本发明属于高分子微球材料技术领域，具体为一种聚苯乙烯微球的制备方法及其应用。
背景技术：
免疫比浊法(Turbidimetric inhibition immuno assay)是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。
聚苯乙烯微球多用于偶联抗原或抗体，是常用的使抗原抗体结合的一种试剂，但现有技术中大多采用乳化剂制成聚苯乙烯微球，从而使得制备聚苯乙烯微球时往往会残留一定量的乳化剂，从而导致聚苯乙烯微球容易凝聚，使抗体和抗原交联效率低。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种聚苯乙烯微球的制备方法及其应用，实现最大化减少残留的乳化剂，使制得的聚苯乙烯微球大小、颗粒粒径均匀，提高抗体和抗原交联效率。
为了实现上述目的，本发明公开的技术方案为：本发明公开的一种用于增强免疫比浊法的聚苯乙烯微球的制备方法，包括如下步骤，(1)将原材料苯乙烯、二乙烯基甲基苯、水、过氧化叔丁酯、乙烯基双硬脂酰胺混合得到料液A，所述各成份在原材料中占的质量百分比分别为，苯乙烯15-20％，二乙烯基甲基苯10-15％，过氧化叔丁酯10-15％，乙烯基双硬脂酰胺10-15％，余量为水；
(2)将料液A升温至120-160℃，持续通入氮气，反应2h-3h，得到苯乙烯-二乙烯基甲基苯悬浮液；
(3)在步骤(2)中得到的悬浮液加入苯乙醇，将温度维持在180-200℃，得到羧基改性后的聚苯乙烯微球；
(4)降温至60-80℃，在步骤(3)得到微球的体系采用蒸馏水-无水乙醇洗涤，洗涤后离心，即得到用于增强免疫比浊法的聚苯乙烯微球。
本发明减少了乳化剂的使用量，采用共悬浮液的方式制备得到微球，使制得的微球颗粒均匀，粘度适中，能够更好的将抗原、抗体连接。
进一步的，所述原材料还包括异戊醇，在步骤(3)中添加异戊醇，且在反应釜容器内涂覆稀土氧化物。添加异戊醇的目的为使得到的微球颗粒均匀，涂覆的稀土氧化物有催化剂的作用，能够促进反应的加快，形成羧基改性的聚苯乙烯微球。
进一步的，所述步骤(2)中通入氮气的流量为5-15ml/min。
进一步的，所述步骤(3)中苯乙醇加入的量为，悬浮液与苯乙醇的体积比为1:1-1.5。所加入的苯乙醇提供羧基，用于制备出改性后的聚苯乙烯微球。
进一步的，所述步骤(4)中采用蒸馏水、无水乙醇梯度洗涤，依次采用蒸馏水、无水乙醇体积比为1:1、1：2、1:5洗涤，每次洗涤时间5-10min。增加的此步骤可有效洗涤掉剩余的乳化剂，能够快速成为球体。
进一步的，所述步骤(4)中离心的速度为50-100r/min。在此速度下离心，进一步保证快速成为微球，而保证带有粘性的微球不能够粘带有其它杂质。
进一步的，所述步骤(3)中所添加的异戊醇的量为，悬浮液与异戊醇的体积比为1:0.3-1，所添加的稀土氧化物为氧化镁、氧化钙中任意一种。所选择异戊醇的量能够使得到的微球均匀、微球表面颗粒均匀，所选择的稀土氧化物不参与聚合反应，但是能够加快反应进程，缩短反应时间。
本发明将上述方法制备得到的聚苯乙烯微球，用作胶乳增强免疫比浊法的试剂，能够得到良好的将抗原抗体交联作用。
本发明的积极进步效果在于：本发明减少了乳化剂的使用量，采用共悬浮液的方式制备得到微球，使制得的微球颗粒均匀，粘度适中，能够更好的将抗原、抗体偶联，尤其用于胶乳增强免疫比浊法测定效果良好。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例一：本发明提供的一种用于增强免疫比浊法的聚苯乙烯微球的制备方法，包括如下步骤，(1)将原材料苯乙烯、二乙烯基甲基苯、水、过氧化叔丁酯、乙烯基双硬脂酰胺混合得到料液A，所述各成份在原材料中占的质量百分比分别为，苯乙烯15％，二乙烯基甲基苯15％，过氧化叔丁酯15％，乙烯基双硬脂酰胺15％，余量为水；
(2)将料液A升温至120-160℃，持续通入氮气，反应2h-3h，得到苯乙烯-二乙烯基甲基苯悬浮液；
(3)在步骤(2)中得到的悬浮液加入苯乙醇，将温度维持在180-200℃，得到羧基改性后的聚苯乙烯微球；
