本发明属于药物
技术领域：
，具体涉及一种精氨酸酶抑制剂及其制备方法与用途。
背景技术：
目前通过调节免疫系统来治疗癌症的方法主要包括肿瘤疫苗、重组细胞因子、单克隆抗体、自体t细胞疗法以及小分子免疫调节剂。由于一些肿瘤免疫通路和机制只能通过小分子药物来调节，小分子药物在肿瘤微环境中调节免疫相关靶点可以扩大肿瘤免疫疗法的应用范围，也可以为肿瘤靶向药物和生物免疫调节剂相结合的疗法寻找机会。小分子药物可以调节如骨髓衍生抑制细胞(mdscs)、树突状细胞(dcs)、肿瘤相关巨噬细胞(tams)发挥免疫抑制作用的细胞，而这些细胞通常不能被免疫检查点抑制剂所调节。对mdscs、dcs以及tams的调节可以通过吲哚胺2,3-双加氧酶1(ido1)、精氨酸酶1(arg1)、诱导型一氧化氮合酶(inos)、磷酸二酯酶-5(pde5)介导，而对嘌呤能信号转导的调节可以通过atp、cd39、cd73、腺苷以及升高的camp介导。因此，这些靶点都有可能成为小分子药物作用的位点。精氨酸酶抑制剂的作用机制是通过调节肿瘤微环境进一步来提高免疫系统的细胞毒性t细胞和自然杀伤(nk)的增殖，发挥它的免疫抑制效应进而杀死肿瘤细胞。no具有多种正性心血管生理效应，如舒张血管、调节局部血流、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板黏附聚集、防止血栓形成等。增加no生物利用度有望改善内皮功能障碍，进而延缓糖尿病微血管并发症的发生发展。no是以l-精氨酸为底物由nos催化生成的，精氨酸酶可以与nos竞争共同底物鸟氨酸及尿素。因此，精氨酸酶抑制剂可以减弱精氨酸酶与nos竞争，促使no生成增加。有研究显示精氨酸酶抑制剂能够抑制免疫同系小鼠的肿瘤生长，伴随着肿瘤生长的抑制，精氨酸的局部浓度的迅速增加，导致肿瘤内的cd3+t细胞的数目增加，这类似于当吲哚胺2,3双加氧酶(ido)抑制剂通过ido阻断色氨酸的降解会导致在肿瘤相关t细胞的肿瘤与活化色氨酸水平的恢复。除在调控精氨酸局部浓度的作用外，精氨酸酶抑制剂也可以与其它靶向t细胞活化的免疫肿瘤治疗药物联合作用，例如ctla-4和pd-1抗体。这类小分子arg抑制剂在肾细胞癌，乳腺癌，非小细胞肺癌，急性粒细胞白血病以及arg介导骨髓来源抑制性细胞相关的肿瘤治疗中具有广泛的应用前景。它与生物单抗的联合用药将是最可行也是最有效的方案。另外，2016年7月在journalofclinicalendocrinology&metabolism上的一篇研究(jclinendocrinolmetab(2016)101(11):3952-3958.)显示了精氨酸酶抑制剂有效改善t2dm微血管并发症内皮功能的疗效，精氨酸酶抑制剂可显著改善患者内皮舒张功能，促使局部微血管血流增加，有效延缓t2dm微血管并发症的发生发展。同时，精氨酸酶抑制剂在糖尿病肾病方面的研究亦引发关注。2015年发表于americanjournalofphysiology(americanjournalofphysiologyrenalphysiology,2015,309(5):f447)的一篇动物研究显示精氨酸酶制剂可有效延缓糖尿病肾病的进展。精氨酸酶抑制剂可增加糖尿小鼠肾脏髓质血流，减少尿蛋白量。且肾脏病理活检显示精氨酸酶抑制剂可明显改善糖尿病肾病的进展。究其缘由，发现精氨酸酶抑制剂可明显改善肾脏nos活性，促使no生成增加。已知精氨酸酶抑制剂在增强细胞抑制肿瘤细胞生长的作用，本发明提供作为口服小分子精氨酸酶活来提高肿瘤组织中精氨酸浓度，加速免疫t细胞的增殖并增强其免疫功能，提高肿瘤免疫反应的应答率。技术实现要素：本发明的目的是提供一种新型的精氨酸酶抑制剂，本发明所述的精氨酸酶抑制剂选自结构为式(i)或其医药上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、同位素或前药：其中r1或r2独立地选自氢、卤素、支链或者支链的烷基、酰基、烯基、炔基、氰基、芳香基、杂芳基或or基；所述or基中的r为烷基、环烷基、杂环烷基或杂芳基，所述r取代基中的烷基、环烷基、芳基和杂芳基能够进一步被一个或多个卤素、烷氧基，环烷基，杂环烷基取代。优选的，所述化合物选自下表：根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，包括：(1)治疗有效量的至少一种所述化合物或其医药上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、同位素或前药；(2)医药上可接受的药用辅料。根据本发明的另一个方面，本发明提供了至少一种所述的化合物或其医药上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、同位素或前药的用途，其用于制备抑制细胞中的精氨酸酶i、精氨酸酶ii或其组合的医药；根据本发明的另一个方面，本发明提供了至少一种所述的化合物或其医药上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、同位素或前药的用途，其用于制备用于治疗或者预防个体中于精氨酸酶i、精氨酸酶ii或其组合的表达或活性有关的疾病或症状的医药；其中所述疾病或者症状是：选自以下疾病的心血管病症：全身性高血压、肺动脉高血压pah、高原肺动脉高血压、缺血再灌注ir损伤、心肌梗塞和动脉粥样硬化；选自囊肿性纤维化和哮喘的费病症；脑膜炎；选自以下疾病的免疫病症：骨髓来源阻抑细胞mdsc介导的t细胞功能性障碍、人类免疫缺陷病毒hiv和自身免疫脑脊髓炎；选自镰状细胞疾病和地中海贫血的溶血性病症；选自以下疾病的肠胃道病症：胃癌、发炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和胃溃疡；勃起功能障碍；干癣、利什曼病、伤口愈合、人类免疫缺陷病毒hiv、b型肝炎病毒hbv或幽门螺杆菌感染。