一种香菇醒酒肽及其制备方法与应用与流程

本发明属于食品深加工技术领域，具体涉及一种提取自香菇足的醒酒肽及其制备方法与应用。

背景技术：
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酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是一种危及人类健康的疾病，导致其发生的主要原因是经常过量饮酒。近年来，酒精性肝病的发病率有逐年上升的趋势，在一些地区已成为第一大肝病，引起了世界各国的高度重视。在我国，其发病率在饮酒者中已高达6.81％。因此，高效可靠的解酒药物及其功能性食品已成为当今的研究热点。

肝内含有多种催化乙醇的酶系，乙醇进入肝脏以后在这些酶的作用下进行代谢，一般情况下，进入人体内的90％的乙醇会被ADH(乙醇脱氢酶)和ALDH(乙醛脱氢酶)脱氢酶系统催化完成代谢。因此探究脱氢酶系统ADH、ALDH的激活率可更准确地了解生物活性物质对乙醇处理的能力。

目前市场上的解酒保健品多以中草药提取物为主，关于蛋白水解醒酒多肽的报道多见于玉米肽或花生肽。

申请号为200810219536.7的中国发明专利申请《玉米醒酒肽饮料及其制备方法》公开了组成为玉米蛋白肽、食用甜味剂、食用酸味剂、其他辅料和水的玉米醒酒肽饮料。

申请号为201510747486.X的中国发明专利申请《一种花生粕醒酒肽的制备方法》提供一种花生粕醒酒肽的制备方法，步骤包括：以脱脂后的花生粕为原料，经浸提和水洗后，除去水溶性蛋白，所得沉淀加水和Amano SD-AY10蛋白酶酶解，灭酶后再加入Alcalase AF蛋白酶酶解、灭酶、离心、微滤和超滤，制得具有醒酒作用的分子量在1000～3000Da的花生粕多肽。体外试验表明，该多肽溶液对乙醇脱氢酶具有较高的激活率。

但目前尚未见以香菇足为原料制备的醒酒肽产品。香菇，营养丰富，但香菇足柄纤维化程度高，适口感差，常作副产物丢弃。本发明将以香菇足为原料，变废为宝，通过超高压提取，超滤、凝胶层析纯化后香菇足多肽的醒酒活性；探索以酒精损伤人类正常肝细胞L02为模型，香菇足多肽体外抗氧化活性及其对酒精损伤人类正常肝细胞的保护作用。

技术实现要素：
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为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种提取自香菇足的醒酒肽，所述醒酒肽为Ile-Pro-Leu-His，C端为His，N端为Ile；

为了获取上述产品，本发明以香菇足为原料，以碱提酸沉法提取香菇足粉中的蛋白，真空冷冻干燥后，将其配制成蛋白液进行超高压作用，再用碱性蛋白酶酶解，酶解液首先经过超滤分离，得到不同分子量范围(0-3KDa、3-5KDa、5-10KDa)的香菇足多肽，检测它们的ADH、ALDH醒酒酶激活率，得到超滤后酶激活率高的香菇足多肽，继续进行葡聚糖凝胶层析G-25纯化，同样检测它们的ADH、ALDH醒酒酶激活率，得到纯化后醒酒性高的香菇足多肽，再采用EASY nano-LC system液相色谱仪，C₁₈(75μm×100mm，3μm)，串联LTQ orbitrap velos pro质谱仪，测定香菇多肽的结构；继而对相应的多肽进行人工合成，检测ADH、ALDH酶激活率，从而得到香菇多肽中高醒酒活性的短肽序列。

有益效果：

本发明提供了一种新型醒酒肽以及含有该醒酒肽的醒酒产品，其醒酒作用明显，且采用香菇足为原料，生产成本低，经济效益高。

基于试验结果，超滤酶解后的香菇足多肽，ADH、ALDH酶激活率测定结果为分子量在0-3KDa的香菇足多肽醒酒酶激活最高，均高于葛根总异黄酮阳性对照组，合成的短肽序列也被证明有较高的醒酒酶激活率。ADH、ALDH是乙醇代谢中的重要酶类，因此本发明有利于加速乙醇在肝脏内的代谢，具有醒酒活性。