(4)降温至60-80℃，在步骤(3)得到微球的体系采用蒸馏水-无水乙醇洗涤，洗涤后离心，即得到用于增强免疫比浊法的聚苯乙烯微球。
本发明采用共悬液的方式制得微球，避免了乳化剂对成球的影响，得到的聚苯乙烯微球粒径150nm，微球均匀，本发明所选择的苯乙烯、二乙烯基甲基苯在引发剂过氧化叔丁酯、分散剂乙烯基双硬脂酰胺条件下，能够得到共悬液，进而为后续制备微球提供基础，所选用的苯乙醇，提供羧基，得到改性的聚苯乙烯微球，并将该微球用于胶乳增强免疫比浊法的试剂，得到良好的测定结果。
胶乳颗粒增强比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。采用本发明制备得到的微球能够很好的将抗原、抗体交联，且能够根据反应液的吸光度值测得抗原浓度，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，5-10min就能获得结果，省时省力。此外，将本发明微球应用于胶乳增强免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。
实施例二：本发明提供的一种用于增强免疫比浊法的聚苯乙烯微球的制备方法，包括如下步骤，(1)将原材料苯乙烯、二乙烯基甲基苯、水、过氧化叔丁酯、乙烯基双硬脂酰胺混合得到料液A，所述各成份在原材料中占的质量百分比分别为，苯乙烯20％，二乙烯基甲基苯10％，过氧化叔丁酯10％，乙烯基双硬脂酰胺10％，余量为水；
(2)将料液A升温至120-160℃，持续通入氮气，反应2h-3h，得到苯乙烯-二乙烯基甲基苯悬浮液；通入氮气的流量为5-15ml/min；
(3)在步骤(2)中得到的悬浮液加入苯乙醇，将温度维持在180-200℃，得到羧基改性后的聚苯乙烯微球；苯乙醇加入的量为，悬浮液与苯乙醇的体积比为1:1；
(4)降温至60-80℃，在步骤(3)得到微球的体系采用蒸馏水-无水乙醇洗涤，洗涤后离心，采用蒸馏水、无水乙醇梯度洗涤，依次采用蒸馏水、无水乙醇体积比为1:1、1：2、1:5洗涤，每次洗涤时间5-10min，离心的速度为50-100r/min，即得到用于增强免疫比浊法的聚苯乙烯微球。
进一步的，述原材料还包括异戊醇，在步骤(3)中添加异戊醇，且在反应釜容器内涂覆稀土氧化物。添加的异戊醇的量为，悬浮液与异戊醇的体积比为1:0.3，所添加的稀土氧化物为氧化镁。
本发明采用共悬液的方式制得微球，避免了乳化剂对成球的影响，得到的聚苯乙烯微球粒径250nm，微球均匀，本发明所选择的苯乙烯、二乙烯基甲基苯在引发剂过氧化叔丁酯、分散剂乙烯基双硬脂酰胺条件下，能够得到共悬液，进而为后续制备微球提供基础，所选用的苯乙醇，提供羧基，得到改性的聚苯乙烯微球，并将该微球用于胶乳增强免疫比浊法的试剂，得到良好的测定结果。
胶乳颗粒增强比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。采用本发明制备得到的微球能够很好的将抗原、抗体交联，且能够根据反应液的吸光度值测得抗原浓度，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，5-10min就能获得结果，省时省力。此外，将本发明微球应用于胶乳增强免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。
本发明选择原材料中添加异戊醇，异戊醇能够起到使制得的颗粒均匀的作用，以下列举出部分试验，用以说明本发明为最佳的选择，见下表：
实施例三：本发明提供的一种用于增强免疫比浊法的聚苯乙烯微球的制备方法，包括如下步骤，(1)将原材料苯乙烯、二乙烯基甲基苯、水、过氧化叔丁酯、乙烯基双硬脂酰胺混合得到料液A，所述各成份在原材料中占的质量百分比分别为，苯乙烯17％，二乙烯基甲基苯13％，过氧化叔丁酯12％，乙烯基双硬脂酰胺13％，余量为水；
(2)将料液A升温至120-160℃，持续通入氮气，反应2h-3h，得到苯乙烯-二乙烯基甲基苯悬浮液；通入氮气的流量为5-15ml/min；
