链。其实例为甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基(i-Bu)、2-丁基(s-Bu)2-甲基-2-丙基(t-Bu)、1-戊基(正戊基)、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、正戊基、正己基。

如本文所用且除非另外指出,否则术语“环烷基”是指具有所示碳原子数的单环饱和烃单价基团(或未指明,优选具有3-20个,更优选3-10个碳原子,更优选3-8或3-6个碳原子)。“C3-C8环烷基”是指具有3至8个碳原子的单环饱和烃单价基团,例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基。

术语“烷氧基”是指烷基-O-基团,其中烷基如上所定义。本文所用的“(C1-C6)烷氧基”包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、3-戊氧基或己氧基。

如本文所用,除非另有说明,术语“卤素”或“卤代”是指选自氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)的任何原子。

如本文所用且除非另外指出,否则术语“Ar”或“芳基”是指具有1、2、3、4、5或6个环,优选1、2或3个环的单价不饱和芳族碳环基团,其可以稠合或双环。芳基可任选地被一个、两个或三个取代基所取代,如本发明中所述的可存在于Ar或芳基上的任选的取代基。优选的芳基是:含有6个碳原子的芳族单环;含有7、8、9或10个碳原子的芳族二环或稠环体系;或含有10、11、12、13或14个碳原子的芳族三环体系。芳基的非限制性例子包括苯基和萘基。Ar的优选的取代基团独立地选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基(-OH)、酰基(R'-C(=O)-、酰氧基(R'-C(=O)-O-)、硝基(-NO2)、氨基(-NH2)、-SO3H、-SH、-SR'、其中R'是烷基。优选Ar为苯基、溴苯基和萘基。

实施例

实验部分

NMR光谱在Bruker Advance 300(1H NMR,300MHz;13C NMR,75MHz;31P NMR,121MHz)或500MHz(1H NMR,500MHz;13C NMR,125MHz)或600MHz(1H NMR,600MHz;13C NMR,150MHz)光谱仪上以四甲基硅烷(TMS)作为内标或参考的残余溶剂信号。二维NMRs(H-COSY,NOESY,HSQC,和HMBC)用于分配中间体和最终化合物。质谱是在四极正交加速度飞行时间质谱仪上测量的。制备型HPLC纯化在用21×250mm的10μmC18反相树脂填充的柱上进行。柱色谱法在硅胶(100-200目或230-400目)上进行。使用前将反应溶剂蒸馏(从Na/苯甲酮中蒸馏THF和甲苯;从CaH2中蒸馏CH2Cl2和CH3CN;从KOH中蒸馏Et3N)。

实施例1:L-苏糖酸钙一水合物(1a)的合成

该化合物根据已知的程序合成(Schoning,K.U.;Scholz,P.;Wu,X.L.;Guntha,S.;Delgado,G.;Krishnamurthy,R.;Eschenmoser,A.Helv.Chim.Acta 2002,85,4111)。

向溶解在1.6升蒸馏水中的200克(1.14摩尔)L-抗坏血酸溶液中,边搅拌边缓慢加入227克(2.27摩尔)CaCO3,将浆料冷却至15℃。在12-18℃下,在6小时内向该混合物中加入455ml30%的H 2O 2水溶液,并将该混合物在室温下搅拌18小时。在搅拌下,将混合物用45g活性炭处理并加热至70℃,搅拌3小时。过滤热的悬浮液,用2×38ml蒸馏水洗涤固体。将洗液与滤液合并,减压浓缩至1.52L。搅拌得到的溶液,经5小时缓慢加入455ml MeOH。搅拌5小时后,缓慢加入另外的455ml的MeOH。过滤分离固体,用2×100ml MeOH洗涤,减压干燥至恒重。浓缩合并的滤液,缓慢加入MeOH,过滤分离得到的沉淀。重复该过程,前两批作物得到107.8g(61%)1a,为无色粉末。

实施例2:2-O-苯甲酰-L-苏糖酸内酯(1)

该化合物根据已知的程序制造(Schoning,K.U.;Scholz,P.;Wu,X.L.;Guntha,S.;Delgado,G.;Krishnamurthy,R.;Eschenmoser,A.Helv.Chim.Acta 2002,85,4111;以及Dumbre,S.G.,Jang,M.,Herdewijn,P.J.Org.Chem.2013,78,7137-7144)。

向570毫升温水中的27克(143毫摩尔)1a溶液中加入400毫升Dowex 50WX4-50树脂,在70℃下剧烈搅拌混合物30分钟。过滤除去树脂,并用H2O(50毫升×2)洗涤。将洗液与滤液合并,减压蒸发至干燥。将残余物与MeCN(200毫升×3)共蒸发。然后将残余物悬浮在285ml无水MeCN中,并加入0.57g(3.32毫摩尔)TsOH。将混合物回流23小时,冷却、过滤、减压除去溶剂。将残渣溶解于无水乙腈中,加入咪唑(24.48g,360毫摩尔),在0~-5℃下用10分钟缓慢加入苯甲酰氯(18.99毫升,163毫摩尔),搅拌反应混合物在室温下过夜。减压除去乙腈,将残余物溶于300mL EtOAc中,加入200mL水。所得混合物依次用2×150毫升冰冷的1M HCl溶液、150毫升水、150毫升饱和NaHCO3溶液、和200毫升饱和NaCl水溶液洗涤。有机层用无水NaSO4干燥并浓缩。通过柱色谱(2:1至1:2,己烷/EtOAc)纯化残余物,得到白色固体状的1(16.5g,45%收率)。

1H NMR(300MHz,DMSO):δ8.05(d,J=7.7Hz,2H,Ph),7.73(t,J=8.1Hz,1H,Ph),7.58(t,J=7.7Hz,2H,Ph),6.15(d,J=5.0Hz,1H,3′-OH),5.74(d,J=7.8Hz,1H,H2′),4.71-4.80(m,1H,H3′),4.56(t,J=8.1Hz,1H,H4a′),4.10(t,J=8.1Hz,1H,H4b′);

13C NMR(75MHz,DMSO):δ171.2(C-1),164.9(Bz-CO),(134.2,129.7,129.1,128.6)(Ph),75.2(C-2′),69.8(C-3′和C-4′).

实施例3:(羟基甲基)二异丙基膦酸酯的合成

该化合物根据已知的程序合成(Kiyokawa,K.;Suzuki,I.;Yasuda,M.;Baba,A.Eur.J.Org.Chem.2011,2163)。

向亚磷酸二异丙酯(50g,301毫摩尔)和多聚甲醛(12.2g,391毫摩尔)的混合物中加入三乙胺(4.82毫升,34.6毫摩尔)。将该混合物加热到110℃持续4小时。将该溶液用500ml EtOAc稀释并用盐水洗涤,用无水Na2SO4干燥并浓缩,得到无色油状的产物(53g,90%)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.68-4.79(m,2H,CH(CH3)2),4.61(d,J=3.9Hz,OH),3.84(t,1JP,H=6.1Hz,2H,PCH2),1.32-1.35[m,12H,CH(CH3)2];

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ71.1[CH(CH3)2,2JP,C=7.0Hz],57.5(PCH2,2JP,C=163.3Hz),23.9[CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ22.7

实施例4:三氟甲磺酸二异丙基膦酰基甲基酯的合成

该化合物根据已知的程序合成:Dumbre,S.G.,Jang,M.,Herdewijn,P.J.Org.Chem.2013,78,7137-7144.

在-78℃下向170mL无水二乙醚中的溶液中的(羟基甲基)二异丙基膦酸酯(10.0g,50.97毫摩尔)中加入1.6M n-BuLi(35.04mL,56.07mmol)溶液。将反应混合物在此温度下搅拌5分钟,并在5分钟内滴加三氟甲磺酰氯(5.97毫升,56.07毫摩尔)。将反应混合物在该温度下搅拌1小时,并用饱和NH4Cl停止反应。用盐水洗涤有机层,用NaSO 4干燥,并在室温下减压浓缩,得到三氟甲磺酸二异丙基膦酰基甲酯(16.1g,96%收率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.77-4.88[m,2H,CH(CH3)2],4.56(d,1JP,H=8.98Hz,2H,PCH2),1.36-1.40[m,12H,CH(CH3)2];

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ118.4(d,1JC,F=318.8Hz,CF3),73.0[d,2JP,C=6.7Hz,CH(CH3)2],67.0(d,2JP,C=169.8Hz,PCH2),23.7[CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ10.0

实施例5:2-O-苯甲酰-3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-L-苏糖酸内酯(2)的合成

该化合物根据已知的程序合成:Dumbre,S.G.,Jang,M.,Herdewijn,P.J.Org.Chem.2013,78,7137-7144;and Vina,D.;Wu,T.F.;Renders,M.;Laflamme,G.;Herdewijn,P.Tetrahedron 2007,63,2634.

在0℃下向无水乙腈中的内酯(29.8g,134毫摩尔)、催化剂DMAP(0.1g)、和咪唑(15.75g,231毫摩尔)溶液逐滴加入无水乙腈中的叔丁基二甲基氯硅烷(22.24g,148毫摩尔)溶液。将反应混合物温热至室温并搅拌过夜。减压除去乙腈,将残余物溶于500mL乙醚中,加入300mL水。将得到的混合物依次用冰冷的1M HCl溶液、水、饱和NaHCO3溶液、和饱和NaCl溶液洗涤。用Na2SO4干燥并浓缩有机层。通过柱色谱(己烷/EtOAc=4:1)纯化残余物,得到无色油状的2(44g,97%收率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.06-8.09(m,2H,Bz-H),7.58-7.63(m,2H,Bz-H),7.44-7.49(m,2H,Bz-H),5.59(d,J=7.3Hz,1H,H2′),4.80(q,J=7.2Hz,1H,H3′),4.53(dd,J=9.1,7.0Hz,1H,H4a′),4.09(dd,J=9.1,7.3Hz,1H,H4b′),0.86[s,9H,C(CH3)3],0.07(s,3H,SiCH3),0.06(s,3H,SiCH3);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ170.4(C-1),165.2(Bz-CO),[133.9,130.1,128.7(Ph)],75.1(C-2),71.7(C-3),70.6(C-4),25.6[C(CH3)3],18.0[C(CH3)3],-4.7(SiCH3),-4.9(SiCH3);

HRMS:[M+H]+针对C17H25O5Si计算,337.1466;发现,337.1460.