附图说明：

图1不同分子量多肽对ADH和ALDH的激活作用；

图2葡聚糖凝胶层析纯化图；

图3葡聚糖凝胶层析纯化后小分子多肽对ADH和ALDH的激活作用；

图4香菇足多肽液质质谱图；

图5人工合成多肽Ile-Pro-Leu-His质谱图；

图6人工合成多肽Ile-Pro-Ile-Val-Leu-Leu质谱图；

图7人工合成小分子多肽HD1(IPLH)、HD2(IPIVLL)对ADH和ALDH的激活作用；

图8不同的多肽和乙醇添加顺序对L02细胞增值的影响

其中，0为不添加香菇多肽，25为添加25mg/L 1号峰多肽，50为添加50mg/L 1号峰多肽，100为添加100mg/L 1号峰多肽，G10为添加10mg/L葛根；

图9 ADH、ALDH Elisa试验测定其溢出量的结果

其中，G10表示对照组；D25，D50，D100分别表示实验组中添加25mg/L、50mg/L、100mg/L的1号峰多肽。

具体实施方式：

实施例1：香菇足多肽的提取方法

(1)碱提酸沉：

新鲜香菇足烘干粉碎后过60目筛，准确称取10.00g香菇足粉，放入400mL的烧杯中，添加体积为200mL的蒸馏水，调节pH至10.0，搅拌均匀后放在100W超声波中超声20min，超声完后立即取出，置于4℃条件下静置提取2h，4000r/min离心10min，取上清蛋白液备用。用浓度为1mol/L的盐酸调节上清液的pH至4.0，室温静置1h，4000r/min离心10min，得到香菇足蛋白沉淀，用1mol/L NaOH调pH值至7.0，得到香菇足蛋白，沉淀物真空冷冻干燥至恒重得香菇足蛋白粉，获得的上清液重复上述碱提酸沉提取过程三次，将3次提取的蛋白混合。

(2)超高压处理：

准确称取0.80g香菇足蛋白粉，添加40mL蒸馏水，配制成香菇蛋白浓度为2％的溶液于4℃冰箱中冷藏过夜使蛋白水合彻底，混合均匀后置于聚氯乙烯袋中真空密封，立即于超高压容器中进行处理。处理温度保持在18℃，超高压处理条件为400MPa，保压时间为10min。

(3)碱性蛋白酶处理：

将超高压处理后的香菇足蛋白经真空冷冻冻干得蛋白粉，用蒸馏水配制成浓度为5％的溶液，利用碱性蛋白酶Alcalase酶解蛋白，酶与底物比E/S＝5％，pH＝8.5，55℃水浴震荡2h，每隔5min测一次pH值，用1mol/L的碱调pH值，确保pH值一直保持在8.5，2h后立即将温度调至90℃灭酶活10min，取出调pH＝7，4000r/min离心10min，取上清液。

(4)香菇足多肽纯化方法

粗香菇足多肽→溶解→过超滤机→真空冷冻干燥→配制成小分子多肽溶液→葡聚糖凝胶层析纯化→纯化液冻干保存

将香菇足蛋白酶解物4000r/min离心10min取上清液，0.8μm微滤处理后，经10KDa超滤膜截流分离，保留浓缩液；将滤液再经5KDa超滤膜截流分离，保留浓缩液；将滤液再经3KDa超滤膜截流分离，保留浓缩液。超滤过程保持组件最大工作压力为0.1MPa，依次制备分子量为5-10KDa、3-5KDa、3KDa以下的香菇足多肽溶液。

采用葡聚糖凝胶层析(Sephadex G-25)对超滤后的香菇足多肽进行分离。分离条件为：上样量为50mg/mL，3mL，层析色谱柱规格为1.6×60cm，流速：1mL/min，蒸馏水作为洗脱液，采用紫外检测器检测，波长为220nm。

实施例2不同分子量的香菇足多肽对ADH、ALDH激活率的影响

分别称取实施例1步骤(4)超滤后得到的5-10KDa、3-5KDa、3KDa以下的香菇足多肽溶液的冻干粉10mg，葛根异黄酮1mg，分别溶解在1mL的水里，配制成浓度为10mg/mL的多肽和浓度为1mg/mL的葛根异黄酮溶液。

分为4个处理:

