一种去除富硒茶蛋白中茶多糖、糖蛋白的方法与流程

本发明涉及蛋白质提取纯化研究领域，具体涉及一种去除富硒茶蛋白中茶多糖、糖蛋白的方法。

背景技术：

富硒茶蛋白是从富硒绿茶中提取的一种硒含量非常的蛋白质，其占茶叶干重的15％-30％。富硒茶蛋白具有多种生物活性，如清除机体各种自由基、降低血脂的作用，同时对预防放射治疗时引起的的致突变有保护作用。王洪新等人研究表明茶叶粗蛋白具有显著(52.0％)清除超氧阴离子的活性。富硒茶蛋白因其富含有机硒、具有显著的生物活性，是人体补充硒的一种理想来源。

但在提取的富硒茶蛋白过程中，有部分游离态的茶多糖及一些与蛋白质结合的糖蛋白，不可避免的与富硒茶蛋白一起提取出来，混合在富硒茶蛋白中。大量研究表明，提取的植物蛋白质中含有10％-12％的多糖。

茶多糖、糖蛋白的存在，干扰富硒茶蛋白理化及生物活性的研究。由于富硒茶蛋白中混有茶多糖、糖蛋白，我们无法判定富硒茶蛋白粗品中的抗氧化、拮抗重金属离子等活性，是源于富硒茶蛋白，还是来自茶多糖，或其它杂质。故，我们需要选择适宜的方法去除富硒茶蛋白中茶多糖等杂质。

目前，蛋白质纯化的方法有多种。郑美瑜等采用分步调节pH沉淀法纯化茶蛋白，纯度达到90％。吴晓红等人采用Sephadex G-75凝胶过滤柱和DEAE 52离子交换层析对红松仁蛋白纯化，能得到较高的纯度。但以上方法都不能去除糖蛋白，也不能消除糖蛋白对蛋白质功能活性的干扰。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种去除富硒茶蛋白中茶多糖、糖蛋白的方法，从而能去除多糖、糖蛋白对蛋白性质研究的干扰，为富硒茶蛋白及其它蛋白的理化、生物活性研究提供物质基础。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种去除富硒茶蛋白中茶多糖、糖蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)脱色脱脂：将富硒茶蛋白粗品脱色脱脂，得到脱色脱脂后的富硒茶蛋白粗品；

(2)沉淀茶多糖、糖蛋白：向脱色脱脂后的富硒茶蛋白粗品中加入纯化水，调节pH使其完全溶解，然后加入乙醇，沉淀茶多糖及糖蛋白，离心后收集上清液，旋转蒸发浓缩，得到富硒茶蛋白浓缩液；

(3)富硒茶蛋白浓缩液纯化：调节富硒茶蛋白浓缩液pH，用DEAE Sepharose FF对富硒茶蛋白浓缩液进行纯化，纯化过程的洗脱液采用NaCl含量为0～0.8M的Tris-HCl缓冲液；

(4)蛋白、多糖含量测定：对收集的洗脱液，用紫外分光光度法在280nm测定蛋白吸收值，用硫酸-苯酚法在490nm处测定多糖吸收值；

(5)透析、冷冻干燥：收集A₂₈₀大于0.1的洗脱液，用半透膜进行透析，冷冻干燥，制得去除茶多糖、糖蛋白的富硒蛋白质精品。

作为优选的技术方案，所述的步骤(1)采用石油醚对富硒茶蛋白粗品脱色脱脂，挥干石油醚后，得到脱色脱脂后的富硒茶蛋白粗品。

采用石油醚进行脱色脱脂，保证得到色泽纯净、纯度高的富硒茶蛋白。

作为优选的技术方案，所述的步骤(2)中富硒茶蛋白粗品与纯化水的质量比为1:40～60；加入的乙醇使乙醇的体积浓度达到60～90％。

作为优选的技术方案，所述的步骤(2)中富硒茶蛋白粗品与纯化水的质量比为1:50。

作为优选的技术方案，所述的步骤(2)中加入的乙醇使乙醇的体积浓度达到70％。

作为优选的技术方案，所述的步骤(3)中调节富硒茶蛋白浓缩液pH为8.8，纯化过程的洗脱液采用pH为8.8、NaCl浓度分别为0M、0.2M、0.4M、0.6M和0.8M的25mM Tris-HCl缓冲液。

