家蚕BmST基因及其应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及家蚕BmST基因，还涉及家蚕BmST基因的应用。

背景技术：

家蚕是一种重要的经济昆虫，蚕丝是丝绸工业的重要原料。在中国、印度、巴西等发展中国家，养蚕业是农民经济收入的一个重要来源，甚至是某些地区的支柱性产业。但是，家蚕却面临严重的疾病威胁，每年因蚕病引起的损失占蚕业生产总收入的20％左右。病毒病是对养蚕业威胁最严重的一类疾病，主要由家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和家蚕质型多角体病毒(BmCPV)引起。

由于BmNPV和BmCPV在蚕业生产上危害严重，科研工作者一直希望找出影响家蚕对病毒抗性的关键基因，然后通过转基因遗传改良来提高家蚕对病毒的抗性。对影响家蚕病毒抗性的关键基因全长序列进行克隆和鉴定，为阐明家蚕抵抗病毒的机制，以及培育抗性品种应用于蚕业生产有着重要的理论价值和实践意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种来自于家蚕的对多种病毒具有抗性的关键基因，还提供该基因的应用。

本发明中，由于家蚕基因组数据库(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)中没有该基因表达序列标签(Expressed sequence tag，EST)，说明表达量非常低，全长序列克隆非常困难。因此为克隆此基因，本发明设计引物，克隆了家蚕BmST基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，分析发现该基因包括一个Somatomedin B-like结构域和一个Thrombospondin type 1repeats结构域。通过RT-PCR和qPCR对该基因的时期组织表达情况进行了检测，研究结果进一步证实该基因的表达量极低。为了研究该基因的功能，通过增量表达的方式来提高细胞和家蚕体内该基因的表达量，然后感染病毒，检测病毒增殖是否受到抑制。构建了增量表达BmST的瞬时转染载体，转染BmE细胞，然后感染BmNPV-GFP病毒，荧光观察和qPCR检测都显示BmNPV病毒的增殖被明显抑制；构建增量表达BmST的转基因载体，通过胚胎显微注射制备转基因家蚕，分别经口添食感染BmNPV和BmCPV，qPCR检测结果显示转基因家蚕体内的病毒含量显著低于非转基因对照，说明BmST基因是一个影响家蚕抗性的关键基因，可以作为家蚕转基因抗病育种的靶标基因。

具体应用如下：

家蚕BmST基因在培育抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品种中的应用，所述家蚕BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

家蚕BmST基因在培育抗家蚕质型多角体病毒的家蚕品种中的应用，所述家蚕BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

家蚕BmST基因在培育抗家蚕核型多角体病毒和家蚕质型多角体病毒的家蚕品种中的应用，所述家蚕BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

家蚕BmST基因在制备抑制家蚕核型多角体病毒增殖的药物中的应用，所述家蚕BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

家蚕BmST基因在制备抑制家蚕质型多角体病毒增殖的药物中的应用，所述家蚕BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

家蚕BmST基因在制备抑制家蚕核型多角体病毒和家蚕质型多角体病毒增殖的药物中的应用，所述家蚕BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的有益效果在于：本发明克隆了家蚕的一个影响家蚕抗性的关键基因BmST的全长CDS序列，该基因表达量非常低，没有EST序列，克隆非常困难；通过RT-PCR和qPCR技术对该基因的时期组织表达谱进行了检测，检测结果表明该基因的表达量非常低；为了研究该基因的功能，以该基因的全长CDS序列作为靶标，构建瞬时转染增量表达载体，发现细胞水平增量表达该基因能够显著抑制BmNPV的增殖；进而构建了转基因增量表达载体，通过转基因显微注射，筛选得到转基因阳性个体，增量表达该基因的转基因家蚕对BmNPV和BmCPV病毒的抗性都显著提高，因此该基因在家蚕转基因抗病育种的研究和应用中具有重要价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为不同时期BmST基因时期表达情况(1-12分别为卵、蚁蚕、一龄眠蚕、二龄起蚕、二龄眠蚕、三龄起蚕、三龄眠蚕、四龄起蚕、四龄眠蚕、五岭起蚕、熟蚕、蛹)。