处理1：0.1mL的5-10KDa的多肽溶液；

处理2：0.1mL的3-5KDa的多肽溶液；

处理3：0.1mL的3KDa以下的多肽的溶液；

处理4：阳性对照组：0.1mL的葛根异黄酮溶液；

分别按照ADH和ALDH激活率方法进行测定，每个处理重复三次，测定并计算ADH、ALDH的激活率。

结果如图1所示，当香菇足多肽浓度为10mg/mL时，随着分子量增加，ADH酶激活率逐渐降低，0-3KDa香菇足多肽ADH酶激活率70.79％，略高于浓度为1mg/mL葛根总异黄酮，但5-10KDa的香菇足多肽ADH酶激活率低于葛根对照；

0-3K、3-5K、5-10KDa香菇多肽及葛根异黄酮的ALDH的酶激活率差异性显著，且0-3KDa香菇足多肽ALDH激活率最高为71.35％；

由表1的ADH和ALDH的半数激活率可见，0-3KDa的小分子多肽的激活性更好。因此可知，香菇多肽具有一定的ADH、ALDH酶激活性，且小分子多肽激活性更为显著。

表1不同分子量多肽对ADH和ALDH激活率的半数激活率值

实施例3 0-3KDa的小分子多肽葡聚糖凝胶层析

采用葡聚糖凝胶层析(Sephadex G-25)对超滤后的0-3KDa的小分子多肽进行分离。分离条件为：上样量为50mg/mL，3mL，层析色谱柱规格为1.6×60cm，流速：1mL/min，蒸馏水作为洗脱液，采用紫外检测器检测，波长为220nm。

超滤后的0-3KDa的小分子多肽进行葡聚糖凝胶层析G-25，得出两个峰的多肽1号峰和2号峰，结果如图2所示，对其进行ADH、ALDH激活率测定，结果如图3所示。1号峰ADH、ALDH酶激活率均高于2号峰(P＜0.05)，1号峰、2号峰分别测得ADH激活率72.00％、40.13％，ALDH激活率为73.42％、21.05％。由表2ADH和ALDH激活率的半数激活率可以看出，经纯化得到的1号峰香菇足多肽的活性更高。

表2葡聚糖凝胶层析纯化后小分子多肽对ADH和ALDH激活作用的半数激活率

实施例4香菇足多肽液质质谱分析

以实施例3获得的1号峰多肽为实验样品，采用EASY nano-LC system液相色谱仪，C₁₈(75μm×100mm，3μm)，串联LTQ orbitrap velos pro质谱仪，测定香菇多肽的结构。流速为0.3mL/min，进样量为5μL，液相色谱条件和质谱条件如下：

表3液相分离色谱条件

质谱条件：

质谱仪：LTQ orbitrap velos pro质谱仪

采用纳升电喷雾正离子的离子化方式，喷口电压为2200V，毛细管温度300℃，毛细管电压为2500V，锥孔电压为35V，采集范围：MS：50-1800；分辨率60000，MS/MS采集模式：top 15。采用Thermo Xcalibur V2.2.48进行数据分析，单次进样分析时间为85min，平行三次。

图4是香菇足多肽质谱结构图，通过液质结构分析，葡聚糖凝胶层析的1号色谱峰的多肽数量为9个，分别为IPLH、IPIVLL、RDKTIIVW、NQVFQIIKLE、QRESMLLVHSLARS、RSLLLFKRGQLITEK、VVPKPVPALNKPATF、SAPALNTFGRRSPSPSTIA、KYLKDMNKLLKKLKLPTIWLTPAGLI，分别占多肽比重的3.97％，2.35％，15.84％，0.94％，5.20％，6.35％，12.74％，2.97％和2.62％。

实施例5合成两种多肽ADH、ALDH激活作用

人工合成其中两个短肽IPLH(HD1)，见图5；IPIVLL(HD2)，见图6，多肽浓度为2.5mg/mL时测得ADH、ALDH激活率(如图7)分别为42.7％、29.2％；32.3％、24.0％，HD1激活率较高。表4是人工合成的短肽HD1和HD2对ADH和ALDH激活率的半数激活率，可知短肽HD1的ADH和ALDH的半数激活率要小于HD2的半数激活率，这也说明，HD1的酶激活性要比HD2要高。

