蛋白质TaTFL1‑2D及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质tatfl1-2d及其编码基因与应用。

背景技术：

小麦是世界上主要的粮食作物之一，全世界35-40％的人口以它为主要的食物来源。目前，在有限耕地面积的情况下，选育单产突出的小麦新品种是稳定和提高小麦产量最经济有效的途径。因此，小麦的结实性器官“小麦穗”一直是小麦育种学家研究的重要对象。

花在花序柄上有规律的排列方式称为花序，花序发育是植物形态建成的重要组成，花序分生组织由茎尖分生组织分化、发育而来，侧部器官由幼叶、侧枝进一步发育成为花及花序(即小穗)。小麦为复穗状花序，穗轴上着生若干轴节，每个轴节基部着生一个小穗。每个小穗产生3-10朵小花。穗型性状包括穗粒数、小穗数和小花数。于振文等研究表明，穗粒重与籽粒产量之间有极显著的正相关。因此，高产田可以侧重于改善单株的生长发育条件，提高单穗生产力。每穗粒数与每穗粒重之间存在极显著的正相关，千粒重与每穗粒重间仅表现一定的正向关系，说明在一定的栽培条件下，通过增加每穗粒数的途径提高穗粒重是一种可行的途径。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何调控小麦穗型性状和/或幼穗发育时间。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质tatfl1-2d。

本发明所提供的蛋白质tatfl1-2d，来源于小麦(triticumaestivuml.)，可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物穗型性状和/或生殖器官发育时间相关的蛋白质；所述穗型性状为d1)和/或d2)和/或d3)：d1)穗粒数；d2)小穗数；d3)小花数。

其中，序列表中序列2可由173个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：

b1)编码区如序列表中序列1所示的dna分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质tatfl1-2d的dna分子；

b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质tatfl1-2d的dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

其中，序列表中序列1由522个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质tatfl1-2d的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质tatfl1-2d的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质tatfl1-2d，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质tatfl1-2d的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

含有编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒pubi::tatfl1-2d-pahc25。所述重组质粒pubi::tatfl1-2d-pahc25具体可为将载体pubi-pahc25的限制性内切酶bamhⅰ和kpnⅰ识别序列间的小片段替换为序列表中序列1自5’末端起第1至519位所示的dna分子。

所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。

所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述tatfl1-2d基因(即蛋白质tatfl1-2d的编码基因)转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

下述g1)或g2)也属于本发明的保护范围：

g1)所述蛋白质tatfl1-2d，或，编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子，或，含有编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物穗型性状和/或生殖器官发育时间中的应用；

g2)所述蛋白质tatfl1-2d，或，编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子，或，含有编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育穗型性状改变和/或生殖器官发育时间改变的转基因植物中的应用；

所述穗型性状可为d1)和/或d2)和/或d3)：d1)穗粒数；d2)小穗数；d3)小花数。

上述应用中，所述调控植物穗型性状可为植物穗型性状优。所述穗型性状优可体现为e1)和/或e2)和/或e3)：e1)穗粒数增加；e2)小穗数增加；e3)小花数增加。所述调控植物生殖器官发育时间具体可为延长植物生殖器官发育时间。所述延长植物生殖器官发育时间具体可为延长植物幼穗发育时间。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，可包括将编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的穗型性状改变和/或生殖器官发育时间延长。

上述方法中，编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：

b1)编码区如序列表中序列1所示的dna分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质tatfl1-2d的dna分子；

b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质tatfl1-2d的dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

其中，序列表中序列1由522个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

上述方法中，所述“将编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子导入受体植物中”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质tatfl1-2d的核酸分子得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为所述重组质粒pubi::tatfl1-2d-pahc25。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法。

本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质tatfl1-2d的含量和/或活性，从而穗型性状改变和/或生殖器官发育时间延长。

上述任一所述方法中，所述穗型性状改变为穗粒数增加和/或小穗数增加和/或小花数增加。所述生殖器官发育时间延长表现为幼穗发育时间延长。所述幼穗发育时间具体可为幼穗在二棱期的发育时间和/或幼穗在小花分化期的发育时间。

上述任一所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)小麦；c5)小麦品种科农199。

实验证明，在科农199中过表达蛋白质tatfl1-2d，可显著延长幼穗的发育时间(如在二棱期的发育时间、在小花分化期的发育时间)，进而导致小穗数增加、小花数增加和穗粒数增加。因此，蛋白质tatfl1-2d在调控小麦穗型性状和幼穗发育时间中具有重要的应用价值，在培育小麦品种中具有广阔前景。

