本发明涉及药物化学技术领域，尤其是一种含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物及其制备方法及应用。
背景技术：
植物病害一直是农作物优质高产的重要制约因素之一。据估计，全球主要农作物的平均损失约占总产量的10％～15％，每年直接经济损失高达数千亿美元。其中，植物病原细菌和真菌是严重威胁我国的粮食及农作物的生产最重要的因素，为了控制细菌性病害和真菌性病害，迫切需要制备高效的抗病原细菌和真菌的活性小分子。但目前使用的商品化抗菌药物的活性不够高效，筛选和寻找高效杀菌的活性化合物，是当前新农药创制研发的重要环节。
而基于吡啶盐的化合物因具有广泛的生物活性(如抗革兰氏阳性(或阴性)菌等)成为研究学者研究的热点之一。同时，吡唑类化合物和含1,3,4-噁(噻)二唑基的硫醚类化合物在农药方面表现出广谱的生物活性，商品化的药剂有农用杀菌剂唑菌胺酯(pyraclostrobin)、杀虫剂氟虫腈(fipronil)、除草剂唑草胺(cafenstrole)、除草剂嘧硫草醚(pyrithiobac-sodium)等。
为了寻找高效杀菌的活性化合物，本发明以吡唑联噁(噻)二唑氧醚、硫醚类化合物为基础，将能够提高目标化合物生物活性的吡啶盐基团引入到此体系中，合成一系列含吡啶盐的吡唑联噁二唑类化合物，测试其生物活性，为新农药的研发和创制提供重要的科学基础。
含吡唑基团、噁二唑基团以及吡啶盐结构的活性小分子的生物活性研究进展如下：
2016年hafez等[hafez,h.n.；el-gazzar,a.r.；al-hussain,s.a.,novelpyrazolederivativeswithoxa/thiadiazolyl,pyrazolylmoietiesandpyrazolo[4,3-d]-pyrimidinederivativesaspotentialantimicrobialandanticanceragents.bioorg.med.chem.lett.,2016,26,2428-2433]合成了一系列含噁唑(噻唑或嘧啶)结构的吡唑类衍生物，大部分的化合物都具有较好的抗菌活性。其中3b,7b,9,10b,15,19a对gram-(-)大肠杆菌(escherichiacoli)、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)和gram-(+)乳酸链球菌(streptococcuslactis)、金色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，以及两种真菌白色念珠菌(candidaalbicans)、黄曲霉菌(aspergillusflavus)具有较高的活性，优于其对照药剂氨噻肟唑头孢菌素。尤其是化合物3b对乳酸链球菌(streptococcuslactis)、金色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的最小抑制浓度分别为5和10μg/ml，明显出高于对照药(cefatoxime，mic＝12,15μg/ml)。
2016年，desai等[desai,n.c.；kotadiya,g.m.；trivedi,a.r.；khedkar,v.m.；jha,p.c.,synthesis,biologicalvaluation,andqsarstudiesofnovelpyrazolebearingpyridyloxadiazoleanaloguesaspotentialantimicrobialagents.med.chem.res.,2016,25712-727.]合成了一系列的含吡啶基噁二唑联吡唑类似物。其中化合物5e、5f、5j、5k和5l对细菌gram-(+)酿脓葡萄球菌(staphylococcuspyogenes)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和gram-(-)大肠杆菌(escherichiacoli.)、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)以及真菌白色念珠菌(candidaalbicans)、黑曲霉菌(aspergillusniger)和棒曲霉菌(aspergillusclavatus)展现了较好的抑制活性，且比对照药剂细胞毒性低，具有成为潜在的抗微生物剂的前景。其中，5l(取代基甲氧基处于对位)对细菌金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)和真菌黑曲霉菌(aspergillusniger)展现出了最高的抑制活性mic＝12.5μg/ml构效关系：当苯环上取代基为供电子基团时，活性明显优于苯环上取代基为吸电子基的化合物，供电子基对活性具有积极的作用。