表4 HD1和HD2对ADH和ALDH激活作用的半数激活率

实施例6香菇多肽添加方式对乙醇致损细胞的作用

实验材料：

L02细胞：上海博研生物科技有限公司；

香菇足多肽：1号峰多肽；

ADH、ALDH Elisa试剂盒：南京建成生物工程研究所；

1、先加100μL不同浓度(25、50、100mg/L)的香菇足多肽(选用的是3kDa以下的多肽，经葡聚糖凝胶层析G-25后的1号峰多肽)于细胞中培养24h后吸弃培养液，加200mmol/L乙醇，培养24h后测MTT；

2、先加200mmol/L乙醇致损细胞，培养24h后吸弃培养液，加不同浓度(25、50、100mg/L)的香菇足多肽，培养24h后测MTT；

3、香菇足多肽和乙醇同时加入到含有细胞的96孔板中，培养48h后测MTT。

注意：MTT试验细胞浓度为5×10⁴.葛根添加浓度为10mg/L作为对照组。

最佳多肽与乙醇添加顺序的试验结果：

不同添加顺序的不同浓度的香菇足多肽与乙醇孵育的L02，经过MTT试验测得吸光值反映细胞存活率，结果如图8，人类正常肝细胞先加不同浓度的香菇足多肽培养24h后再加入200mmol/L乙醇致损培养24h，细胞存活率明显高于其他两组—乙醇、多肽同时添加和先加乙醇后加多肽处理。香菇足多肽添加浓度为25、100mg/L，葛根添加浓度为10mg/L，经乙醇致损后细胞存活率均高于其他两组，香菇多肽添加浓度为50mg/L的先多肽后乙醇组细胞存活率高于乙醇多肽同时添加组，略低于先加乙醇后加多肽组，因此，综合考虑，本研究选用先加香菇足多肽后加乙醇的处理进行后续试验。

根据MTT试验结果得出乙醇致损L02细胞的最适宜浓度为200mmol/L，香菇足多肽最佳施药浓度为25、50、100mg/L，即1mol乙醇服用量在0.0027-0.0109mg，最适添加顺序为先加香菇多肽再进行乙醇损伤L02的处理。

实施例7 ADH、ALDH Elisa试验

L02细胞：上海博研生物科技有限公司；

香菇足多肽：1号峰多肽；

ADH、ALDH Elisa试剂盒：南京建成生物工程研究所；

取处于对数生长期的L02细胞接种于96孔板里进行培养，每孔细胞1×10⁶个，培养24h细胞贴壁后，分为四组：

1、空白组：只加无血清且含0.1％DMSO的培养基；

2、模型组：只加最佳致损度浓度为200mmol/L乙醇；

3、对照组：先加10mg/L的葛根醇提物培养24h后换液为200mmol/L乙醇；

4、试验组：高100mg/L、中50mg/L、低25mg/L浓度的香菇足多肽培养24h后换液为200mmol/L乙醇；

每组6个复孔，每孔100μL，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，继续培养24h后取细胞上清液进行Elisa ADH、ALDH指标检测。

ELISA法检测ADH、ALDH溢出量

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)，细胞上清液ADH、ALDH溢出量的测定严格按照试剂盒说明书的操作步骤进行。

ADH、ALDH Elisa试验测量其溢出量的结果

研究表明：机体受到乙醇刺激后，肝细胞产生ADH以代谢乙醇，乙醇氧化为乙醛，ALDH将乙醛氧化为乙酸。因此随着乙醇代谢量的增加，ADH、ALDH的释放亦逐渐增加；

结果如图9显示：与空白对照组相比，乙醇干预24h后的ADH溢出量明显增多，施加香菇足多肽及葛根异黄酮组ADH溢出量有所降低，且随着香菇足多肽浓度越高，ADH溢出量越低。葛根对照组对ADH溢出量略大于50mg/L浓度的香菇多肽，但小于25mg/L；乙醇干预L02肝细胞后，与空白细胞相比ALDH溢出量显著性增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)，施加香菇足多肽和葛根异黄酮后可降低ALDH溢出量，香菇足多肽浓度为25mg/L时，细胞ALDH溢出量最少，葛根对照组的细胞ALDH溢出量最高。