附图说明

图1为tatfl1-2d基因的相对表达量与每穗小穗数的相关性分析。

图2为tatfl1-2d基因的相对表达量与每穗小花数的相关性分析。

图3为tatfl1-2d基因的相对表达量与每穗穗粒数的相关性分析。

图4为电镜扫描的部分实验结果。

图5为各个发育时期发育天数的部分统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

rnaminiprepkit为axygen公司的产品。transscriptfirst-strandcdnasynthesissupermixkit为transgen的产品。premixextaq^tm为takara公司的产品。逆转录酶为transgen的产品，产品目录号为at301-02。kod-plus-dna聚合酶和10×pcrbufferforkod-plus均为toyobo公司的产品，产品目录号为kod-201。载体pgem-teasy为promega公司的产品，产品目录号为a3600。扫描电子显微镜临界点干燥仪为hitachi公司的产品，产品型号为hcp-2。冷冻扫描电子显微镜为hitachi公司的产品，产品型号为s-3000n。

载体pubi-pahc25记载于如下文献中：jingwang，jinghansun，etal.aphosphatestarvationresponseregulatorta-phr1isinvolvedinphosphatesignallingandincreasesgrainyieldinwheat.annbot.2013jun；111(6)：1139-53.

实施例1、tatfl1-2d基因的克隆

1、提取小麦品种科农199(以下简称科农199)处于二棱期的幼穗组织的总rna，然后将该总rna用逆转录酶反转录出第一链cdna，即得到科农199幼穗组织的cdna。科农199幼穗组织的cdna中dna含量均为50ng/μl。

2、以步骤1得到的科农199幼穗组织的cdna为模板，采用引物f：5’-ggtagctagccatggctagggtgc-3’和引物r：5’-gcaagagaagaaggggtgggctg-3’进行pcr扩增，得到约643bp的pcr扩增产物。

反应体系为50μl，由1μlkod-plus-dna聚合酶、1μl模板、5μl10×pcrbufferforkod-plus、5μl浓度为2mm的dntps水溶液(即datp、dttp、dctp和dgtp的浓度均为2mm)、2μl浓度为25mm的mgso4水溶液、1.5μl浓度为10μm的引物f水溶液、1.5μl浓度为10μm的引物r水溶液和33μl水组成。

反应条件：98℃预变性2min；98℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸45s，35个循环。

3、将步骤2得到的pcr扩增产物和载体pgem-teasy连接，得到重组质粒pgem-teasy-tatfl1-2d。

对重组质粒pgem-teasy-tatfl1-2d进行测序。测序结果表明，重组质粒pgem-teasy-tatfl1-2d中含有序列表中序列1所示的dna分子(以下命名为tatfl1-2d基因)。

实施例2、转tatfl1-2d基因小麦的获得及其鉴定

一、构建重组质粒pubi::tatfl1-2d-pahc25

1、以实施例1构建的重组质粒pgem-teasy-tatfl1-2d为模板，以5’-ggatccatggctagggtgctggagcc-3’(下划线为限制性内切酶bamhⅰ的酶切识别序列)和5’-ggtaccgcggcggcgtgccgctgtctccc-3’(下划线为限制性内切酶kpnⅰ的酶切识别序列)为引物，进行pcr扩增，得到约530bp的pcr扩增产物。

2、用限制性内切酶bamhⅰ和kpnⅰ双酶切步骤1获得的pcr扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶bamhⅰ和kpnⅰ双酶切载体pubi-pahc25，回收约6.9kb的载体骨架。

4、将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒pubi::tatfl1-2d-pahc25。

根据测序结果，对重组质粒pubi::tatfl1-2d-pahc25进行结构描述如下：将载体pubi-pahc25的限制性内切酶bamhⅰ和kpnⅰ识别序列间的小片段替换为序列表中序列1自5’末端起第1至519位所示的dna分子。重组质粒pubi::tatfl1-2d-pahc25表达序列表中序列2所示的蛋白质(以下命名为tatfl1-2d蛋白或蛋白质tatfl1-2d)。