2016年shetty等[shetty,p.；praveen,b.m.；raghavendra,m.；manjunath,k.；cheruku,s.,synthesisandantimicrobialevaluationofnovel4-amino-6-(1,3,4-oxadiazolo/1,3,4-thiadiazolo)-pyrimidinederivatives.moleculardiversity2016,20,391-398]报道了一系列4-氨基-6-(1,3,4-噁二唑/1,2,4-三氮唑)嘧啶类衍生物，生物活性测试结果表明，化合物表现出一定的抗革兰氏阳性(或阴性)菌及真菌的活性，如抗gram-(+)：枯草杆菌(bacillussubtilis)，肠球菌(enterococcusfaecalis)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)；抗gram-(-)：大肠杆菌(escherichiacoli)克雷伯氏菌(klebsiellapneumonie)和绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)，真菌黄曲霉菌(aspergillusflavus)、烟曲霉菌(aspergillusfumigatus)、马尔尼菲青霉(penicilliummarneffei)和须毛癣菌(trichophytonmentagrophytes)。其中化合物7f对四种细菌以及四种真菌的最小抑制浓度(minimalinhibitionconcentration,mic)都为6.25μg/ml。
2015年，chen等[desai,n.c.；bhatt,n.；dodiya,a.；karkar,t.；patel,b.；bhatt,m.,synthesis,characterizationandantimicrobialscreeningofthiazolebased1,3,4-oxadiazolesheterocycles.res.chem.intermediat.,2015,42,3039-3053.]合成了一系列含噻唑联噁二唑基苯甲酰胺类化合物，生物活性测试表明，化合物5e、5k和5a、5b分别对四种细菌(mic＝12.5-25μg/ml)gram(+)金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和酿脓葡萄球菌(streptococcuspyogenes),gram(-)大肠杆菌(escherichiacoli)和绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)，以及三种真菌(mic＝12.5-500μg/ml)白色念珠菌(candidaalbicans)、黑曲霉菌(aspergillusniger)和棒曲霉菌(aspergillusclavatus)具有良好的的抑制活性。构效关系：含供电子基团5e(甲氧基)和5k(甲基)化合物对细菌活性的提高有促进作用；含吸电子基团5a(邻氟)和5b(对氟)化合物对真菌活性的提高有促进作用。
2015年，mhaske等[mhaske,p.c.；shelke,s.h.；gadge,k.；shinde,a.,synthesisandantifungalscreeningof2-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5-yl)-5-((2-aryl/benzylthiazol-4-yl)methyl)-1,3,4-oxadiazolederivatives.j.heterocyclic.chem.,2016,53,129-134.]报道了一系列含噻唑环的1,3,4-噁二唑衍生物，并对四种真菌白色念珠菌(candidaalbicans)、热带念珠菌(candidatropicalis)、黑曲霉菌(aspergillusniger)、黄曲霉菌(aspergillusflavus)进行抑菌活性测试。抑菌活性测试表明，该系列化合物对四种真菌表现出了较好的抑制活性(mic＝1.56-50μg/ml)，其中化合物5e对黑曲霉菌(aspergillusniger)表现出了与对照药剂相当的抑制活性(mic＝1.56μg/ml)。
2013年kahriman等[kahriman,n.；yayli,b.；aktas,a.；iskefiyeli,z.；beris,f.s.；yayli,n.synthesis,antibacterialandantioxidantactivitiesofnew1-alkyl-4-(1-alkyl-4-oxo-1,4-dihydroquinolin-2-yl)pyridiniumbromides.eur.j.med.chem.,2013,69,348-355]报道了一系列含有不同取代烷基吡啶盐的1,4-二氢喹啉衍生物(3a-3k)，生物活性测试结果表明，化合物表现出一定的抗革兰氏阳性(或阴性)菌的活性，如抗gram-(+)：枯草杆菌(bacillussubtilis)，肠球菌(enterococcusfaecalis)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)；抗gram-(-)：克雷伯氏菌(klebsiellapneumonie)，假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)和变形杆菌(proteusvulgaris)。当目标化合物的烷烃链长度增加时，其抑菌活性反而降低，其中化合物3b对gram-(+)金黄色葡萄球菌和gram-(-)假单胞菌的最小抑制浓度(minimalinhibitionconcentration,mic)都为7.8μg/ml。
