本发明属于应用生物
技术领域：
，特别是涉环境微生物
技术领域：
。
背景技术：
：现代工业化发展的同时加剧了环境污染,石油的开采及石油化工企业的生产经营活动都造成了企业周边土壤及河流大量的油脂污染。另一方面随着人们生活水平的提高餐厨垃的量也逐渐增多。餐厨垃圾中存在大量的油脂，油脂的存在给餐厨垃圾的处理带来了巨大的困难。通常情况下一般的微生物在高浓度的油脂中是不能生长繁殖的，油脂不能通过普通微生物降解，这给餐厨垃圾生物处理处理及石油污染土壤及水体修复造成了巨大的障碍。如何从被油脂类污染的土壤中筛选出高效降解油脂的微生物已经成为当前环境污染治理的热点研究课题。技术实现要素：为了克服上述普通环境类微生物不能降解油脂的不足，本发明提供了（一种用于油脂降解的微生物菌剂及其制备方法）。该方法从被油脂污染的环境中分离到两组能够高效降解油脂的真菌，经16SDNA鉴定这两株菌分别为中华米根霉及产枝木霉，这两株菌中任一单菌对油脂的降解效率极高，在48h内对橄榄油的降解率分别能够达到63%及68%，经过测试这两种菌在一定的程度上都能够产脂肪酶。将这两种菌在按照一定的比例组合，这两种菌对油脂的降解能够起到很好的协同作用，在48h内对橄榄油的降解率能够达到75%以上。本发明所采用的技术方案是：用于油脂降解的微生物菌剂及其制备方法其特征在于，该预处理微生物菌剂的各组分微生物在微生物菌剂总质量中的质量百分比为：中华米根霉20-70分量，长枝木霉30-80分量的比例组合。所述的用于油脂降解的微生物菌剂，其特征在于：该菌剂的有效活菌数在6×108-7×109CFU，且每种单菌的活菌数量不小于1×108CFU。脂肪酶酶活在20-50u/g。所述的用于油脂降解的微生物菌剂及其制备方法，其特征在于该方法是将各组分微生物分别进行固态发酵培养后再按照一定的比列进行复配从而得到高效降解油脂的微生物菌剂。所述的用于油脂降解的微生物菌剂及其制备方法，其特征在于它包括如下的步骤：a：一级种子的制备：分别将中华米根霉及长枝木霉菌种接种于PDA培养于100-400rpm，28-45℃的条件下，培养2-3天，待种子成熟备用b：二级种子的制备：将活化好的一级种子，按照10%-20%的接种量接种到液体发酵罐中发酵，发酵条件控制为：温度28-45℃，通气量控制为0.5-2L/min，搅拌转速300-500rpm，装料系数控制为75%，发酵3-5天，制备得到二级种子待用c：固体发酵生产：分别将中华米根霉及长枝木霉二级种子接种于固体培养基中进行固体发酵，控制固体培养基水分在50-80%，培养温度在28-40℃，培养4-6天制备得到中华米根霉及长枝木霉单一菌剂。d：菌剂复合：将中华米根霉及长枝木霉按照质量百分比为：中华米根霉30-70%、长枝木霉70-30%比例进行混合制备得到用于餐厨垃圾油脂降解的微生物菌剂。步骤b中二级种子所用的培养基组成为：2-5%的麸皮，1-2%的葡萄糖，其余为水。步骤c中固体培养基为麸皮：米糠为4:6-7:3，豆粕2-5%,葡萄糖1-3%。本发明有益效果：与现有技术相比，本发明的有益效果是制备得到的高效油脂降解菌剂其工艺技术及产品具有如下的一些特点：1)工艺采用了液态发酵与固态发酵相结合的工艺，液态条件下制备发酵种子，固态工艺条件下制备得到最终的成品，具有工艺简单，设备投资费用低，生产成本低，没有大量的废水产生。2)菌剂具有有效活菌数量高，每克产品有效活菌最高可达6×108-7×109CFU,处理相同量的物料可以减少菌剂的投加量从而大大的减小了运行成本。3）所使用菌种分别从被油脂污染的环境中筛选,产品的适用能力强,能够适应各类油脂污染的场所。4）菌种的生长速度快，除臭效率高，能够在48h内起到对油污的明显降解作用，从而对环境起到高效的修复作用本发明所选用的菌种特性及功能如下：1)中华米根霉：该菌不仅能够利用油脂，而且在一定的条件下还能够产生大量的淀粉酶及糖化酶类，糖化酶的酶活可高达2000u/g2）长枝木霉：该菌除了能够产生脂肪酶外，其本身还具有高产纤维素酶的特性，在一定的条件下该菌所产的纤维素酶酶活可高达200u/g，对纤维素类物质可以起到快速降解的能力3)复合菌剂：这两种菌复合不仅能够对污染环境中的油脂起到快速的降解左右，而且还能够对环境中的纤维素及淀粉类高有机物的降解将其转化为糖类及脂肪酸、甘油等小分子物质。能够对油污及有机物污染环境起到快速修复作用。以下通过实施例对本发明做进一步的阐述一、试管斜面培养基PDA培养基：取去皮的马铃薯150g，切成小块添加1自来水煮沸1h后用少补过滤，收集滤液添加15g葡萄糖定容至1L调节pH至6.5，添加20g琼脂煮沸至琼脂融化，分装于试管中，灭菌，制备斜面备用。二、液体一级种子培养基：配方同试管斜面培养基，不添加琼脂三、菌剂生产培养基：2-5%的玉米粉，1-2%的葡萄糖，玉米浆5-10%其余为水，灭菌备用。