实施例6:1-O-乙酰基-2-O-苯甲酰-3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-L-呋喃苏糖(3)的合成

该化合物由化合物2合成,如文献中所述(Vina,D.;Wu,T.F.;Renders,M.;Laflamme,G.;Herdewijn,P.Tetrahedron 2007,63,2634)。

α异构体:1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.02-8.05(m,2H,Bz-H),7.54-7.60(m,2H,Bz-H),7.41-7.46(m,2H,Bz-H),6.49(d,J=4.4Hz,1H,H1′),5.26(t,J=4.7Hz,1H,H2′),4.68-4.73(m,1H,H3′),4.27(dd,J=9.1,6.5Hz,1H,H4a′),3.78(dd,J=9.0,4.7Hz,1H,H4b′),1.94(s,3H,CH3CO),0.87(s,9H,C(CH3)3),0.09(s,3H,SiCH3),0.08(s,3H,SiCH3);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ169.4(CH3CO),165.4(Bz-CO),[133.4,129.7,129.2,128.5(Ph)],94.65(C-1′),80.0(C-2′),73.4(C-3′),72.5(C-4′),25.6[C(CH3)3],20.9(CH3CO),17.9[C(CH3)3],-4.7(SiCH3),-5.0(SiCH3);

HRMS:[M+Na]+针对C19H28O6SiNa计算,403.1548;发现,403.1548.

实施例7:1′α-(N6-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-2′-O-苯甲酰-3′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-L-苏糖(4)的合成:

用0.73毫升(3.0毫摩尔)BSA处理在15ml无水(abs.)MeCN中的化合物3(0.51g,1.35毫摩尔)和无水N6-苯甲酰基腺嘌呤(0.355g,1.49毫摩尔)的悬浮液并加热至65℃。继续搅拌和加热(约1小时)直到澄清溶液,并加入0.49ml(2.7mmol)TMSOTf。在65℃下加热16小时后,将混合物冷却至室温并倒入冰冷的100毫升饱和NaHCO3水溶液/AcOEt 1:1。分离有机层,用AcOEt萃取水层,并与有机层一起用盐水洗涤并用Na2SO4干燥。蒸发溶剂并柱色谱(5:2CH2Cl2/AcOEt),得到饱色泡沫状的4(0.42g,56%产率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.60(s,1H,NH),8.67(s,1H,H2),8.37(s,1H,H8),7.94-8.00(m,4H,Bz-H),7.47-7.55(m,2H,Bz-H),7.36-7.40(m,4H,Bz-H),6.45(s,1H,H1′),5.56(s,1H,H2′),4.48(d,J=3.2Hz,1H,H3′),4.20-4.31(m,2H,H4′),0.77(s,9H,C(CH3)3),0.07(s,3H,SiCH3),–0.02(s,3H,SiCH3);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ164.7(C=O),152.3(C-2),151.2(C-4),149.2(C-6),141.6(C-8),[133.5,133.5,132.2,129.5,128.3,128.3,127.6(Ph)],122.9(C-5),87.8(C-1′),82.3(C-2′),76.3(C-4′),74.8(C-3′),25.3[C(CH3)3],17.6[C(CH3)3],-5.2(SiCH3),-5.6(SiCH3);

HRMS:[M+H]+针对C29H34N5O5Si计算,560.2324;发现,560.2330.

实施例8:1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-O-苯甲酰-3′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-L-苏糖(5)的合成:

将79mL无水乙腈中的3(10.38g,27.3毫摩尔)和胸腺嘧啶(3.44g,27.3毫摩尔)溶液用BSA(13.3mL,54.5毫摩尔)处理并在60℃下搅拌1小时。加入TMSOTf(14.8毫升,81.7毫摩尔),再继续加热2小时,此时反应完成。将反应混合物冷却至室温,倒入冰冷的600ml饱和NaHCO3水溶液/AcOEt 1:1。分离有机层,用水和盐水洗涤,在Na2SO4干燥并减压浓缩。通过柱色谱(己烷/EtOAc=4:1 to 3:2)纯化残余物,得到白色泡沫状的1(10.2g,83%收率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.50(s,1H,NH),8.02-8.05(m,2H,Bz-H),7.56-7.62(m,1H,Bz-H),7.52(d,J=1.2Hz,1H,H6),7.42-7.47(m,2H,Bz-H),6.19(d,J=0.9Hz,1H,H1′),5.23(s,1H,H2′),4.36(d,J=2.6Hz,1H,H3′),4.15-4.23(m,2H,H4′),1.92(d,J=1.2Hz,3H,T CH3),0.90(s,9H,C(CH3)3),0.16(s,3H,SiCH3),0.15(s,3H,SiCH3);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ165.0(Bz CO),164.3(C-4),150.4(C-2),136.5(C-6),[133.7,129.9,129.8,128.9,128.5,128.5(Ph)],110.2(C-5),89.6(C-1′),82.7(C-2′),76.5(C-3′),74.7(C-4′),28.0[C(CH3)3[,25.6[C(CH3)3],17.9[C(CH3)3],12.6(T CH3),-4.8(SiCH3),-5.3(SiCH3);

HRMS:[M+H]+针对C22H31N2O6Si计算,447.1946;发现,447.1941.

实施例9:1′α-(N6-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-2′-O-苯甲酰-L-苏糖(6)的合成:

在室温下向200毫升THF中的化合物4(11.6g,20.7毫摩尔)的溶液加入三氢氟化三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌24小时,发现反应完成。然后除去溶剂。将残余物溶于300毫升乙醚中,并加入200毫升水。分离有机层,用盐水洗涤,在Na2SO4干燥并减压浓缩。用柱色谱(50:1CH2Cl2/MeOH)纯化残余物以得到白色固体状的6(9.0g,97%产率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.62(s,1H,NH),8.63(s,1H,H2),8.42(s,1H,H8),7.92-7.96(m,4H,Bz-H),7.33-7.56(m,10H,Bz-H),6.67(d,J=6.9,1H,OH),6.21(s,1H,H1′),5.62(s,1H,H2′),4.61(brs,1H,H3′),4.20-4.33(m,2H,H4′);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ165.2(Bz-CO),164.8(Bz-CO-NH),151.7(C-2),150.5(C-4),149.5(C-6),143.0(C-8),[133.5,133.1,132.4,129.5,128.3,128.2,127.7(Ph)],123.0(C-5),89.4(C-1′),83.4(C-2′),75.8(C-4′),74.1(C-3′);

HRMS:[M+H]+针对C23H20N5O5计算,446.1459;发现,446.1451.

实施例10:1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-O-苯甲酰-L-苏糖(7)的合成

使用5(9.5g,21.3mmol)作为原料,如化合物6中所述制备该化合物。柱色谱纯化(50:1CH2Cl2/MeOH)得到无色固体状的化合物7(7.0g,99%产率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.93(s,1H,NH),7.96-7.98(m,2H,Bz-H),7.52-7.57(m,1H,Bz-H),7.47(d,J=0.9Hz,1H,H6),7.37-7.42(m,2H,Bz-H),5.99(d,J=1.2Hz,1H,H1′),5.48(s,1H,H2′),4.77(brs,1H,OH),4.47(brs,1H,H3′),4.31(d,J=10.0Hz,H4a′),4.16(dd,J=10.0,3.6Hz,H4b′),1.80(s,3H,T CH3);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ165.5(Bz CO),164.4(C-4),150.5(C-2),137.2(C-6),133.6,129.7,128.6,128.4,109.9(C-5),90.7(C-1′),82.6(C-2′),75.51(C-4′),73.9(C-3′),12.2(T CH3);

HRMS:[M+H]+针对C16H17N2O6计算,333.1081;发现,333.1082.

实施例11:1′α-(N6-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-2′-O-苯甲酰-3′-O-二异丙基-膦酰基甲基-L-苏糖(8)的合成:

该化合物类似于已知的程序合成(Wu,T.;Froeyen,M.;Kempeneers,V.;Pannecouque,C.;Wang,J.;Busson,R.;De Clercq,E.;Herdewijn,P.J.Am.Chem.Soc.2005,127,5056)。

在-10℃下,向无水THF(6mL)中的6(0.345g,0.77毫摩尔)和三氟甲磺酸二异丙基膦酰基甲基酯(0.254g,0.77毫摩尔)溶液加入NaH(60%于油中,0.102g,2.56毫摩尔),将反应混合物温热至0℃并搅拌0.5小时。用饱和NH 4Cl停止反应并进行浓缩。使残余物在水和EtOAc之间分配。用盐水洗涤有机层,用Na2SO4干燥并减压浓缩。用凝胶柱色谱(50:1CH2Cl2/MeOH)纯化残余物以得到无色油状的8(0.385g,80%产率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.32(brs,1H,NH),8.80(s,1H,H2),8.51(s,1H,H8),8.03-8.08(m,1H,Bz-H),7.47-7.66(m,6H,Bz-H),6.56(s,1H,H1′),5.80(s,1H,H2′),4.71-4.82(m,2H,OCH),4.49-4.51(m,2H,H3′and H4a′),4.35-4.40(m,1H,H4b′),3.95-4.01(m,2H,PCH2),1.31-1.36(m,12H,CH3);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ165.1(OBz CO),164.6(NBz CO),152.7(C-2),151.5(C-4),149.5(C-6),141.9(C-8),133.9,133.7,132.6,129.9,128.7,128.6,128.4,127.9,122.7(C-5),87.8(C-1′),83.7(d,3JP,C=9.5Hz,C-3′),80.2(C-2′),73.5(C-4′),71.5[CH(CH3)2],71.4[CH(CH3)2],64.6(d,1JP,C=169.4Hz,PCH2),(24.0,23.9)[CH(CH3)2];

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ17.8;

HRMS:[M+H]+针对C30H35N5O8P计算,624.2218;发现,624.2217.