图2为qPCR技术检测BmST基因不同组织表达情况。

图3为BmE细胞中增量表达BmST基因对BmNPV增殖的影响(A为BmST基因瞬时增量表达载体示意图；B为转染后48h RT-PCR检测BmST基因表达量；C为感染病毒后72h观察BmNPV病毒荧光；D为感染病毒后48h qPCR检测BmNPV病毒含量)。

图4为增量表达BmST基因的转基因家蚕对BmNPV和BmCPV的抗性影响(A为BmST基因转基因增量表达载体示意图；B为转基因家蚕感染BmNPV后48h qPCR检测BmNPV病毒含量；C为转基因家蚕感染BmCPV后72h qPCR检测BmCPV病毒含量)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、克隆BmST基因全长CDS序列

根据家蚕基因组序列设计特异引物，正向引物：5'-atgcaccgccattttcttt-3'(SEQ ID NO.1)，反向引物5'-tcaaacaaagatgaagtcagggt-3'(SEQ ID NO.2)。以家蚕大造品种5龄3天的全蚕cDNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸50秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T载体连接，连接反应在T4DNA连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示，该序列命名为BmST基因，结果表明成功克隆了BmST基因的CDS序列。由于家蚕基因组数据库(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)中没有该基因的EST序列，说明该基因表达量非常低，克隆很困难。

经序列分析表明，BmST基因CDS全长为828bp的序列。生物信息学分析显示该基因包括一个Somatomedin B-like结构域和一个Thrombospondin type 1repeats结构域。

实施例2、BmST基因的时期组织表达谱检测

以家蚕卵、蚁蚕、一龄眠蚕、二龄起蚕、二龄眠蚕、三龄起蚕、三龄眠蚕、四龄起蚕、四龄眠蚕、五岭起蚕、熟蚕、蛹的cDNA作为模板，以BmST基因的特异引物BmSTqRT(F：5'-acttgagacttcgcaaccca-3'(SEQ ID NO.4)，R：5'-tcgcaaagcacgcatacag-3'(SEQ ID NO.5))进行RT-PCR检测，PCR扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸10秒，共32个循环，最后72℃延伸10分钟；以家蚕看家基因TIF-4A作为内参，以其特异引物TIF-4AqRT(F：5'-gaatggaccctgggacactt-3'(SEQ ID NO.6),R：5'-ctgactgggcttgagcgata-3'(SEQ ID NO.7))进行RT-PCR检测，PCR扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸10秒，共25个循环，最后72℃延伸10分钟，结果如图1所示。

然后再以家蚕5龄3天幼虫的头、脂肪体、中肠、丝腺、皮、血、马氏管、气管、卵巢以及精巢等组织的cDNA作为模板，用BmST基因的特异引物BmSTqRT和内参基因TIF-4A的特异引物TIF-4AqRT进行qPCR检测，按照仪器和试剂盒的说明书进行操作，结果如图2所示。

RT-PCR和qPCR的结果证明BmST基因的表达量确实非常低，表明本发明能克隆得到该基因的全长CDS序列非常不容易。

实施例3、构建瞬时增量表达载体1180-hr3-A4P-BmST-SV40和转基因增量表达载体piggyBac[hr3-A4P-BmST-SV40-3×p3DsRed afm]

为了研究BmST基因的功能，通过增量表达方式来提高BmE细胞和家蚕体内BmST基因的表达量，然后再观察病毒增殖是否有变化，从而证明该基因的功能。具体步骤如下：

以BmST基因的全长CDS序列作为靶标，设计增量表达引物，上游引物为BmSToe-F：5'-ggatccatgcaccgccattttcttt-3’(SEQ ID NO.8)，下游引物为BmSToe-R：5'-gcggccgctcaaacaaagatgaagtca-3'(SEQ ID NO.9)。以克隆的BmST基因的CDS质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸50秒，共29个循环，最后72℃延伸10分钟；对扩增出的目的条带进行回收、连接和转化，筛选阳性克隆后测序。