实施例1分别从填埋餐厨垃圾的垃圾填埋场及石油重度污染的土壤取样，将样品用无菌水稀释50倍在要床上200RPM、的条件下，摇动1-2h，然以5%的接种量接入PDA液体培养基中培养5天如此反复5次，然后将富集液稀释到10-8-10-10倍，涂布于PDA选择性的平板上，挑选形态典型的单个菌落进行试管斜面保存，及送检16SRNA鉴定。本实验室共筛选到A、B降解油脂效果较好，经鉴定A中华米根霉、B为长枝木霉。实施实例21)将4℃保藏的菌种进行斜面活化：中华米根霉及长枝木霉接种于PDA斜面于37℃的条件下进行活化3天2)一级种子液的制备：分别从活化的试管斜面上挑取活化的中华米根霉及长枝木霉，接种于PDA液体培养基中于35℃，200rpm的下培养3天，获得液体一级种子。3）二级种子的制备：分别将步骤2）所培养中华米根霉及长枝木霉，按照10%的接种量接种到液体发酵罐中发酵，发酵条件控制为：温度40℃，通气量控制为2.5L/min，搅拌转速250rpm，装料系数控制为75%，压力0.15MPa发酵4天，制备得到二级种子待用4）固体发酵生产：分别将二级种子接种于固体培养基中进行固体发酵，控制固体培养基水分在85%，培养温度在40℃，培养5天制备得到中华米根霉、长枝木霉单一菌剂。5）菌剂复合：将中华米根霉及长枝木霉按照重量比为：中华米根霉20份，长枝木霉80份的比例进行混合制备得到油脂高效降解菌剂所获得的高效油脂降解微生物菌剂中有效活菌含量在3×109CFU。脂肪酶活性在40U/g，糖化酶活性在106U/g，纤维素酶活150U/g。实施例3检测方法1）标准曲线的制备以60-90沸程的石油醚为溶剂分别配置0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8g/L浓度的标准溶液，在230nm的条件下测定各溶液的吸光度，以吸光度为重坐标以浓度为横坐标作图得标准曲线。2）试样的检测：取样将样品在3000rpm的条件下离心10min取上清液，用1:1的硫条酸酸化至pH1以下加入氯化钠使用溶液饱和，将溶液移入分液漏斗，以50ml石油醚（分2-3次）将油脂萃取出来，萃取液接入50ml容量瓶定容后在230nm波长下检测吸光度。3）实验结果：3.1标准曲线的制作油脂浓度g/L吸光度A0.20.0010.40.0530.60.1110.80.17210.2161.20.2681.40.3231.60.381.80.443实施实例4长枝木霉单独实验配置4瓶50ml，接种菌长枝木霉10ml，分别在24、48、60、72h取样以之外分光光度法检测样品中油脂含量。培养基组成（含油脂废水）：硫酸铵0.1g/L;磷酸二氢钾0.02g/L;磷酸氢二钾0.1g/L;氯化钠1g/L；橄榄油2g/L实验条件：在30℃150rpm的摇床上培养相应时间。实验结果如下表所示0h24h48h60h72h样品吸光度0.480.390.1220.121油脂浓度g/L21.881.6280.640.639油脂降解率%由以上数据可以看出产枝木霉单独对橄榄油的降解能力较强在第3天后达到68%。但是速度不是太快。实施实例5中华米根霉单独实验配置4瓶50ml，接种中华米根霉10ml，分别在24、48、60、72h取样以之外分光光度法检测样品中油脂含量。培养基组成（含油脂废水）：硫酸铵0.1g/L;磷酸二氢钾0.02g/L;磷酸氢二钾0.1g/L;氯化钠1g/L；橄榄油2g/L实验条件：在30℃150rpm的摇床上培养相应时间。实验结果如下表所示处理时间0h24h48h60h72h样品吸光度0.460.210.1300.091油脂浓度g/L21.370.970.670.53油脂降解率%初始值31.551.566.573由以上数据可以看出中华米根霉对橄榄油的降解能力较强在2天后油脂的降解能力较强在第2天就达到50%以上，在72小时对橄榄油的降解达到了70%以上。实施实例6中华米根霉与产枝木霉组合实验配置4瓶50ml，接种菌长枝木霉2ml、中华米根霉8ml，分别在24、48、60、72h取样以之外分光光度法检测样品中油脂含量。培养基组成（含油脂废水）：硫酸铵0.1g/L;磷酸二氢钾0.02g/L;磷酸氢二钾0.1g/L;氯化钠1g/L；橄榄油2g/L实验条件：在30℃150rpm的摇床上培养相应时间。实验结果如下表所示处理时间0h24h48h60h72h样品吸光度0.320.0920.070.122油脂浓度g/L21.370.5350.450.64油脂降解率%初始值31.573.2577.568由以上数据可以看出根霉及长枝木霉组合对橄榄油的降解能力较强在2天后油脂的降解能力就达到70%以上。在60小时是达到了77.5%。由此可见根霉及长枝条木霉组合有较强的油脂降解能力。附图说明:图1是“油脂降解标准曲线”图；图2是“各菌及其组合对橄榄油的降解速率比较”图。当前第1页1 2 3