二、t0代拟转tatfl1-2d基因小麦的获得

采用基因枪介导的遗传转化方法，将重组质粒pubi::tatfl1-2d-pahc25转化科农199，获得t0代拟转tatfl1-2d基因小麦。

采用基因枪介导的遗传转化方法，将载体pubi-pahc25转化科农199，获得t0代转空载体小麦。

三、t0代拟转tatfl1-2d基因小麦的实时定量pcr检测

随机选取96株t0代拟转tatfl1-2d基因小麦进行实时定量pcr检测，具体步骤如下：

1、采用rnaminiprepkit分别提取96株t0代拟转tatfl1-2d基因小麦处于二棱期的幼穗组织的总rna，然后采用transscriptfirst-strandcdnasynthesissupermixkit将该总rna反转录出第一链cdna，得到各个t0代拟转tatfl1-2d基因小麦的cdna。各个t0代拟转tatfl1-2d基因小麦的cdna中dna含量约为55ng/μl。

2、使用rt-qpcr技术检测各个t0代拟转tatfl1-2d基因小麦中tatfl1-2d基因的相对表达量(以β-tatubulin基因作为内参基因)。

检测tatfl1-2d基因的引物为正向引物1：5’-tttggaagggaggtggtgag-3’和反向引物1：5’-cggcgtgtgttgaagtagtc-3’。检测β-tatubulin基因的引物为正向引物2：5’-accgccagctcttccaccct-3’和反向引物2：5’-tcactggggcataggaggaa-3’。

反应体系为20μl，由10μlpremixextaq^tm、0.5μl浓度为10μm的正向引物、0.5μl浓度为10μm的反向引物、1μlt0代拟转tatfl1-2d基因小麦的cdna和8.0μl无核酸酶水组成。

反应程序：94℃预变性2min；95℃变性3sec，60℃退火30sec，40个循环。

按照上述方法，将t0代拟转tatfl1-2d基因小麦替换为科农199，其它步骤均不变，得到科农199中tatfl1-2d基因的相对表达量。

按照上述方法，将t0代拟转tatfl1-2d基因小麦替换为t0代转空载体小麦，其它步骤均不变，得到t0代转空载体小麦中tatfl1-2d基因的相对表达量。

以科农199中的tatfl1-2d基因的相对表达量作为1，统计其它各个小麦中tatfl1-2d基因的相对表达量。结果表明，与科农199相比，35株t0代拟转tatfl1-2d基因小麦(分别命名为oe-1-t0至oe-35-t0)中tatfl1-2d基因的相对表达量均显著增加，而t0代转空载体小麦中tatfl1-2d基因的相对表达量则无显著差异。

四、t2代转tatfl1-2d基因小麦和t4代转tatfl1-2d基因小麦的获得及实时定量pcr检测

将oe-1-t0至oe-35-t0经连续两代自交，获得t2代转tatfl1-2d基因小麦，分别命名为oe-1-t2至oe-35-t2。

将oe-1-t0至oe-35-t0经连续四代自交，获得t4代转tatfl1-2d基因小麦，分别命名为oe-1-t4至oe-35-t4。

将t0代转空载体小麦经连续两代自交，获得t2代纯合转空载体小麦。

将t0代转空载体小麦经连续四代自交，获得t4代纯合转空载体小麦。

按照步骤三的方法，对oe-1-t2至oe-35-t2、oe-1-t4至oe-35-t4、t2代纯合转空载体小麦、t4代纯合转空载体小麦和科农199分别进行实时定量pcr检测。结果表明，与科农199相比，oe-1-t2至oe-35-t2和oe-1-t4至oe-35-t4中tatfl1-2d基因的相对表达量均显著增加，而t2代纯合转空载体小麦和t4代纯合转空载体小麦中tatfl1-2d基因的相对表达量则无显著差异。

五、tatfl1-2d基因的相对表达量与小麦穗型性状的相关性分析

待测小麦为oe-1-t2、oe-2-t2、oe-3-t2、oe-4-t2、oe-5-t2、oe-6-t2、oe-7-t2、oe-8-t2、oe-9-t2、oe-10-t2、oe-11-t2、oe-12-t2、oe-13-t2、oe-14-t2、oe-15-t2、oe-16-t2、oe-17-t2、oe-18-t2、oe-19-t2、oe-20-t2、oe-21-t2、oe-22-t2、oe-23-t2、oe-24-t2、oe-25-t2、oe-26-t2、oe-27-t2、oe-28-t2、oe-29-t2、oe-30-t2、oe-31-t2、oe-32-t2、oe-33-t2、oe-34-t2或oe-35-t2。