实施例12:1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-O-苯甲酰-3′-O-二异丙基-膦酰基甲基-L-苏糖(9)的合成:

该化合物类似于已知的程序合成(Wu,T.;Froeyen,M.;Kempeneers,V.;Pannecouque,C.;Wang,J.;Busson,R.;De Clercq,E.;Herdewijn,P.J.Am.Chem.Soc.2005,127,5056)。

在0℃下,向无水THF(6mL)中的7(2.0g,6.02毫摩尔)和三氟甲磺酸二异丙基膦酰基甲基酯(1.1g,6.62毫摩尔)溶液加入NaH(60%于油中,0.794g,19.86毫摩尔),将反应混合物在0℃下搅拌20分钟。用乙酸乙酯中的0.5毫升乙酸停止反应。使残余物在水和EtOAc之间分配。用水和盐水洗涤有机层,用Na2SO4干燥并减压浓缩。用凝胶柱色谱(40:1CH2Cl2/MeOH)纯化残余物以得到白色固体状的9(2.6g,85%产率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.25(brs,1H,NH),8.01-8.04(m,2H,Bz-H),7.58-7.60(m,1H,Bz-H),7.43-7.48(m,3H,Bz-H and H6),6.26(d,J=1.5Hz,1H,H1′),5.39(s,1H,H2′),4.74-4.81(m,2H,CH(CH3)2),4.39(d,J=10.7Hz,1H,H4a′),4.26(d,J=3.6Hz,H3′),4.13(dd,J=10.7,3.7Hz,H4b′),3.88-4.06(m,2H,PCH2),1.97(d,J=0.9Hz,3H,T CH3),1.32-1.35(m,12H,CH(CH3)2);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ165.2(Bz CO),163.8(C-4),150.4(C-2),136.0(C-6),133.8,129.8,128.5,111.3(C-5),89.0(C-1′),83.7(d,3JP,C=10.9Hz,C-3′),80.2(C-2′),72.7(C-4′),[71.4,71.3CH(CH3)2],64.5(d,1JP,C=168.6Hz,PCH2),[23.9,23.9CH(CH3)2],12.5(T CH3);31P NMR(121MHz,CDCl3):δ17.9;

HRMS:[M+H]+针对C23H32N2O9P计算,511.1840;发现,511.1853.

实施例13:1′α-(N6-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-3′-O-二异丙基-膦酰基甲基-L-苏糖(10)的合成

在0℃下向在280ml THF/MeOH/H 2O(5:4:1)中的8(8.65g,13.87毫摩尔)的悬浮液中加入6.94毫升(13.87毫摩尔)2N NaOH水溶液。在20分钟后,用2的HCl水溶液中和溶液。混合物在减压下浓缩。使残余物在水和EtOAc之间分配。用水和盐水洗涤有机层,用Na2SO4干燥并减压浓缩。用硅凝胶柱色谱(30:1CH2Cl2/MeOH)纯化残余物以得到白色固体状的10(5.7g,80%产率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.53(brs,1H,NH),8.66(s,1H,H2),8.36(1H,H8),7.98-8.00(m,2H,Bz-H),7.44-7.58(m,3H,Bz-H),6.21(d,J=1.7Hz,1H,H1′),4.80(s,1H,H2′),4.63-4.73(2H,CH(CH3)2),4.28-4.34(m,3H,H4′and H3′),3.82(d,J=8.8Hz,2H,PCH2),1.24-1.31(m,12H,CH(CH3)2);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ164.8(Bz CO),152.1(C-2),151.2(C-4),149.1(C-6),142.1(C-8),[133.4,132.5,128.5,127.8(Ph)],122.7(C-5),90.5(C-1′),85.9(d,3JP,C=9.7Hz,C-3′),78.9(C-2′),72.5(C-4′),[71.4,71.4CH(CH3)2],64.4(d,1JP,C=169.5Hz,PCH2),[23.8,23.8,23.7,23.7CH(CH3)2];

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.4;

HRMS:[M+H]+针对C23H31N5O7P计算,520.1955;发现,520.1961.

实施例14:1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-3′-O-二异丙基膦酰基甲基-L-苏糖(11)的合成

该化合物类似于已知的程序合成(Wu,T.;Froeyen,M.;Kempeneers,V.;Pannecouque,C.;Wang,J.;Busson,R.;De Clercq,E.;Herdewijn,P.J.Am.Chem.Soc.2005,127,5056)。

用0.2mL水和0.4mL MeOH中的LiOH(8.7mg,0.364mmol)处理0.4mL乙腈中的9(0.186g,0.364mmol)溶液。在室温下搅拌反应混合物0.5小时并用乙酸中和反应混合物。去除溶剂,残留物在水和EtOAc之间分配。用水和盐水洗涤有机层,用Na2SO4干燥并减压浓缩。用凝胶柱色谱(20:1CH2Cl2/MeOH)纯化残余物以得到白色泡沫状的11(126mg,85%产率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ10.59(brs,1H,NH),7.41(d,J=1.2Hz,H6),5.84(s,1H,H1′),5.67(brs,1H,OH),4.64-4.77[m,2H,CH(CH3)2],4.39(s,1H,H2′),4.26-4.36(m,2H,H4′),4.14(d,J=2.4Hz,H3′),3.75(d,J=9.1Hz,2H,PCH2),1.93(d,J=1.0Hz,3H,T CH3),1.28-1.33[m,12H,CH(CH3)2];

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ164.6(C-4),151.0(C-2),136.4(C-6),110.0(C-5),93.0(C-1′),85.2(d,3JP,C=10.7Hz,C-3′),78.6(C-2′),73.6(C-4′),71.3(CH(CH3)2),71.2(CH(CH3)2),64.3(d,1JP,C=168.4Hz,PCH2),24.0[CH(CH3)2],23.94[CH(CH3)2],23.89[CH(CH3)2],23.82[CH(CH3)2],12.43(T CH3);

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.27;

HRMS:[M+H]+针对C16H28N2O8P计算,407.1578;发现,407.1582.

实施例15:1′α-(N6-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-二异丙基-膦酰基甲基-L-苏糖(12)的合成:

在室温下向无水CH2Cl2(2.70毫升)溶液中的化合物10(137毫克,0.26毫摩尔)和DMAP(10毫克,0.08毫摩尔)中加入1,1'-硫代羰基二咪唑(TCD)(94毫克,0.53毫摩尔)。将反应混合物回流过夜。用盐水洗涤缓和物,用Na2SO4干燥并减压浓缩。向甲苯(5毫升)中的残余物中加入偶氮二异丁腈(AIBN)(17毫克,0.11毫摩尔)和氢化三丁基锡(0.28毫升,1.05毫摩尔)。反应混合物回流20分钟,反应完成。减压除去溶剂,残余物通过硅凝胶色谱(30:1CH2Cl2/MeOH)纯化,得到白色固体状的12(130毫克,98%产率)。

1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.15(s,1H,NH),8.79(s,1H,H2),8.49(s,1H,H8),8.00-8.02(m,2H,Bz-H),7.57-7.59(m,1H,Bz-H),7.50-7.53(m,2H,Bz-H),6.55(dd,J=7.7,2.0Hz,1H,H1′),4.69-4.75[m,2H,CH(CH3)2],4.51-4.53(m,1H,H3′),4.38(d,J=10.5Hz,1H,H4a′),4.08(dd,J=10.5,4.1Hz,1H,H4b′),3.67-3.75(m,2H,PCH2),2.62-2.74(m,2H,H2′).1.28-1.33[m,12H,CH(CH3)2].

13C NMR(125MHz,CDCl3):δ164.5(Bz CO),152.5(C-2),151.5(C-4),149.3(C-6),142.1(C-8),[133.8,132.6,128.8,127.8(Ph)],122.8(C-5),83.7(C-1′),80.2(d,3JP,C=9.5Hz,C-3′),73.9(C-4′),[71.3,71.3(CH(CH3)2],64.0(d,1JP,C=169.2Hz,PCH2),38.6(C-2′),24.0(CH(CH3)2);

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.2;

HRMS:[M+H]+针对C23H31N5O6P计算,504.2006;发现,504.2023.

实施例16:1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-二异丙基-膦酰基甲基-L-苏糖(13)的合成:

该化合物类似于已知的程序合成(Wu,T.;Froeyen,M.;Kempeneers,V.;Pannecouque,C.;Wang,J.;Busson,R.;De Clercq,E.;Herdewijn,P.J.Am.Chem.Soc.2005,127,5056)。

使用11(1.53g,3.77mmol)作为原料,如化合物12中所述制备该化合物。柱色谱纯化(25:1CH2Cl2/MeOH)得到白色固体状的化合物13(1.44克,97%产率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.97(brs,1H,NH),7.55(d,J=1.2Hz,1H,H6),6.24(dd,J=8.1,2.6Hz,H1′),4.69-4.80[m,2H,CH(CH3)2],4.30-4.36(m,2H,H4a′and H3′),3.84(dd,J=10.8,3.6Hz,H4b′),3.71(d,J=9.2Hz,PCH2),2.50-2.60(m,1H,H2a′),2.16(d,J=15.3Hz,1H,H2b′),1.97(d,J=1.1Hz,T CH3),1.31-1.35(m,12H,CH(CH3)2);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ163.8(C-4),150.6(C-2),136.4(C-6),110.7(C-5),84.8(C-1′),80.2(d,3JP,C=11.4Hz,C-3′),73.4(C-4′),71.2[CH(CH3)2],64.0(d,1JP,C=169.8Hz,PCH2),38.3(C-2′),24.0[CH(CH3)2],12.5(T CH3);

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.2;

HRMS:[M+H]+针对C16H28N2O7P计算,391.1629;发现,391.1628.

实施例17:1′α-(腺嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-二异丙基-膦酰基甲基-L-苏糖(14)的合成:

该化合物类似于已知的程序合成(Wu,T.;Froeyen,M.;Kempeneers,V.;Pannecouque,C.;Wang,J.;Busson,R.;De Clercq,E.;Herdewijn,P.J.Am.Chem.Soc.2005,127,5056)。

搅拌饱和NH 3的MeOH溶液(300mL)中的12(2.17克,4.32毫摩尔),在室温下过夜。去除挥发物中,用凝胶柱色谱(20:1CH2Cl2/MeOH)纯化粗残余物以得到白色固体状的14(1.58g,92%产率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.35(s,1H,H8),8.31(s,1H,H2),6.48(dd,J=7.5,2.4Hz,1H,H1′),6.10(brs,2H,NH2),4.71-4.78(m,2H,CH(CH3)2),4.45-4.48(m,1H,H3′),4.36(d,J=10.5Hz,1H,H4a′),4.06(dd,J=10.5,4.3Hz,1H,H4b′),3.71-3.75(m,2H,PCH2),2.57-2.73(m,2H,H2′),1.28-1.35(m,12H,CH(CH3)2);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ155.5(C-6),153.0(C-2),149.7(C-4),139.5(C-8),119.5(C-5),83.4(C-1′),80.5(d,3JP,C=11.2Hz,C-3′),73.7(C-4′),[71.4,71.3(CH(CH3)2],64.1(d,1JP,C=169.6Hz,2H,PCH2),38.5(C-2′),(24.0,24.0,23.9CH(CH3)2];

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.2;

HRMS:[M+H]+针对C16H27N5O5P计算,400.1744;发现,400.1746.