(3)在步骤(2)中得到的悬浮液加入苯乙醇，将温度维持在180-200℃，得到羧基改性后的聚苯乙烯微球；苯乙醇加入的量为，悬浮液与苯乙醇的体积比为1:1.5；
(4)降温至60-80℃，在步骤(3)得到微球的体系采用蒸馏水-无水乙醇洗涤，洗涤后离心，采用蒸馏水、无水乙醇梯度洗涤，依次采用蒸馏水、无水乙醇体积比为1:1、1：2、1:5洗涤，每次洗涤时间5-10min，离心的速度为50-100r/min，即得到用于增强免疫比浊法的聚苯乙烯微球。
进一步的，述原材料还包括异戊醇，在步骤(3)中添加异戊醇，且在反应釜容器内涂覆稀土氧化物。添加的异戊醇的量为，悬浮液与异戊醇的体积比为1:1，所添加的稀土氧化物为氧化镁。
本发明采用共悬液的方式制得微球，避免了乳化剂对成球的影响，得到的聚苯乙烯微球粒径400nm，微球均匀，本发明所选择的苯乙烯、二乙烯基甲基苯在引发剂过氧化叔丁酯、分散剂乙烯基双硬脂酰胺条件下，能够得到共悬液，进而为后续制备微球提供基础，所选用的苯乙醇，提供羧基，得到改性的聚苯乙烯微球，并将该微球用于胶乳增强免疫比浊法的试剂，得到良好的测定结果。
胶乳颗粒增强比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。采用本发明制备得到的微球能够很好的将抗原、抗体交联，且能够根据反应液的吸光度值测得抗原浓度，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，5-10min就能获得结果，省时省力。此外，将本发明微球应用于胶乳增强免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。
本发明采用蒸馏水-无水乙醇洗涤，再采用离心，能够很好的去除乳化剂，而且在此转速下离心，能够迅速的成粒制得微球，整个反应的时间仅需4-5小时，现有技术最短的时间为6小时。
实施例四：本发明提供的一种用于增强免疫比浊法的聚苯乙烯微球的制备方法，包括如下步骤，(1)将原材料苯乙烯、二乙烯基甲基苯、水、过氧化叔丁酯、乙烯基双硬脂酰胺混合得到料液A，所述各成份在原材料中占的质量百分比分别为，苯乙烯19％，二乙烯基甲基苯11％，过氧化叔丁酯14％，乙烯基双硬脂酰胺11％，余量为水；
(2)将料液A升温至120-160℃，持续通入氮气，反应2h-3h，得到苯乙烯-二乙烯基甲基苯悬浮液；通入氮气的流量为5-15ml/min；
(3)在步骤(2)中得到的悬浮液加入苯乙醇，将温度维持在180-200℃，得到羧基改性后的聚苯乙烯微球；苯乙醇加入的量为，悬浮液与苯乙醇的体积比为1:1.3；
(4)降温至60-80℃，在步骤(3)得到微球的体系采用蒸馏水-无水乙醇洗涤，洗涤后离心，采用蒸馏水、无水乙醇梯度洗涤，依次采用蒸馏水、无水乙醇体积比为1:1、1：2、1:5洗涤，每次洗涤时间5-10min，离心的速度为50-100r/min，即得到用于增强免疫比浊法的聚苯乙烯微球。
进一步的，述原材料还包括异戊醇，在步骤(3)中添加异戊醇，且在反应釜容器内涂覆稀土氧化物。添加的异戊醇的量为，悬浮液与异戊醇的体积比为1:0.7，所添加的稀土氧化物为氧化镁。
本发明采用共悬液的方式制得微球，避免了乳化剂对成球的影响，得到的聚苯乙烯微球粒径500nm，微球均匀，本发明所选择的苯乙烯、二乙烯基甲基苯在引发剂过氧化叔丁酯、分散剂乙烯基双硬脂酰胺条件下，能够得到共悬液，进而为后续制备微球提供基础，所选用的苯乙醇，提供羧基，得到改性的聚苯乙烯微球，并将该微球用于胶乳增强免疫比浊法的试剂，得到良好的测定结果。
胶乳颗粒增强比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。采用本发明制备得到的微球能够很好的将抗原、抗体交联，且能够根据反应液的吸光度值测得抗原浓度，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，5-10min就能获得结果，省时省力。此外，将本发明微球应用于胶乳增强免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。