采用pH为8.8且含不同浓度NaCl的Tris-HCl缓冲液，保证洗脱液离子强度适宜，(1)能将茶多糖、糖蛋白与富硒茶蛋白分离开来，得到不含茶多糖、糖蛋白的富硒茶蛋白；(2)能将不同分子量的富硒茶蛋白分离开来，得到在不同梯度的、在同一梯度分子量单一的富硒茶蛋白。

步骤(4)采用硫酸-苯酚法在490nm测定多糖吸收值，能够检验此技术方案是否已去除富硒茶蛋白中茶多糖、糖蛋白，保证得到不含茶多糖、糖蛋白的富硒茶蛋白。

作为优选的技术方案，所述的步骤(5)采用3500Da的半透膜在电磁搅拌下透析，透析时间为24～72h。

作为优选的技术方案，该方法还适用于不富硒的普通茶蛋白、大豆蛋白、红豆蛋白、绿豆蛋白或大米蛋白中的多糖、糖蛋白的去除。

与现有技术相比，本发明采用乙醇沉淀结合DEAE Sepharose FF去除富硒茶蛋白中茶多糖、糖蛋白，利用多糖不溶于乙醇的特性，用一定浓度的乙醇沉淀多糖，初步去除富硒茶蛋白粗品中茶多糖、糖蛋白；再利用蛋白质、多糖、糖蛋白电荷性的差异，采用一定离子强度的缓冲液，用DEAE Sepharose FF对富硒茶蛋白浓缩液进一步脱掉茶多糖、糖蛋白，得到不同梯度的、不含茶多糖和糖蛋白的富硒茶蛋白精品。采用硫酸-苯酚法在490nm测定洗脱液的多糖吸收值，表明纯化后的富硒茶蛋白中不含茶多糖、糖蛋白，如图3所示，从而去除多糖、糖蛋白对蛋白性质研究的干扰，为富硒茶蛋白及其它蛋白的理化、生物活性研究提供物质基础。

本发明各步骤除了旋转蒸发，都可以在室温下操作，条件温和。

附图说明

图1为本发明的技术路线图；

图2为未去除茶多糖、糖蛋白的富硒茶蛋白洗脱曲线；

图3为去除茶多糖、糖蛋白后的富硒茶蛋白洗脱曲线；

图4为不含多糖的蛋白标准品BSA在280nm、490nm(苯酚-硫酸法)的吸收曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种去除富硒茶蛋白中茶多糖、糖蛋白的方法(技术路线参见图1)：

(1)脱色脱脂：将富硒茶蛋白粗品用石油醚脱色、脱脂，挥干石油醚，得到脱色脱脂的富硒茶蛋白粗品。

(2)沉淀糖蛋白、多糖：向富硒茶蛋白粗品中，加入纯化水(料液比1:50)，调节pH使富硒茶蛋白完全溶解。加入乙醇使其体积浓度达到70％，沉淀糖蛋白，离心，收集上清液，旋转蒸发浓缩至5-10ml。

(3)富硒茶蛋白浓缩液纯化：调节浓缩液pH为8.8，用pH为8.8、含NaCl浓度分别为0M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M的Tris-HCl缓冲液(25mM)洗脱，用DEAE Sepharose FF对其富硒茶蛋白浓缩液进行纯化。

(4)蛋白、多糖含量测定：对收集的洗脱液，用紫外分光光度法和硫酸-苯酚法分别在280nm和490nm测定蛋白和多糖吸收值。

(5)透析、冷冻干燥：收集A₂₈₀大于0.1的洗脱液，用3500Da半透膜进行透析72h，冷冻干燥，得富硒蛋白质精品。

本实验采用苯酚-硫酸法结合紫外分光光度法对常规的DEAE Sepharose FF纯化的富硒茶蛋白中多糖和蛋白进行定性分析(如图2)，结果表明，用常规纯化方法DEAE Sepharose FF纯化富硒茶蛋白，不能去除富硒茶蛋白中的多糖。