实施例18:1′α-(腺嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-膦酰基甲基-L-苏糖三乙基铵盐(15)的合成:

该化合物类似于已知的程序合成(Wu,T.;Froeyen,M.;Kempeneers,V.;Pannecouque,C.;Wang,J.;Busson,R.;De Clercq,E.;Herdewijn,P.J.Am.Chem.Soc.2005,127,5056)。

在0℃下向无水CH3CN(3毫升)溶液中的14(30毫克,0.075毫摩尔)和2,6-二甲基吡啶(0.07毫升,0.60毫摩尔)中加入溴代三甲基硅烷(0.08毫升,0.60毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。用1.0M TEAB溶液(1毫升)停止反应。在室温下减压去除溶剂。将残余物在水和EtOAc/乙醚(1:1)之间分配,将水层冻干,并将残余物通过柱色谱(10:5:1CH2Cl2/MeOH/1M TEAB)纯化,得到粗品15。使用梯度CH3CN在0.05M TEAB溶液中2%至30%的制备性反相HPLC进行进一步纯化,得到白色泡沫状的15(19毫克,60%)。

1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.55(s,1H,H8),8.15(s,1H,H2),6.35(dd,J=8.2,2.2Hz,1H,H1′),4.51-4.53(m,1H,H3′),4.31(d,J=10.4Hz,1H,H4a′),4.06(dd,J=10.3,4.1Hz,1H,H4b′),3.45-3.53(m,2H,PCH2),2.75-2.81(m,1H,H2a′),2.64(d,J=15.1Hz,1H,H2b′);

13C NMR(125MHz,CDCl3):δ155.0(C-6),152.0(C-2),148.2(C-4),140.9(C-8),117.9(C-5),82.9(C-1′),79.0(d,3JP,C=10.3Hz,C-3′),73.3(C-4′),66.6(d,1JP,C=151.3Hz,PCH2),36.5(C-2′);

31P NMR(121MHz,D2O):δ13.1;

HRMS:[M-H]-针对C10H13N5O5P计算,314.0660;发现,314.0657.

实施例19:1′á-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-膦酰基甲基-L-苏糖三乙基铵盐(16)的合成:

该化合物类似于已知的程序合成(Wu,T.;Froeyen,M.;Kempeneers,V.;Pannecouque,C.;Wang,J.;Busson,R.;De Clercq,E.;Herdewijn,P.J.Am.Chem.Soc.2005,127,5056)。

在0℃下向无水CH3CN(20毫升)溶液中的13(205毫克,0.53毫摩尔)和2,6-二甲基吡啶(0.49毫升,4.20毫摩尔)中加入碘代三甲基硅烷(0.60毫升,4.20毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌7小时。用1.0M TEAB溶液(4毫升)停止反应。在室温下减压去除溶剂。将残余物在水和EtOAc/乙醚(1:1)之间分配,将水层冻干,并将残余物通过柱色谱(10:5:1CH2Cl2/MeOH/1M TEAB)纯化,得到粗品16。使用梯度CH3CN在0.05M TEAB溶液中2%至30%的制备性反相HPLC进行进一步纯化,得到白色泡沫状的16(138毫克,65%)。

1H NMR(300MHz,D2O):δ7.70(s,1H,H6),6.11(d,J=6.3Hz,1H,H1′),4.30(brs,2H,H4a′and H3′),3.86(d,J=7.5Hz,H4b′),3.51(d,J=9.1Hz,PCH2),2.50-2.55(m,1H,H2a′),2.20(d,J=15.1Hz,1H,H2b′),1.82(s,3H,T CH3);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ166.3(C-4),151.4(C-2),138.2(C-6),110.7(C-5),85.1(C-1′),79.4(d,3JP,C=11.5Hz,C-3′),73.4(C-4′),64.6(d,1JP,C=157.6Hz,PCH2),36.4(C-2′),11.4(T CH3);

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ15.3;

HRMS:[M-H]-针对C10H14N2O7P计算,305.0544;发现,305.0555.

实施例20:苯丙氨酸正丙酯盐酸盐的合成

该化合物根据已知的程序合成:Li,G.;Sha,Y.Molecules 2008,13,1111。

在0℃向苯丙氨酸(1.0克,6.05毫摩尔)和正丙醇(11毫升)的混合物中加入氯代三甲基硅烷(2.30毫升,18.15毫摩尔)。将反应混合物升温至室温并搅拌过夜。反应完成后(通过NMR监测),在旋转蒸发器上浓缩反应混合物。向残余物中加入50mL乙醚,过滤混合物,干燥滤饼,得到苯丙氨酸正丙酯盐酸盐(1.38g,93%)。

1H NMR(300MHz,DMSO):δ8.77(s,3H),7.24-7.33(m,5H),4.21(t,J=5.9Hz,1H),3.98(dt,J=6.6Hz,2.2Hz,2H),3.22-3.88(m,1H),3.02-3.10(m,1H),1.40-1.52(m,2H),0.73-0.79(m,3H);13C NMR(75MHz,CDCl3):δ169.2,134.9,129.5,128.7,127.3,67.1,53.4,36.1,21.3,10.2.

实施例21:天冬氨酸异戊酯盐酸盐的合成

该化合物根据已知的程序合成:Li,G.;Sha,Y.Molecules 2008,13,1111;和Maiti,M.;Maiti,M.;Rozenski,J.;Jonghe,S.D.;Herdewijn,P.Org.Biomol.Chem.2015,DOI:10.1039/c5ob00427f.。

在0℃向天冬氨酸(1.0g,7.51毫摩尔)和异戊醇(39毫升)的混合物中加入氯代三甲基硅烷(5.72毫升,45.08毫摩尔)。将反应混合物升温至室温并搅拌48小时。反应完成后(通过NMR监测),在旋转蒸发器上浓缩反应混合物。向残余物中加入50mL己烷,过滤混合物,干燥滤饼,得到天冬氨酸异戊酯盐酸盐(2.1g,90%)。

1H NMR(300MHz,DMSO):δ8.78(s,3H),4.29(t,J=5.7Hz,1H),4.07-4.24(m,4H),2.93-3.10(m,2H),1.60-1.69(m,2H),1.48(q,J=6.7Hz,4H),0.86-0.90(m,12H);

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ169.1,168.2,64.2,63.3,48.4,36.6,36.5,34.1,24.4,24.1,22.2,22.2,22.1

实施例22:1′α-(腺嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N,N′-双(正丙基-L-苯丙氨酸酯)]甲基膦酰二酰胺化}-L-苏糖(PMDTA双-Phe-正丙酯;化合物17)的合成

与制备核苷膦酸酯HIV逆转录酶抑制剂GS-9148的前药(Mackman,R.L.,Ray,A.S.,Hui,H.C.,Zhang,L.,Birkus,G.,Boojamra C.G.,Desai,M.C,Douglas,J.L.,Gao,Y.,Grant,D.,Laflamme,G.,Lin,K.Y.,Markevitch,D.Y.,Mishra,R.,McDermott,M.,Pakdaman,R.,Petrakovsky,O.V.,Vela,J.E.,Cihlar,T.Bioorg.Med.Chem.2010,18,3606-3617)中所述的程序类似地合成该化合物。

将PMDTA(23毫克,0.055毫摩尔,Et3N盐)和(S)-苯丙氨酸正丙酯盐酸盐(81毫克,6当量,0.331毫摩尔)的混合物与无水吡啶(2毫升×3)共蒸发然后再次溶于含有Et3N(92微升,0.662毫摩尔)的无水吡啶(1毫升)中。将得到的混合物在60℃下在氩气下搅拌过夜。在另一烧瓶中,将2,2'-二硫代二吡啶(85毫克,0.387毫摩尔)和PPh3(101毫克,0.387毫摩尔)溶于无水吡啶(1毫升)中,在室温下搅拌15分钟,得到淡黄色溶液,然后将该试剂溶液一次性加入到PMDTA溶液中。将得到的混合物在60℃下在氩气下搅拌过夜。接着减压浓缩该反应混合物。首先通过硅凝胶色谱(60:1至20:1DCM/MeOH)纯化所得残余物,然后通过制备性反相HPLC(线性梯度,5-95%CH3CN的水溶液)纯化,得到白色固体状的膦酸二酰胺前药17(28毫克,73%)。

1H NMR(500MHz,丙酮-d6):δ8.47(s,1H,H8),8.20(s,1H,H2),7.18-7.29(m,10H,Ph-H),6.42-6.44(m,1H,H1′),4.2-4.35(m,3H,Phe-CH,H3′,H4a′),4.04-4.15(m,1H,Phe-CH),3.95-4.03(m,5H,OCH2CH2CH3,H4b′),3.85-3.95(m,1H,Phe-NH),3.47-3.49(m,2H,PCH2),3.35-3.45(m,1H,Phe-NH),2.80-3.15(m,4H,Ph-CH2),2.68-2.75(m,1H,H2a′),2.40-2.45(m,1H,H2b′),1.55-1.64(m,4H,OCH2CH2CH3),and0.90-0.91(OCH2CH2CH3);

13C NMR(125MHz,丙酮-d6):δ(173.9,173.4)(Phe-CO),157.1(C-6),153.7(C-2),150.6(C-4),140.7(C-8),(138.3,137.9,130.6,130.6,129.1,129.0,127.4,127.3)(Ph),119.9(C-5),83.9(C-1′),81.4(d,3JP,C=13.8Hz,C-3′),74.1(C-4′),[67.1,67.1(OCH2CH2CH3)],66.9(d,1JP,C=136.3Hz),[55.3,54.7(Phe-CH)],[41.3,41.2(Ph-CH2)],38.9(C-2′),22.6(OCH2CH2CH3),13.8(OCH2CH2CH3);

31P NMR(121MHz,丙酮-d6):δ19.7;

HRMS:[M+H]+针对C34H45N7O7P计算,694.3112;发现,694.3120.