将上一步测序验证成功的质粒用BamH I和Not I进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得BmST酶切片段；同时用BamH I和Not I双酶切已经包含Hr3增强子、家蚕肌动蛋白Actin 4启动子(A4P)和SV40终止信号序列的1180载体，将BmST基因替换pb-HEAG载体的hycu-ep32基因序列(pb-HEAG载体见蒋亮博士毕业论文《基于转基因工程的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)抗性素材创新及抗性机制研究》，2013)，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得1180-hr3-A4P-SV40酶切片段。将BmST酶切片段和1180-hr3-A4P-SV40酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆，得到1180-hr3-A4P-BmST-SV40载体(简称为BmSTOE)。

(4)将piggyBac[3×p3DsRed afm]载体和1180-hr3-A4P-BmST-SV40分别用Asc I单酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到piggyBac[hr3-A4P-BmST-SV40-3×p3DsRed afm]载体(简称为pb-STOE)，结构如图3中A所示。

实施例4、瞬时增量表达BmST抑制BmNPV增殖

将BmSTOE和对照1180空载的质粒分别转染进BmE细胞，在转染后48h后提取RNA并反转录成cDNA，用BmST基因的特异引物BmSTqRT和内参基因TIF-4A的特异引物TIF-4AqRT进行RT-PCR检测，结果如图3中B所示。结果显示BmST的扩增条带亮度在转染BmSTOE的样品中更加明显，表明BmST的增量表达成功。

在转染后48h感染带有绿色荧光标记的BmNPV-GFP病毒，在感染病毒后48h提取DNA，以BmNPV病毒GP41基因的特异引物GP41qRT(F：5'-cgtagtagtagtaatcgccgc-3'(SEQ ID NO.10)，R：5'-agtcgagtcgcgtcgcttt-3'(SEQ ID NO.11))进行qPCR检测，以家蚕看家基因BmGAPDH作为内参，其特异检测引物为BmGAPDHqRT(F：5'-ccgcgtccctgttgctaat-3'(SEQ ID NO.12)，R：5'-ctgcctccttgaccttttgc-3'(SEQ ID NO.13))，按照仪器和试剂盒的说明书进行操作，结果如图3中D所示。qPCR检测结果显示转染BmSTOE的细胞能够显著抑制病毒增殖，其BmNPV含量仅为对照的35％。

在感染病毒后72h观察荧光，结果如图3中C所示。结果发现转染BmSTOE的细胞中病毒荧光明显少于对照，表明瞬时增量表达BmST能够抑制BmNPV的增殖。

实施例5、转基因显微注射和阳性个体的筛选

将家蚕大造(DZ)品种蚕卵浸酸(盐酸比重为1.073，温度为46℃，时间为5分钟)解除滞育以后，放于15℃和85％湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养(温度：25℃，湿度：80％)，化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；

将pb-STOE重组载体和辅助质粒A3H混合备用，将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2小时用Eppendorf显微注射仪将混合质粒溶液注射DZ蚕卵中，总注射蚕卵数为132粒。用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80％的环境中催青10天左右孵化，将孵化的76头G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，G0代蚕蛾通过自交或回交共获得12蛾圈G1代蚕卵，用电动宏观荧光显微镜观察G1胚胎筛选并获得1个阳性蛾圈，继代扩大得到转基因家蚕系统STOE。

实施例6、转基因家蚕抗病毒能力检测

取转基因系统STOE和非转基因DZ，在4龄起蚕以半致死剂量经口单头添食BmNPV病毒，在攻毒后48h提取DNA，用GP41基因的特异引物GP41qRT和内参基因BmGAPDH的特异引物BmGAPDHqRT进行qPCR检测，结果如图4中A所示。结果显示STOE体内的BmNPV含量仅为对照的34％，表明增量表达BmST的转基因家蚕对BmNPV的抗性显著提高。