采用本发明的方法去除茶多糖、糖蛋白后的富硒茶蛋白的测定结果见图3，将该图与图4对比可知，去除茶多糖、糖蛋白后的富硒茶蛋白不含茶多糖及糖蛋白。

实施例2

一种去除普通茶蛋白中茶多糖、糖蛋白的方法：

(1)脱色脱脂：将普通茶蛋白粗品用石油醚脱色、脱脂，挥干石油醚，得到脱色脱脂的富硒茶蛋白粗品。

(2)沉淀糖蛋白、多糖：向普通茶蛋白粗品中，加入纯化水(料液比1：50)，调节pH使普通茶蛋白完全溶解。加入乙醇使其体积浓度达到80％，沉淀茶多糖、糖蛋白，离心，收集上清液，旋转蒸发浓缩至5-10ml。

(3)普通茶蛋白浓缩液纯化：调节浓缩液pH为8.8，用pH为8.8、含NaCl浓度分别为0M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M的Tris-HCl缓冲液(25mM)洗脱，用DEAE Sepharose FF对普通茶蛋白浓缩液进行纯化。

(4)蛋白、多糖含量测定：对收集的洗脱液，用紫外分光光度法和硫酸-苯酚法分别在280nm和490nm测定蛋白和多糖吸收值。

(5)透析、冷冻干燥：收集A₂₈₀大于0.1的洗脱液，用3500Da半透膜进行透析72h，冷冻干燥，得到普通蛋白质精品。

得到的普通蛋白质精品不含多糖、糖蛋白。

实施例3

一种去除红豆蛋白中多糖、糖蛋白的方法：

(1)脱色脱脂：将红豆蛋白粗品用石油醚脱色、脱脂，挥干石油醚，得到脱色脱脂后的红豆蛋白粗品。

(2)沉淀糖蛋白、多糖：向红豆蛋白粗品中，加入纯化水(料液比1：50)，调节pH使红豆蛋白完全溶解。加入乙醇使其体积浓度达到75％，沉淀多糖、糖蛋白，离心，收集上清液，旋转蒸发浓缩至5-10ml。

(3)红豆蛋白浓缩液纯化：调节浓缩液pH为8.8，用pH为8.8、含NaCl浓度分别为0M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M的Tris-HCl缓冲液(25mM)洗脱，用DEAE Sepharose FF对其红豆蛋白浓缩液进行纯化。

(4)蛋白、多糖含量测定：对收集的洗脱液，用紫外分光光度法和硫酸-苯酚法分别在280nm和490nm测定蛋白和多糖吸收值。

(5)透析、冷冻干燥：收集A₂₈₀大于0.1的洗脱液，用3500Da半透膜进行透析48h，冷冻干燥，得红豆蛋白质精品。

得到的红豆蛋白精品不含多糖、糖蛋白。

实施例4

一种去除绿豆蛋白中多糖、糖蛋白的方法：

(1)脱色脱脂：将绿豆蛋白粗品用石油醚脱色、脱脂，挥干石油醚，得到脱色脱脂的绿豆蛋白粗品。

(2)沉淀糖蛋白、多糖：向绿豆蛋白粗品中，加入纯化水(料液比1：50)，调节pH使绿豆蛋白完全溶解。加入乙醇使其体积浓度达到90％，沉淀多糖、糖蛋白，离心，收集上清液，旋转蒸发浓缩至5-10ml。

(3)绿豆蛋白浓缩液纯化：调节浓缩液pH为8.8，用pH为8.8、含NaCl浓度分别为0M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M的Tris-HCl缓冲液洗脱，用DEAE Sepharose FF对其绿豆蛋白浓缩液进行纯化。

(4)蛋白、多糖含量测定：对收集的洗脱液，用紫外分光光度法和硫酸-苯酚法分别在280nm和490nm测定蛋白和多糖吸收值。

(5)透析、冷冻干燥：收集A₂₈₀大于0.1的洗脱液，用3500Da半透膜进行透析48h，冷冻干燥，得绿豆蛋白质精品。

得到的绿豆蛋白质精品不含多糖、糖蛋白。

实施例5

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施中步骤(2)的富硒茶蛋白粗品与纯化水的质量比为1:40；加入的乙醇使乙醇的体积浓度达到60％。

得到的富硒茶蛋白精品不含多糖、糖蛋白。

实施例6

本实施例为去除大米蛋白中多糖、糖蛋白的方法，方法基本与实施例1相同。通过该方法最终得到的大米蛋白精品不含多糖、糖蛋白。

实施例7

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施中步骤(5)的透析时间为24h。得到的富硒茶蛋白精品不含多糖、糖蛋白。