实施例23:1′α-(腺嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N-(异丙基-L-丙氨酸酯)](苯氧基)-甲基膦酰基酰胺化]}-L-苏糖(PMDTA Ala-异丙醇,OPh酯;化合物18)

与制备核苷膦酸酯HIV逆转录酶抑制剂GS-9148的前药(Mackman,R.L.,Ray,A.S.,Hui,H.C.,Zhang,L.,Birkus,G.,Boojamra C.G.,Desai,M.C,Douglas,J.L.,Gao,Y.,Grant,D.,Laflamme,G.,Lin,K.Y.,Markevitch,D.Y.,Mishra,R.,McDermott,M.,Pakdaman,R.,Petrakovsky,O.V.,Vela,J.E.,Cihlar,T.Bioorg.Med.Chem.2010,18,3606-3617)中所述的程序类似地合成该化合物。

将PMDTA(23毫克,0.067毫摩尔,Et3N盐)和丙氨酸异丙酯HCl盐(23毫克,2当量,0.134毫摩尔)和PhOH(32毫克,5当量,0.336毫摩尔)的混合物与无水吡啶(2毫升×3)共蒸发,然后再次溶于含有Et3N(112微升,0.804毫摩尔)的无水吡啶(1毫升)中。将混合物在60℃下在氩气下搅拌过夜。在单独的烧瓶中,将2,2'-二硫代二吡啶(123毫克,0.558毫摩尔)与PPh3(106毫克,0.403毫摩尔)在无水吡啶(1毫升)中混合,并将所得混合物在室温下搅拌15分钟,得到淡黄色溶液。然后将该溶液一次性加入到PMDTA溶液中。将反应混合物在60℃搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩。首先通过硅凝胶色谱(60:1至20:1DCM/MeOH)纯化所得残余物,然后通过制备性反相HPLC(线性梯度,5-95%CH3CN的水溶液)纯化,得到白色固体状的膦酸单酰胺前药18(16毫克,47%)和P(R)与P(S)异构体的混合物。

1H NMR(500MHz,丙酮-d6):δ8.44(s,1H,H8),8.20(s,1H,H2),7.16-7.36(m,5H,Ph-H),6.45-6.47(m,1H,H1′),4.89-4.95(m,1H,CH(CH3)2),4.66-4.85(m,1H,Ala-NH),4.52-4.56(m,1H,H3′),4.37-4.42(m,1H,H4a′),4.02-4.08(m,4H,H4b′,PCH2,Ala-CH),2.76-2.84(m,1H,H2a′),2.56-2.63(m,1H,H2b′),1.25-1.28(m,3H,Ala-CH3),1.15-1.19(m,6H,CH(CH3)2);

13C NMR(125MHz,丙酮-d6):δ[174.1,173.7(Ala-CO)],157.0(C-6),[153.7,153.6(C-2)],[151.73,151.55(Ph)],[150.62,150.59(C-4)][140.57,140.48(C-8)],[130.38,130.31,125.32,125.29,121.77,121.73,121.67,121.64(Ph)],[120.02,119.98(C-5)],[84.22,83.90(C-1′)],[81.88,81.85(d,3JP,C=13.44,13.03Hz,C-3′)],[74.36,73.90(C-4′)],[69.14,69.08(CH(CH3)2],[65.99,65.91(d,1JP,C=156.5,155.7Hz,PCH2)],[50.53,50.43(Ala-CH)],[39.10,39.07(C-2′)],[21.84,21.81(CH(CH3)2)],[21.27,20.95(Ala-CH3)];

31P NMR(121MHz,丙酮-d6):δ21.6,21.6;

HRMS:[M+H]+针对C22H30N6O6P计算,505.1959;发现,505.1965.

实施例24:1′α-(腺嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N-(二异戊基-L-天冬氨酸酯)](苯氧基)甲基膦酰基酰胺化}-L-苏糖(PMDTA Asp-异戊酯,OPh酯;化合物19)的合成

该化合物如前药18中所述的方法制备。产率=66%。

1H NMR(500MHz,丙酮-d6):δ8.40(s,1H,H8),8.19(s,1H,H2),7.14-7.37(m,5H,Ph-H),6.70(brs,2H,NH2),6.44-6.47(m,1H,H1′),4.73-4.87(m,1H,Asp-NH),4.51-4.57(m,1H,H3′),4.36-4.42(m,2H,H4a′,Asp-CH),3.97-4.12[m,7H,H4b′,PCH2,OCH2CH2CH(CH3)2],2.53-2.84(m,4H,Asp-CH2,H2′),1.58-1.68(m,2H,OCH2CH2CH(CH3)2),1.42-1.50(m,4H,OCH2CH2CH(CH3)2),0.86-0.89(m,12H,OCH2CH2CH(CH3)2);

13C NMR(125MHz,丙酮-d6):δ[172.7,172.4,171.1(Asp-CO)],[157.0,156.9(C-6)],[153.7,153.64(C-2)],[151.68,151.66(Ph)],150.63(C-4),[140.58,140.45(C-8)],[130.4,130.3,125.40,125.38,121.82,121.78,121.72,121.68(Ph)],[120.06,120.00(C-5)],[84.2,83.9(C-1′)],81.9(d,3JP,C=13.5Hz,C-3′),[74.4,73.9(C-4′)],[65.94,65.90(d,1JP,C=156.6,155.9Hz,PCH2)],[64.55,64.45,63.8(OCH2CH2CH(CH3)2)],[51.54,51.46(Asp-CH)],[39.55,39.10(Asp-CH2)],[37.93,37.90,37.87(OCH2CH2CH(CH3)2)],[25.64,25.62,25.55,25.53)(OCH2CH2CH(CH3)2)],[22.66,22.61(OCH2CH2CH(CH3)2)];

31P NMR(121MHz,丙酮-d6):δ21.16,21.15;

HRMS:[M+H]+针对C30H44N6O8P计算,647.2953;发现,647.2953.

实施例25:1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-[N,N′-双(正丙基-L-苯丙氨酸酯))甲基膦酰二酰胺]-L-苏糖(PMDTT双-Phe-正丙酯;化合物20)的合成

产率=34%。该化合物如前药17中所述的方法制备。

1H NMR(500MHz,丙酮-d6):δ9.92(s,1H,NH),7.61-7.62(m,1H,H6),7.20-7.29(m,10H,Ph-H),(6.16,6.15)(d,J=2.8Hz,1H,H1′),4.09-4.28(m,4H,H3′,H4a′and Phe-CH),3.98-4.05(m,4H,OCH2CH2CH3),3.74-3.80(m,2H,NH and H4b′),3.44-3.49(m,1H,NH),3.38(dd,J=8.7,1.1Hz,2H,PCH2),2.82-3.08(m,4H,Phe-CH2),2.52-2.57(m,1H,H2a′),2.00-2.06(m,1H,H2b′),1.84(d,J=1.2Hz,3H,T CH3),1.57-1.66(m,4H,OCH2CH2CH3),0.86-0.93(m,6H,OCH2CH2CH3);

13C NMR(125MHz,丙酮-d6):δ[173.6,173.3(Phe-CO)],164.2(C-4),151.3(C-2),[138.0,137.8(Ph)],137.2(C-6),[130.4,130.3,128.90,128.86,127.30,127.27(Ph)],110.5(C-5),85.1(C-1′),80.9(d,JP,C=12.1Hz,C-3′),73.4(C-4′),[66.94,66.92(OCH2CH2CH3)],66.6(PCH2,1JP,C=136.9Hz),[54.93,54.64(Phe-CH)],[41.2,41.0(Phe-CH2)],38.3(C-2′),[22.39,22.34(OCH2CH2CH3)],12.4(T CH3),[10.45,10.41(OCH2CH2CH3)].

31P NMR(121MHz,丙酮-d6):δ19.6.

HRMS:[M+H]+针对C34H46N4O9P计算,685.2997;发现,685.3006.

实施例26:1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N-(异丙基-L-丙氨酸酯)](苯氧基)甲基膦酰基酰胺化}-L-苏糖(PMDTT Ala-异丙酯,OPh酯;化合物21)的合成

该化合物如前药18中所述的方法制备。产率=41%。

1H NMR(500MHz,丙酮-d6):δ9.91(s,1H,NH),7.68–7.69(m,1H,H6),7.16–7.35(m,5H,Ph-H),6.20-6.23(m,1H,H1′),4.92–4.94(m,1H,CH(CH3)2),4.59-4.71(m,1H,NH),4.39–4.44(m,1H,H3′),4.34–4.38(m,1H,H4a′),3.96–4.05(m,3H,Ala-CH and PCH2),3.82–3.87(m,1H,H4b′),2.60–2.66(m,1H,H2a′),2.14–2.20(m,1H,H2b′),1.80–1.81(m,3H,T CH3),1.25–1.30(m,3H,Ala-CH3),1.18–1.20[m,6H,CH(CH3)2];

13C NMR(125MHz,丙酮-d6):δ174.0,173.7(Ala-CO),164.4(C-4),[151.6,151.5(C-2)],[137.47,137.42(C-6)],[130.34,130.30,125.36,125.33,121.78,121.75,121.64,121.60(Ph)],[110.64,110.60(C-5)],[85.35,85.26(C-1′)],81.6(d,3JP,C=12.6Hz,C-3′),[73.9,73.6(C-4′)],[69.15,69.13(OCH(CH3)2)],[66.84,65.79(PCH2,1JP,C=155.8,156.4Hz)],[50.48,50.44(Ala-CH)],38.5(C-2′),[21.87,21.84,21.80(OCH(CH3)2)],[21.3,21.2(Ala-CH3)],12.60(T CH3);

31P NMR(121MHz,丙酮-d6):δ21.63,20.69;

HRMS:[M+H]+针对C22H31N3O8P计算,496.1843;发现,496.1850.

实施例27:1′α-(胸腺嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-{[N-(二异戊基-L-天冬氨酸酯)](苯氧基)甲基膦酰基酰胺化}-L-苏糖(PMDTT Asp-异戊酯,OPh酯;化合物22)的合成

该化合物如前药18中所述的方法制备。产率=60%。

1H NMR(500MHz,丙酮-d6):δ10.00(s,1H,NH),7.68-7.69(m,1H,H6),7.17–7.35(m,5H,Ph-H),6.21-6.23(m,1H,H1′),4.73-4.86(m,1H,NH),4.34–4.46(m,3H,H3′,H4a′and Asp-CH),4.02–4.17[m,6H,PCH2and OCH2CH2CH(CH3)2],3.81-3.87(m,1H,H4b′),2.78–2.82(m,2H,Asp-CH2),2.60–2.65(m,1H,H2a′),2.12–2.20(m,1H,H2b′),1.80–1.81(m,3H,T CH3),1.62–1.69[m,2H,OCH2CH2CH(CH3)2],1.44–1.51[m,4H,OCH2CH2CH(CH3)2],0.88-0.90[m,12H,OCH2CH2CH(CH3)2];

13C NMR(125MHz,丙酮-d6):δ[172.5,172.4,171.09,171.03(Asp-CO)],164.4(C-4),151.5(C-2),[137.45,137.41(C-6)],[130.33,130.31,125.44,125.42,121.80,121.77,121.67,121.64(Ph)],[110.74,110.67(C-5)],[85.29,85.20(C-1′)],[81.7,81.6(C-3′)],[73.9,73.5(C-4′)],[65.68,64.84(PCH2,1JP,C=155.5,157.0Hz)],[64.51,64.47,63.80(OCH2CH2CH(CH3)2)],51.4(Asp-CH),[25.63,25.54(OCH2CH2CH(CH3)2)],22.7(OCH2CH2CH(CH3)2),12.6(T CH3);

31P NMR(121MHz,丙酮-d6):δ22.18,21.22;

HRMS:[M+H]+针对C30H45N3O10P计算,638.2837;发现,638.2820.