取STOE和DZ的4龄起蚕，分别经口单头添食半致死剂量的BmCPV病毒，在攻毒后72h提取RNA并反转录成cDNA，以BmCPV病毒结构蛋白编码基因S2的特异引物S2qRT(F：5'-cggcaaactcgcaaacat-3'(SEQ ID NO.14)，R：5'-ctaaaccttggagcaatacgg-3'(SEQ ID NO.15))和非结构蛋白编码基因S8的特异引物S8qRT(F：5'-gacgagacggagaagaagga-3'(SEQ ID NO.16)，R：5'-tactataggtgagggcaatggt-3'(SEQ ID NO.17))进行qPCR检测，以家蚕看家基因TIF-4A作为内参，其特异引物为TIF-4AqRT，结果如图4中B所示。检测结果显示，STOE能够显著抑制BmCPV的增殖，其体内S2和S8基因mRNA含量分别只有对照的56％和42％，表明增量表达BmST能够显著提高转基因家蚕对BmCPV的抗性。

增量表达BmST不但在细胞水平能够显著抑制病毒的增殖，而且在转基因家蚕个体水平也显著抑制了病毒的增殖，表明BmST基因是一个影响家蚕抗性的关键基因。更有趣的是，增量表达BmST的转基因家蚕对BmNPV和BmCPV两种病毒的抗性都显著增强，说明BmST基因是一个影响家蚕对多种病毒抗性的关键基因，可以作为家蚕转基因抗病育种的靶标基因用于今后的分子育种工作中。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

<110> 西南大学；

<120> 家蚕BmST基因及其应用

<160> 17

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 家蚕BmST基因正向引物

<400> 1

atgcaccgcc attttcttt 19

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 家蚕BmST基因反向引物

<400> 2

tcaaacaaag atgaagtcag ggt 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 家蚕BmST基因

<400> 3

atgcaccgcc attttctttg tctaagcttg ttcattttcg cgggctattg cgatgcgaac 60

tattgccggg acgcgaacct gtgctgcccg gggagggata gttcctgcgt cgttcagaag 120

gcgcaccaga acgccattat tgaggaccta accgacaagc cttgttactg tgaccacgct 180

tgcttgaaat tgggagattg ttgccccgac ttccgggaga cttgcggagt gatcgattgc 240

gttgtttcaa gctggggctc gtggtcggaa tgcgatacca cctgcggctc tgggagcatg 300

gtgcgaacgc gtaggatcgt gcaagcccca gcgcatggag gtcggcactg cccctcgctg 360

gtccagcgga gggcatgcca agaacatcag gggtgctcat cggatagtga cgtaccatta 420

cgagacgaaa cagcgatgct cttaccggga ggactttcgg tcagtcgaca ttcgaacgag 480

acagtggaca tccgcaaaaa cttgagactt cgcaacccag acgatcctga atctaattcg 540

cacagagagt actgcgctca atacgaagtg actaaagtct cgaaagcctg ccacgcggat 600

tcggactaca aagcgttgag ggaaggcaat actgtatgcg tgctttgcga gtcggccgct 660

ttaagacgtg acttgaaatg gagatgtaat ggccatggcg tctctggaca cacgacgcgc 720

ttctacgcgc tcgtagctcc acactgtcac gggaagtgga tcagatccga ccacgacctg 780

gacaagacaa gcgactgctg caccaaccct gacttcatct ttgtttga 828

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 特异引物BmSTqRT上游引物

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acttgagact tcgcaaccca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 特异引物BmSTqRT下游引物

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tcgcaaagca cgcatacag 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 特异引物TIF-4AqRT上游引物

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<213> 人工序列

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<223> 特异引物TIF-4AqRT下游引物

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ctgactgggc ttgagcgata 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> BmST基因增量表达上游引物

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ggatccatgc accgccattt tcttt 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> BmST基因增量表达下游引物

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gcggccgctc aaacaaagat gaagtca 27

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 特异引物GP41qRT上游引物

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cgtagtagta gtaatcgccg c 21

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<213> 人工序列

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<223> 特异引物GP41qRT下游引物

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agtcgagtcg cgtcgcttt 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 检测引物BmGAPDHqRT上游引物

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<212> DNA

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<223> 检测引物BmGAPDHqRT下游引物

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ctgcctcctt gaccttttgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 特异引物S2qRT上游引物

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<223> 特异引物S2qRT下游引物

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<223> 特异引物S8上游引物

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<213> 人工序列

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<223> 特异引物S8下游引物

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tactataggt gagggcaatg gt 22