将待测小麦种植于温室，待开花后20d，调查每穗小穗数、每穗小花数和每穗穗粒数，然后与tatfl1-2d基因的相对表达量进行相关性分析。培养条件具体如下：温度25℃，光照350μmolphotonsm^-2s^-1，湿度60-70％。

实验结果见图1、图2和图3。结果表明，tatfl1-2d基因的相对表达量与每穗小穗数、每穗小花数和每穗穗粒数均正相关，即tatfl1-2d基因的相对表达量越高，则每穗小穗数、小花数和穗粒数的数量越多。

六、tatfl1-2d基因的相对表达量与小麦幼穗发育时间的研究

待测小麦为oe-1-t4、oe-2-t4、t4代纯合转空载体小麦或科农199。

取30株待测小麦幼穗进入单棱期后的第3d、第10d、第15d或第21d的幼穗，先置于甲醇中浸泡15min，再置于无水乙醇中浸泡30min，然后采用扫描电子显微镜临界点干燥仪冷冻干燥2h，最后采用冷冻扫描电子显微镜进行电镜扫描。根据电镜扫描结果，统计待测小麦幼穗在二棱期、小花分化期和雌雄蕊分化期的发育天数。

电镜扫描的部分实验结果见图4(a为科农199，b为oe-1-t4；lp为外稃原基，gp为护颖原基，fm为小花分生组织，数字13、14、16为小穗数，白色五角星为小穗)。各个时期发育天数的部分统计结果见图5(wt为科农199)。结果表明，与科农199相比，oe-1-t4和oe-2-t4的幼穗在二棱期和小花分化期的发育时间均显著延长(在单棱期和雌雄蕊分化期的发育时间无显著差异)，而t4代纯合转空载体小麦的幼穗在单棱期、二棱期、小花分化期和雌雄蕊分化期的发育时间无显著差异。因此，在科农199中过表达tatfl1-2d基因，可显著延长幼穗的发育时间(如在二棱期的发育时间和在小花分化期的发育时间)，进而导致小穗数增加、小花数增加和穗粒数增加。

上述结果表明，蛋白质tatfl1-2d在调控小麦穗型性状(如小穗数、小花数、穗粒数)和幼穗发育时间(如幼穗在二棱期的发育时间和/或幼穗在小花分化期的发育时间)中具有重要的应用价值。

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>蛋白质tatfl1-2d及其编码基因与应用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>522

<212>dna

<213>小麦（triticumaestivuml.）

<400>1

atggctagggtgctggagcctctcatcattggaaaggtcatcggggaggtcatcgacaac60

ttcaacccaacagtgaagatgacggtgacctacagctccaacaagcaggtgttcaacggc120

cacgagttcttcccgtcggcggtcgtgtccaagccacgcattgaagtccagggtggggac180

atgagatccttcttcactctggtcatgacggacccagatgtgccagggcctagtgatcca240

taccttagggagcatctccactggatcgtcagtgatattcctggcaccacagatgcttct300

tttggaagggaggtggtgagctacgagagccccaagcccaacattggcattcacaggttc360

accttcgtgctgttccaacagaagaagcggcaggccatgaaccctccctccaccagggac420

tacttcaacacacgccgcttcgctgacgagaacgaccttggcctcccggtcgctgccgtc480

tacttcaacgcgcagcgggagacagcggcacgccgccgctga522

<210>2

<211>173

<212>prt

<213>小麦（triticumaestivuml.）

<400>2

metalaargvalleugluproleuileileglylysvalileglyglu

151015

valileaspasnpheasnprothrvallysmetthrvalthrtyrser

202530

serasnlysglnvalpheasnglyhisgluphepheproseralaval

354045

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505560

phethrleuvalmetthraspproaspvalproglyproserasppro

65707580

tyrleuarggluhisleuhistrpilevalseraspileproglythr

859095

thraspalaserpheglyarggluvalvalsertyrgluserprolys

100105110

proasnileglyilehisargphethrphevalleupheglnglnlys

115120125

lysargglnalametasnproproserthrargasptyrpheasnthr

130135140

argargphealaaspgluasnaspleuglyleuprovalalaalaval

145150155160

tyrpheasnalaglnarggluthralaalaargargarg

165170