实施例28:合成of 1-O-甲基-2-O-苯甲酰-L-苏糖(23)的合成

向无水甲醇(59毫升)中的2b(8.04克,23.75毫摩尔)的溶液中加入乙酰氯(1.69毫升,23.75毫摩尔)。在室温下搅拌2小时后,加入Et3N(4毫升)并在减压下浓缩混合物,将残余物在水和EtOAc之间分配。用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤有机层,用Na2SO4干燥并减压浓缩。通过柱色谱(3:1to 2:1,己烷/EtOAc)纯化残余物,得到无色油状的23(4.7g,83%收率)。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.00–8.06(m,2H,Ph),7.56–7.62(m,1H,Ph),7.42–7.48(m,2H,Ph),5.14(brs,1H,H-1′),5.11(s,1H,H-2′),4.30–4.38(m,2H,H-3′and H-4a′),3.96–4.02(m,1H,H-4b′),3.45(s,3H,OMe).

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ166.1(PhCO),133.5,129.8,129.1,128.5(Ph),106.5(C-1′),83.6(C-2′),75.2(C-3′),73.8(C-4′),55.0(OMe).

HRMS:[M+Ma]+针对C12H14O6Na计算,261.0734;发现,261.0738.

实施例29:1-O-甲基-2-O-苯甲酰-3-O-二异丙基膦酰基甲基-L-苏糖(24)

在-5℃下,向无水THF(50毫升)中的23(2.23g,9.36毫摩尔)和三氟甲磺酸二异丙基膦酰基甲基酯(4.61g,140.4毫摩尔)溶液加入NaH(60%于矿物油中,0.45g,11.23毫摩尔),将反应混合物温热至0℃并搅拌15分钟。用饱和NH4Cl水溶液停止反应,并浓缩。使残余物在水和EtOAc之间分配。用盐水洗涤有机层,用Na2SO4干燥并减压浓缩。通过硅凝胶柱色谱(2:1至1:1,己烷/EtOAc)纯化残余物,得到无色油状的24(3.43克,87%产率),其含有约10%的β-端基异构体。

α-端基异构体:

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.02–8.05(m,2H,Ph),7.57–7.62(m,1H,Ph),7.43–7.48(m,2H,Ph),5.29(s,1H,H-2′),5.04(s,1H,H-1′),4.69–4.81[m,2H,CH(CH3)2],(4.28–4.41)(m,2H,H-4a′amd H-3′),3.84–4.15(m,3H,H-4b′and PCH2),3.40(s,3H,OMe),1.31–1.34[m,2H,CH(CH3)2].

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ165.5(PhCO),133.5,129.8,129.3,128.5(Ph),107.0(C-1′),84.8(3JP,C=10.3Hz,C-3′),81.0(C-2′),71.4,71.1[CH(CH3)2],71.1(C-4′),65.0(1JP,C=167.9Hz,PCH2),54.7(OMe),24.0[CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.5.

β-端基异构体:

1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.06–8.08(m,2H,Ph),7.58–7.61(m,2H,Ph),7.45–7.48(m,2H,Ph),5.27(d,J=4.5Hz,1H,H-1′),5.10(t,J=4.6Hz,1H,H-2′),4.71–4.78[m,2H,CH(CH3)2],4.56–4.58(m,1H,H-3′),4.22(dd,J=9.9,6.7Hz,1H,H-4a′),3.89(dd,J=9.9,3.6Hz,1H,H-4b′),3.76–3.89(m,2H,PCH2),3.33(s,3H,OMe),1.29–1.34[m,2H,CH(CH3)2].

13C NMR(125MHz,CDCl3):δ165.8(PhCO),133.4,129.8,129.3,128.5(Ph),101.8(C-1′),83.2(3JP,C=12.5Hz,C-3′),79.5(C-2′),71.4,71.3[CH(CH3)2],68.5(C-4′),64.6(1JP,C=169.9Hz,PCH2),55.4(OMe),24.0[CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.1.

HRMS:[M+H]+针对C19H30O8P计算,417.1673;发现,417.1673.

实施例30:1-O-乙酰基-2-O-苯甲酰-3-O-二异丙基膦酰基甲基-L-苏糖(25)

向无水CH2Cl2(5毫升)中的24(0.20克,0.48毫摩尔)的溶液中加入乙酸酐(0.18毫升,1.92毫摩尔)和催化量的硫酸。在室温下搅拌过夜后,将反应混合物在0℃下用Et3N(3毫升)中和,并减压浓缩。用EtOAc(20毫升)稀释粗产物,用盐水洗涤,用Na2SO4干燥并减压浓缩。通过硅凝胶柱色谱(2:1至1:1,己烷/EtOAc)纯化残余物,得到无色油状的25(0.18克,83%产率),且混合物含有约10%的β-端基异构体。主要的α-端基异构体如下特征。

α-端基异构体:

1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.02–8.04(m,2H,Ph),7.59–7.62(m,1H,Ph),7.45-7.48(m,2H,Ph),6.31(s,1H,H-1′),5.42(d,J=0.9Hz,1H,H-2′),4.74–4.80[m,2H,CH(CH3)2],4.44(dd,J=10.1,6.7Hz,H-4a′),4.30–4.32(m,1H,H-3′),4.12(dd,J=10.1,4.3Hz,1H,H-4b′),3.86–4.10(m,2H,PCH2),2.12(s,3H,CH3CO),1.33–1.35[m,2H,CH(CH3)2].

13C NMR(125MHz,CDCl3):δ169.7(COCH3),165.3(PhCO),133.7,129.8,128.9,128.6(Ph),99.8(C-1′),84.3(3JP,C=11.6Hz,C-3′),80.3(C-2′),73.1(C-4′),71.3,71.2[CH(CH3)2],65.2(1JP,C=168.6Hz,PCH2),24.0[CH(CH3)2],21.1(CH3CO).

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.2.HRMS:[M+Ma]+针对C20H29O9PNa计算,467.1442;发现,439.1444.

实施例31:1′α-(N6-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-2′-O-苯甲酰-3′-O-二异丙基膦酰基-甲基-L-苏糖(26)

用BSA(0.25毫升,1.01毫摩尔)处理N6-苯甲酰胞嘧啶(97毫克,0.45毫摩尔)的无水CH3CN(2毫升)悬浮液并加热至65℃。搅拌1小时后,加入25(100毫克,0.23毫摩尔)的无水CH3CN(1毫升)溶液,然后在0℃加入TMSOTf(0.12毫升,0.68毫摩尔)。将混合物在0℃搅拌过夜。将反应混合物倒入冰冷的50mL饱和NaHCO3水溶液:AcOEt(1:1)。用盐水洗涤有机层,用Na2SO4干燥并浓缩。用柱色谱(50:1,DCM/MeOH)纯化残余物以得到白色泡沫状的26(54毫克,40%产率)。

1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.72(brs,1H,NH),8.04–8.06(m,3H,H-6and Ph),7.90(d,J=7.4Hz,Ph),7.59–7.63(m,3H,H-5and Ph),7.52(t,J=7.9Hz,2H,Ph),7.47(t,J=8.1Hz,2H,Ph),6.32(s,1H,H-1′),5.51(s,1H,H-2′),4.70–4.76[m,2H,CH(CH3)2],4.52(d,J=10.0Hz,H-4a′),4.30–4.33(m,2H,H-4b′and H-3′),3.85–3.95(m,2H,PCH2),1.31–1.34[m,12H,CH(CH3)2].

13C NMR(125MHz,CDCl3):δ165.1(PhCO),162.4(C-4),155.0(C-2),145.1(C-6),133.7,133.2,129.9,129.0,128.8,128.5,127.5(Ph),96.2(C-5),90.9(C-1′),83.3(3JP,C=9.6Hz,C-3′),79.6(C-2′),74.5(C-4′),73.9(C-3′),71.3[CH(CH3)2],64.6(1JP,C=168.5Hz,PCH2),24.0[CH(CH3)2].31P NMR(121MHz,CDCl3):δ17.9.

HRMS:[M+H]+针对C29H35N3O9P计算,600.2105;发现,600.2130.

实施例32:1′α-(N6-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-3′-O-二异丙基膦酰基甲基-L-苏糖(27)。

该化合物如10中所述的方法制备,80%产率。

1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.31(brs,1H,NH),8.02(d,J=7.5Hz,1H,H-6),7.93–7.95(m,2H,Ph),7.57–7.60(m,3H,H-5and Ph),7.49(t,J=8.0Hz,2H,Ph),5.87(s,1H,H-1′),5.52(brs,1H,OH),4.64–4.72[m,2H,CH(CH3)2],4.52(s,1H,H-2′),4.34–4.39(m,2H,H-4′),4.18(s,1H,H-3′),3.73–3.87(m,2H,PCH2),1.26–1.30[m,12H,CH(CH3)2].

13C NMR(125MHz,CDCl3):δ166.7(PhCO),162.7(C-4),155.8(C-2),144.8(C-6),133.1,132.9,128.8,127.8)(Ph),96.3(C-5),94.6(C-1′),85.5(3JP,C=10.4Hz,C-3′),78.7(C-2′),74.0(C-4′),71.2[CH(CH3)2],64.2(1JP,C=168.8Hz,PCH2),23.9[CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.5.

HRMS:[M+H]+针对C22H31N3O8P计算,496.1843;发现,496.1856.

实施例33:1′α-(N6-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-二异丙基膦酰基甲基-L-苏糖(28)

该化合物如12中所述的方法制备,70%产率。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.63(brs,1H,NH),8.09(d,J=7.2Hz,1H,H-6),7.91(d,J=7.6Hz,2H,Ph),7.60–7.66(m,1H,Ph),7.51–7.56(m,3H,H-5and Ph),6.21(dd,J=7.1Hz,1.8Hz,1H,H-1′),4.66–4.79[m,2H,CH(CH3)2],4.49(dd,J=10.5,1.2Hz,1H,H-4a′),4.39(t,J=4.0Hz,1H,H-3′),4.06(dd,J=10.5,3.5Hz,1H,H-4b′),3.57–3.70(m,2H,PCH2),2.52–2.61(m,1H,H-2a′),2.46(d,J=15.2Hz,1H,H-2b′),1.28–1.36[m,12H,CH(CH3)2].