2015年，marek等[marek,j.；malinak,d.；dolezal,r.；soukup,o.；pasdiorova,m.；dolezal,m.；kuca,k.,synthesisanddisinfectioneffectofthepyridine-4-aldoximebasedsalts.molecules.2015,20,3681-3696.]合成了一系列不同碳链长度的4-醛肟基吡啶盐类衍生物，初步的生物活性测试表明对8种细菌和8种真菌具有一定的抑制活性。其中，发现c14和c16对酵母型真菌具有较好的抑制活性，而c16对丝状真菌完全没有活性。另外，c14和c16分别对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有相当高的抑制活性。
2013年，garcia等[garcia,m.t.；ribosa,i.；perez,l.；manresa,a.；comelles,f.,aggregationbehaviorandantimicrobialactivityofester-functionalizedimidazolium-andpyridinium-basedionicliquidsinaqueoussolution.langmuir.2013,29,2536-2545.]报道了一系列含有不同取代烷基吡啶盐的离子液体衍生物，分别对3种革兰氏阴性菌、3种革兰氏阳性菌和1种真菌进行了抑菌活性测试。通过生物活性测试表明，当碳链长度大于8个碳链长度时，化合物表现出了抗微生物活性。c10-c12随着碳链长度增长，抑菌活性逐渐提高。当碳链长度为12时，化合物展现出了最佳的抗微生物活性，优于其他化合物。
技术实现要素：
本发明的目的是：提供一种含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物及其制备方法及应用，它对致病病原细菌和真菌具有良好的抑制效果，且其合成方法非常经济简便。
本发明是这样实现的：一种含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物，该化合物具有如通式(ⅰ)所示的结构：
式中，r1为甲基、乙基、丙基、异丙基或不同取代苯基，其中，不同取代的苯基上的取代基为一个以上，取代基为氢、c1-4烷基、三氟甲基、羟基、c1-3烷氧基、三氟甲氧基、丙烯基、丙烯酰胺基、氨基、c1-3烷氨基、硝基或卤素原子；吡啶盐阳离子上为不同取代基，r2为氢、c1-4烷基、三氟甲基、羟基、c1-3烷氧基、三氟甲氧基、丙烯基、丙烯酰胺基、氨基、c1-3烷氨基、硝基或卤素原子；r3为吡唑基上的取代基，为氢、卤素原子、c1-4烷基或三氟甲基；m及x为氧原子或硫原子；n为自然数，n不能为0。
含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物的制备方法，其合成路线如下；
式中，r1为甲基、乙基、丙基、异丙基或不同取代苯基，其中，不同取代的苯基上的取代基为一个以上，取代基为氢、c1-4烷基、三氟甲基、羟基、c1-3烷氧基、三氟甲氧基、丙烯基、丙烯酰胺基、氨基、c1-3烷氨基、硝基或卤素原子；吡啶盐阳离子上为不同取代基，r2为氢、c1-4烷基、三氟甲基、羟基、c1-3烷氧基、三氟甲氧基、丙烯基、丙烯酰胺基、氨基、c1-3烷氨基、硝基或卤素原子；r3为吡唑基上的取代基，为氢、卤素原子、c1-4烷基或三氟甲基；m及x为氧原子或硫原子；n为自然数，n不能为0。
含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物在制备抗病原细菌和真菌的药物的应用。
通过采用上述技术方案，本发明以吡唑联噁(噻)二唑氧醚、硫醚类化合物为基础，将能够提高目标化合物生物活性的吡啶盐基引入到此体系中，合成一系列含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑氧醚、硫醚类两亲性分子，且发现该化合物对致病病原细菌和真菌具有良好的抑制作用，针对病原细菌[如水稻白叶枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae,xoo)、烟草青枯病菌(ralstoniasolanacearum,r.solanacearum)、柑橘溃疡病菌(xanthomonasaxonopodispv.citri,xac)等]和病原真菌[如小麦赤霉病菌(g.zeae)、马铃薯晚疫病菌(p.infestans)、水稻纹枯病菌(t.cucumeris)、黄瓜灰霉病菌(b.cinerea)、辣椒枯萎病原菌(f.oxysporum)、苹果腐烂病原菌(c.mandshurica)等]均具有良好的抑制效果，为新农药的研发和创制提供重要的科学基础。
具体实施方式