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ166.1(PhCO),162.1(C-4),155.4(C-2),145.3(C-6),133.1,129.1,127.4(Ph),95.6(C-5),87.8(C-1′),80.2(3JP,C=9.7Hz,C-3′),75.1(C-4′),71.2[CH(CH3)2],63.8(1JP,C=169.2Hz,PCH2),38.7(C-2′),24.0[CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.3.

HRMS:[M+H]+针对C22H31N3O7P计算,480.1894;发现,480.1889.

实施例34:1′α-(胞嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-二异丙基膦酰基甲基-L-苏糖(29)。

该化合物如14中所述的方法制备,88%产率。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.68(d,J=7.4Hz,1H,H-6),6.19(dd,J=7.4,1.9Hz,1H,H-1′),5.78(d,J=7.5Hz,1H,H-5),4.61–4.76[m,2H,CH(CH3)2],4.35(dd,J=10.4,1.3Hz,1H,H-4a′),4.27–4.30(m,1H,H-3′),3.93(dd,J=10.4,3.6Hz,1H,H-4b′),3.63(d,J=9.2Hz,2H,PCH2),2.44–2.54(m,1H,H-2a′),2.89(d,J=15.1Hz,1H,H-2b′),1.26–1.33[m,12H,CH(CH3)2].

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ165.8(C-4),156.1(C-2),141.7(C-6),93.6(C-5),86.6(C-1′),80.3(3JP,C=11.6Hz,C-3′),74.1(C-4′),(71.3,71.1)[CH(CH3)2],63.7(1JP,C=170.2Hz,PCH2),38.6(C-2′),24.0[CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.4.

HRMS:[M+H]+针对C15H27N3O6P计算,376.1632;发现,376.1629.

实施例35:1′α-(胞嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-膦酰基甲基-L-苏糖(30)

该化合物如16中所述的方法制备,48%产率。

1H NMR(600MHz,D2O):δ7.95(d,J=7.5Hz,1H,H-6),6.19(dd,J=8.0,2.0Hz,1H,H-1′),6.04(d,J=7.6Hz,1H,H-5),4.40(d,J=10.2Hz,1H,H-4a′),4.36–4.38(m,1H,H-3′),3.95(dd,J=10.4,3.6Hz,1H,H-4b′),3.45–3.52(m,2H,PCH2),2.52–2.58(m,1H,H-2a′),2.46(d,J=15.4Hz,1H,H-2b′).

13C NMR(150MHz,D2O):δ165.8(C-4),157.3(C-2),142.4(C-6),95.6(C-5),85.9(C-1′),79.2(3JP,C=11.6Hz,C-3′),73.6(C-4′),64.9(1JP,C=155.3Hz,PCH2),36.6(C-2′).

31P NMR(121MHz,D2O):δ14.6.

HRMS:[M-H]-针对C9H13N3O6P计算,290.0547;发现,290.0545.

实施例36:1′α-(胞嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N,N′-双(正丙基-L-丙氨酸酯)]甲基-膦酰基二酰胺}-L-苏糖(PMDTC双-Ala-异丙酯;化合物31)

该化合物如17中所述的方法制备,26%产率。

1H NMR(600MHz,CD3OD):δ7.84(d,J=7.4Hz,1H,H-6),6.09(d,J=6.6Hz,1H,H-1′),5.90(d,J=7.4Hz,1H,H-5),4.96–5.02[m,2H,CH(CH3)2],4.41(d,J=10.3Hz,1H,H-4a′),4.25–4.28(m,1H,H-3′),3.84–3.95(m,3H,H-4b′and Ala-CH),3.61–3.75(m,2H,PCH2),2.48–2.55(m,1H,H-2a′),2.19(d,J=15.0Hz,1H,H-2b′),1.33–1.36(m,6H,Ala-CH3).1.23–1.26[m,12H,CH(CH3)2].

13C NMR(150MHz,CD3OD):δ175.3,175.2(Ala-CO),167.7(C-4),158.4(C-2),143.3(C-6),95.6(C-5),88.1(C-1′),82.3(3JP,C=13.4Hz,C-3′),75.0(C-4′),70.2[CH(CH3)2],66.8(1JP,C=137.0Hz,PCH2),50.2,49.9(Ala-CH),39.8(C-2′),22.0[CH(CH3)2],21.4,21.2(Ala-CH3).

31P NMR(121MHz,CD3OD):δ23.1.

HRMS:[M+H]+针对C21H37N5O8P计算,518.2374;发现,518.2385.

实施例37:1′α-(胞嘧啶-1-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N-(异丙基-L-丙氨酸酯)](苯氧基)-甲基膦酰基酰胺化}-L-苏糖(PMDTC Ala-异丙醇,OPh酯;化合物32)

该化合物如18中所述的方法制备,15%产率。

1H NMR(300MHz,CD3OD):δ(7.83,7.79)(d,J=7.5Hz,1H,H-6),7.32–7.38(m,2H,Ph),7.14–7.21(m,3H,Ph),6.07–6.12(m,1H,H-1′),(5.80,5.79)(d,J=7.5Hz,1H,H-5),4.85–4.99[m,1H,CH(CH3)2],4.38–4.44(m,1H,H-4a′),4.27–4.35(m,1H,H-3′),3.80–3.99(m,4H,H-4b′,PCH2and Ala-CH),2.48–2.58(m,1H,H-2a′),2.19–2.24(m,1H,H-2b′),1.18–1.29[m,9H,Ala-CH3and CH(CH3)2)].31P NMR(121MHz,CD3OD):δ23.9,22.7.

HRMS:[M+H]+针对C21H30N4O7P计算,481.1846;发现,481.1848.

实施例38:1′α-(2-氨基-6-氯嘌呤-9-基)-2′-O-苯甲酰-3′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-L-苏糖(33)

向无水MeCN(9毫升)中的3(0.35克,0.92毫摩尔)、2-氨基-6-氯-9H-嘌呤(0.17克,1.01毫摩尔)和DBU(0.41毫升,2.76毫摩尔)溶液中加入TMSOTf(0.66毫升,3.68毫摩尔)。将所得的澄清棕色溶液在70℃下搅拌1.5小时,然后冷却至室温,加入饱和NaHCO3水溶液(20毫升)。用EtOAc(3×10mL)萃取水相,用Na2SO4干燥,过滤并减压蒸发。用硅凝胶柱色谱法(10:1至5:1,己烷/EtOAc)纯化残余物,得到所需的产物33(0.30g,67%),为白色泡沫状物。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.22(s,1H,H-8),8.03(d,J=7.2Hz,2H,Ph),7.60(t,J=7.3Hz,1H,Ph),7.45(t,J=7.5Hz,2H,Ph),6.29(s,1H,H-1′),5.54(s,1H,H-2′),5.50(brs,2H,NH2),4.52(s,1H,H-3′),4.33(dd,J=9.8,3.7Hz,1H,H-4a′),4.25(d,J=9.8Hz,1H,H-4b′).0.88(s,9H,TBS),0.15(s,3H,TBS),0.11(s,3H,TBS).

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ164.9(PhCO),159.1(C-2),153.2(C-4),151.0(C-6),141.0(C-8),133.7,129.7,128.6,128.5(Ph),125.0(C-5),87.7(C-1′),82.5(C-2′),76.5(C-4′),75.1(C-3′),25.5(TBS),17.8(TBS),–5.0(TBS),–5.3(TBS).

HRMS:[M+H]+针对or C22H29ClN5O4Si计算,490.1672;发现,490.1681.

实施例39:1′α-(2-氨基-6-氯嘌呤-9-基)-2′-O-苯甲酰-L-苏糖(34)

该化合物如6中所述的方法制备,97%产率。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.98(s,1H,H-8),8.01(d,J=7.2Hz,2H,Ph),7.63(t,J=7.3Hz,1H,Ph),7.47(t,J=7.5Hz,2H,Ph),5.92(d,J=1.7Hz,1H,H-1′),5.58(s,1H,H-2′),5.42(brs,2H,NH2),4.57(d,J=3.2Hz,1H,H-3′),4.33(d,J=9.8Hz,1H,H-4a′),4.22(dd,J=9.8,3.7Hz,1H,H-4b′).

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ165.7(PhCO),158.4(C-2),152.5(C-4),151.9(C-6),142.1(C-8),134.0,129.8,128.6,128.4(Ph),126.0(C-5),90.4(C-1′),83.8(C-2′),75.8(C-4′),74.6(C-3′).

HRMS:[M+H]+针对C16H15ClN5O4计算,376.0807;发现,376.0808.

实施例40:1′α-(2-氨基-6-氯嘌呤-9-基)-2′-O-苯甲酰-3′-O-二异丙基-膦酰基甲基L-苏糖(35)

该化合物如24中所述的方法制备,67%产率。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.12(s,1H,H-8),8.05(d,J=7.2Hz,2H,Ph),7.64(t,J=7.4Hz,1H,Ph),7.47(t,J=7.9Hz,2H,Ph),6.22(d,J=1.3Hz,1H,H-1′),5.85(s,1H,H-2′),5.33(brs,2H,NH2),4.71–4.82[m,2H,CH(CH3)2],4.42–4.45(m,2H,H-3′and H-4a′),4.33(dd,J=10.7,4.7Hz,1H,H-4b′),3.86–4.06(m,2H,PCH2),1.30–1.37[m,12H,CH(CH3)2].

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ165.1(PhCO),159.2(C-2),153.4(C-4),151.4(C-6),141.1(C-8),134.0,129.9,128.7,128.6(Ph),125.3(C-5),88.2(C-1′),84.1(3JP,C=10.6Hz,C-3′),79.8(C-2′),73.3(C-4′),71.5[CH(CH3)2],64.7(1JP,C=168.5Hz,PCH2).23.9[CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ17.8.

HRMS:[M+H]+针对C23H30ClN5O7P计算,554.1566;发现,554.1568.

实施例41:1′α-(2-氨基-6-氯嘌呤-9-基)-3′-O-二异丙基膦酰基甲基L-苏糖(36)

在室温下搅拌2M氨的MeOH(150mL)中的35(5.0g,9.03毫摩尔)溶液2小时。浓缩混合物并用柱色谱(20:1CH2Cl2/MeOH)纯化残余物以得到白色泡沫状的化合物36(3.0克,75%产率)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.02(s,1H,H-8),5.91(d,J=2.7Hz,1H,H-1′),5.72(brs,3H,NH2and OH),4.76(s,1H,H-2′),4.62–4.73[m,2H,CH(CH3)2],4.25-4.29(m,3H,H-3′and H-4′),3.76–3.91(m,2H,PCH2),1.26–1.33[m,12H,CH(CH3)2].

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ159.2(C-2),153.2(C-4),151.1(C-6),141.1(C-8),125.0(C-5),90.4(C-1′),86.4(3JP,C=8.9Hz,C-3′),78.9(C-2′),72.3(C-4′),71.8[CH(CH3)2],64.8(1JP,C=167.8Hz,PCH2).23.9[CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.6.

HRMS:[M+H]+针对C16H26ClN5O6P计算,450.1304;发现,450.1301.

实施例42:1′α-(2-氨基-6-氯嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-二异丙基-膦酰基-甲基L-苏糖(37)

该化合物如12中所述的方法制备,68%产率。

1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.20(s,1H,H-8),6.30(dd,J=6.8,3.1Hz,1H,H-1′),5.30(brs,2H,NH2),4.65–4.83[m,2H,CH(CH3)2],4.50(brs,1H,H-3′),4.33(d,J=10.5Hz,1H,H-4a′),4.04(dd,J=10.4,4.2Hz,1H,H-4b′).3.67–3.80(m,2H,PCH2),2.56–2.70(m,2H,H-2′),1.29–1.36[m,12H,CH(CH3)2].

13C NMR(75MHz,CDCl3):δ158.7(C-2),153.2(C-4),151.1(C-6),141.0(C-8),125.1(C-5),83.1(C-1′),80.0(3JP,C=10.0Hz,C-3′),73.4(C-4′),71.1[CH(CH3)2],63.8(1JP,C=167.8Hz,PCH2),37.8(C-2′),23.7[CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,CDCl3):δ18.1.

HRMS:[M+H]+针对C16H26ClN5O5P计算,434.1354;发现,434.1354.

实施例43:1′α-(鸟嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-膦酰基甲基L-苏糖(38)

在室温下,向无水CH3CN(9毫升)中的37(184毫克,0.42毫摩尔)的溶液中加入2,6-二甲基吡啶(0.40毫升,3.39毫摩尔)和三甲基甲硅烷基溴化物(0.45毫升,3.39毫摩尔)。.在室温下搅拌过夜后,减压下去除溶剂并与无水甲醇(3×3毫升)共蒸发三次。将残余物溶解在无水MeOH(4毫升)中,并加入2-巯基乙醇(0.15毫升,2.12毫摩尔)和NaOMe(MeOH中5.4M,0.39毫升,2.12毫摩尔)。回流混合物19小时,冷却,用2毫升TEAB缓冲液停止反应并蒸发。在水和EtOAc之间分配残余物,冻干水相,通过0.1M TEAB中的CH3CN梯度从0%运行到30%的RP-HPLC来纯化残余物,得到黄色固体状的38(90毫克,49%)。.

1H NMR(300MHz,D2O):δ8.05(s,1H,H-8),6.06(dd,J=7.9,2.0Hz,1H,H-1′),4.39(brs,1H,H-3′),4.23(d,J=10.4Hz,1H,H-4a′),3.94(dd,J=10.4,4.0Hz,1H,H-4b′).3.55(d,J=9.3Hz,2H,PCH2),2.60–2.70(m,1H,H-2a′),2.49(d,J=15.4Hz,H-2b′).

13C NMR(75MHz,D2O):δ158.3(C-6),153.4(C-2),150.7(C-4),138.1(C-8),115.4(C-5),82.8(C-1′),79.6(3JP,C=12.0Hz,C-3′),73.2(C-4′),65.2(1JP,C=155.2Hz,PCH2),36.6(C-2′).31P NMR(121MHz,D2O):δ15.1.

HRMS:[M-H]-针对C10H13N5O6P计算,330.0609;发现,330.0604.

实施例44:1′α-(鸟嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-[N,N′-双(正丙基-L-苯丙氨酸)]-甲基膦酰二酰胺]-L-苏糖(PMDTG双-Phe-正丙酯;化合物39)

该化合物如17中所述的方法制备,以24%产率。

1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ10.59(brs,1H,NH),7.86(s,1H,H-8),7.12–7.28(m,10H,Ph),6.47(brs,2H,NH2),6.04(dd,J=8.1,2.3Hz,1H,H-1′),4.54(t,J=11.3Hz,1H,NH),4.21(t,J=11.3Hz,1H,NH),3.87–4.17(m,8H,H-3′,H4a′,CH2CH2CH3and PCH2),3.79(dd,J=10.2,4.0Hz,1H,H-4b′),3.13–3.37(m,2H,Phe-CH),2.75–2.94(m,4H,Phe-CH2),2.55–2.65(m,1H,H-2a′),2.20(d,J=14.4Hz,H-2b′),1.40–1.57(m,4H,CH2CH2CH3),0.74–0.84(m,6H,CH2CH2CH3).

31P NMR(121MHz,DMSO-d6):δ20.3.

HRMS:[M+H]+针对C34H45N7O8P计算,710.3062;发现,710.3063.

实施例45:1′α-(鸟嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N,N′-双(正丙基-L-丙氨酸酯)]甲基-膦酰基二酰胺}-L-苏糖(PMDTG双-Ala-异丙酯;化合物40)

该化合物如17中所述的方法制备,以23%产率。

1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ(7.86)(s,1H,H-8),6.59(brs,2H,NH2),6.05(dd,J=8.1,2.5Hz,1H,H-1′),4.84–4.92[m,2H,CH(CH3)2],4.42–4.59(m,2H,NH),4.35(brs,1H,H-3′),4.18(d,J=9.8Hz,H-4a′),3.75–3.90(m,3H,H-4b′and Ala-CH),3.56–3.72(m,2H,PCH2),2.59–2.69(m,1H,H-2a′),2.30(d,J=14.7Hz,H-2b′),1.27(t,J=7.5Hz,6H,Ala-CH3),1.17–1.19[m,12H,CH(CH3)2].

31P NMR(121MHz,DMSO-d6):δ20.3.

HRMS:[M+H]+针对C22H37N7O8P计算,558.2436;发现,558.2448.

实施例46:1′α-(鸟嘌呤-9-基)-2′-脱氧-3′-O-{[N-(异丙基-L-丙氨酸酯)](苯氧基)-甲基膦酰基酰胺化}-L-苏糖(PMDTG Ala-异丙醇,OPh酯;化合物41)

该化合物如18中所述的方法制备,以13%产率。

1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ7.90,7.88(s,1H,H-8),7.15–7.40(m,5H,Ph),6.57(brs,2H,NH2),6.07–6.10(m,1H,H-1′),5.62–5.79(m,1H,NH),4.79–4.88[m,1H,CH(CH3)2],4.36–4.45(m,1H,H-3′),4.16–4.22(m,1H,H-4a′),3.83–4.00(m,4H,H-4b′,PCH2and Ala-CH),2.63–2.73(m,1H,H-2a′),2.30–2.42(m,1H,H-2b′),1.12–1.19[m,9H,CH(CH3)2and Ala-CH3].31P NMR(121MHz,DMSO-d6):δ22.6,21.9.

HRMS:[M+H]+针对C22H30N6O7P计算,521.1908;发现,521.1914.

实施例47:HepG2 2.2.15细胞中的HBV抗病毒试验:初级试验

如先前所述(Korba,BF和Milman,G.《抑制乙型肝炎病毒复制的化合物的细胞培养测定(A cell culture assay for compound which inhibit hepatitis B virus replication)》。Antiviral Res.1991,15,217-228;以及Korba,BF和Gerin,JL.《使用标准化的细胞培养试验来评估核苷类似物的再次乙肝病毒复制的活性(Use of a standardized cell culture assay to assess activities of nucleoside analogs again hepatitis B virus replication)》。Antiviral Res.1992,19,55-70)进行初级抗HBV试验,其中修改为使用实时qPCR(TaqMan)来测量与从HepG2 2.2.15细胞释放的病毒粒子相关的胞外HBV DNA拷贝数。HepG2 2.2.15细胞系是一种稳定的人肝母细胞瘤细胞系,其含有HBV野生型菌株ayw1基因组的两个拷贝,并且组成性地产生高水平的HBV。阻断病毒复制的任何后期步骤(如转录、翻译、前基因组包装、逆转录、颗粒装配和释放)的抗病毒化合物可以使用该细胞系进行鉴定和表征。

简而言之,将HepG2 2.2.15细胞以1.5x104个细胞/孔接种在补充有2%FBS、380μg/mL G418、2.0mM L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100μg/毫升青霉素、100μg/毫升链霉素和0.1mM非必需氨基酸的达尔伯克改良伊格尔(Dulbecco's Modified Eagle's)培养基的96孔微量滴定板中。只有内部的孔被用来减少在细胞培养过程中观察到的“边缘效应”;外部的孔充满完整的介质,以帮助减少样品蒸发。16-24小时后,洗涤融合的HepG2 2.2.15细胞单层,用含有不同浓度的一式三份的测试化合物的完全培养基代替培养基。使用拉米夫定(3TC)作为阳性对照,而单独的培养基加入到细胞中作为阴性对照(病毒对照,VC)。三天后,用含有适当稀释的测试化合物的新鲜培养基更换培养基。在试验化合物初始给药6天后,收集细胞培养上清液,用链霉蛋白酶处理,然后用于实时定量TaqMan qPCR测定。通过监测与扩增的HBV DNA杂交的淬灭荧光探针分子的核酸外切降解产生的荧光信号的增加,来实时检测PCR扩增的HBV DNA。对于每个PCR扩增,使用纯化的HBV DNA的稀释物同时产生标准曲线。抗病毒活性由HBV DNA水平的降低(EC50和EC90值测定)计算。然后使用四唑鎓染料(MTS;3-(4,5-二甲基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑;96试剂,普洛麦格公司(Promega))摄取测定来测量细胞活力,其用于计算毒性(CC50)。选择性指数(SI50)按CC50/IC50计算。数据示于表1。

表1

实施例48:HepG2 2.2.15细胞中的HBV抗病毒试验:次级试验

以与上述实施例47中所述的主要试验类似的方式进行次级抗HBV试验。然而,在试验结束时,使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒按照生产商的方案处理细胞以分离总的细胞内DNA。然后使用分离的DNA进行实时TaqMan qPCR试验,以测量细胞内HBV DNA拷贝数的减少。将来自次级试验的结果用于确定初级试验中观察到的细胞外HBV DNA拷贝数的减少是否与细胞内HBV DNA拷贝数的伴随减少相关。在次级试验中测试了两种化合物,其结果显示在表2中。

表2

再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1