本发明的实施例1：目标化合物10-(2-硫醚-5-(1苯基-2-三氟甲基)吡唑基)-1,3,4-噁二唑-癸基-1-溴化吡啶盐的制备
将0.5g2-(10-溴癸基)硫醚基-5-(1苯基-2-三氟甲基)吡唑基-1,3,4-噁二唑溶于5ml吡啶，50℃反应6h，脱溶，柱层析法纯化得黄色液体0.53g，收率92.0％。
硫醚和氧醚类目标化合物的合成参照实施例1。
合成的部分含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物的结构及核磁共振氢谱、碳谱和氟谱及质谱数据如表1所示，物化性质如表2所示。
表1部分化合物的核磁共振氢谱和碳谱数据
表2部分目标化合物的理化性质
药理实施例1：ec50(medianeffectiveconcentration)是评价植物病原菌对化合物敏感性的重要指标，同时也是对目标化合物作用机制研究时，化合物浓度设置的重要参数。在浓度梯度实验中，采用二倍稀释法设定合适的5个浓度，最后将药剂对植物病原菌的抑制率、药剂浓度换算成对数值，通过spss软件回归分析得到毒力曲线，计算出ec50。
采用浊度法测试目标化合物对植物病原菌的有效中浓度ec50，试验对象为水稻白叶枯病菌(xoo)、烟草青枯病菌(r.solanacearum)和柑橘溃疡病菌(xac)。dmso溶解在培养基中作为空白对照。将水稻白叶枯病菌(水稻白叶枯病原菌在m210固体培养基)放到nb培养基中，在28℃、180rpm恒温摇床中振荡培养到对数生长期备用；烟草青枯病原菌在na固体培养基上进行划线培养，放置在30℃恒温培养箱中，直到长出单菌落，挑取单菌落，将烟草青枯病菌放到nb液体培养基，在30℃、180rpm恒温摇床中振荡培养到对数生长期备用；将柑橘溃疡病菌(在m210固体培养基上)放到nb培养基中，在28℃、180rpm恒温摇床中振荡培养到对数生长期备用。将药剂(化合物)配置成不同浓度(例：80,40,20,10,5μg/ml)的含毒nb液体培养基5ml加入到试管中，分别加入40μl含有植病细菌的nb液体培养基，在28-30℃、180rpm恒温摇床中振荡，其水稻白叶枯病原菌培养36h，烟草青枯病菌培养48h，柑橘溃疡病菌培养48h。将各个浓度的菌液在分光光度计上测定od595值，并且另外测定对应浓度的含毒无菌nb液体培养基的od595值。
校正od值＝含菌培养基od值－无菌培养基od值
抑制率％＝[(校正后对照培养基菌液od值－校正含毒培养基od值)/
校正后对照培养基菌液od值]×100
本发明实施例辅以说明本发明的技术方案，但实施例的内容并不局限于此，部分目标化合物实验结果如表3所示。
表3含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物对植物病原细菌的抑制活性
“nt”表示未测试
从表3中可以看出，在离体试验中，目标化合物对植物致病病原菌(如水稻白叶枯病菌、烟草青枯菌和柑橘溃疡病菌)表现出了良好的抑制活性。化合物3-11、13和14对水稻白叶枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae,xoo)表现出了极好的抑制活性，其ec50为0.5-29.9μg/ml；化合物3-14对烟草青枯病菌(ralstoniasolanacearum,r.solanacearum)表现出了良好的抑制活性，其ec50为1.0-46.3μg/ml；化合物1-14对柑橘溃疡病菌(xanthomonasaxonopodispv.citri,xac)表现出了极好的抑制活性，其ec50为0.6-54.9μg/ml；可用于制备抗植物致病病原细菌农药。
药理实施例2：含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物的抗致病病原真菌应用，用于抗黄瓜灰霉病菌(b.cinerea)、辣椒枯萎病原菌(f.oxysporum)、苹果腐烂病原菌(c.mandshurica)、小麦赤霉病菌(f.graminearum)、马铃薯晚疫病菌(p.infestans)和水稻纹枯病菌(t.cucumeris)试验方法。
在50μg/ml的浓度下，以恶霉灵为对照药剂，选用6种致病病原真菌为供试对象，采用生长速率法对部分化合物进行了生物活性测试，其结果见表4-5。
表4含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物对植物病原真菌的抑制活性
表5含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物对植物病原真菌的抑制活性
表6含吡啶盐的吡唑联噁(噻)二唑类化合物对植物病原真菌的抑制活性
从表4-6可以看出，测试结果表明，该系列化合物有一定的抗真菌活性，其中化合物4、5、6、9、14在浓度为50μg/ml下，对水稻纹枯病菌的抑制率分别为83.7％、84.3％、86.1％、83.0％和80.5％，其ec50分别为21.9，16.6，24.0，15.0和10.2μg/ml；化合物1-14对黄瓜灰霉病菌的抑制率在79.5-99.0％之间，化合物1-11，13和14对黄瓜灰霉病菌的ec50在2.7-34.8μg/ml之间。可见本发明的化合物完全可用于制备抗植物致病病原真菌农药。