根据本发明的又一个方面，可根据化合物的不同结构参考如下方案制备所述化合物：其中r1或r2独立地选自氢、卤素、支链或者支链的烷基、酰基、烯基、炔基、氰基、芳香基、杂芳基或or基；所述or基中的r为烷基、环烷基、杂环烷基或杂芳基，所述r取代基中的烷基、环烷基、芳基和杂芳基能够进一步被一个或多个卤素、烷氧基，环烷基，杂环烷基取代。在本说明书中，术语“烷基”包括直链和支链的烷基；“卤素”包括氟氯溴碘。本发明化合物可以以各种异构体形式存在包含构象、几何和构形异构体且包含(例如)顺式构形或反式构形。本发明化合物还可以一或多种互变异构体形式存在，包含单一互变异构体和互变异构体混合物。术语“异构体”涵盖本发明化合物的所有异构体形式，包含化合物的互变异构体形式。本申请所阐述的一些化合物可具有不对称中心且由此以不同对映异构体和非对映异构体形式存在。本发明化合物可呈光学异构体或非对映异构体的形式。因此，本发明涵盖呈光学异构体、非对映异构体和其混合物(包含外消旋混合物)的形式的如本文所阐述的本发明化合物和其用途。本发明化合物的光学异构体可通过已知技术来获得，例如不对称合成、手性色谱、模拟移动床技术或通过借助采用光学活性拆分剂来化学分离立体异构体。除非另外指示，否则“立体异构体”意指实质上不含化合物的其它立体异构体的所述化合物的一种立体异构体。因此，具有一个手性中心的立体异构纯化合物将实质上不含化合物的相对对映异构体。具有两个手性中心的立体异构纯化合物将实质上不含所述化合物的其它非对映异构体。典型立体异构纯化合物包括大于约80重量％的化合物的一种立体异构体和小于约20重量％的所述化合物的其它立体异构体，例如大于约90重量％的化合物的一种立体异构体和小于约10重量％的所述化合物的其它立体异构体，或大于约95重量％的化合物的一种立体异构体和小于约5重量％的所述化合物的其它立体异构体，或大于约97重量％的化合物的一种立体异构体和小于约3重量％的所述化合物的其它立体异构体。如果所绘示结构与给予所述结构的名称之间具有差异，则以绘示结构为准。另外，如果结构或结构的一部分的立体化学并非以(例如)粗线或虚线指示，则应将所述结构或所述结构的一部分诠释为涵盖其所有立体异构体。然而，在一些情形下，在存在一个以上手性中心的情形下，可以单一对映异构体代表结构和名称以帮助阐述相对立体化学。有机合成领域技术人员应知晓化合物是否从用于制备其的方法制成单一对映异构体。“医药上可接受的盐”是本发明化合物的医药上可接受的有机或无机酸性或碱性盐。代表性医药上可接受的盐包含(例如)碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、水溶性和水不溶性盐，例如乙酸盐、安索酸盐(4，4-二氨基均二苯乙烯-2，2-二磺酸盐)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、钙、依地酸钙(calciumedetate)、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐(clavulariate)、二盐酸盐、依地酸盐(edetate)、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰基对氨基苯基砷酸盐(glycollylarsanilate)、六氟磷酸盐、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、哈胺(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘酸盐、碘化物、异硫代羟酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘液酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、n-甲基葡萄糖胺铵盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(1，1-亚甲基-双-2-羟基-3-萘甲酸盐，恩贝酸盐(einbonate))、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、苏拉明酸盐(suramate)、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物和戊酸盐。医药上可接受的盐可在其结构中具有一个以上带电原子。在此情况下，医药上可接受的盐可具有多个抗衡离子。因此，医药上可接受的盐可具有一或多个带电原子和/或一或多个抗衡离子。术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指改善或根除疾病或与疾病有关的症状。在某些实施例中，所述术语是指由于向患有此一疾病的患者投与一或多种预防剂或治疗剂而使所述疾病的扩散或恶化最小化。术语“预防(prevent、preventing和prevention)”是指由于投与预防剂或治疗剂而预防患者疾病的发作、复发或扩散。术语“有效量”是指在治疗或预防疾病或延迟或最小化与疾病有关的症状中足以提供治疗或预防益处的本发明化合物或其它活性成份的量。另外，关于本发明化合物的治疗有效量意指在治疗或预防疾病中提供治疗益处的治疗剂(单独或与其它疗法组合)的量。结合本发明化合物使用，所述术语可涵盖改良整体疗法、减少或避免疾病的症状或病因或增强另一治疗剂的治疗效能或与另一治疗剂的协同作用的量。术语“药用辅料”系指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂；是除活性成分以外，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能。按作用和用途可分为溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。附图说明图1为精氨酸酶i活性测定方法中最适吸收波长的优化；图2为精氨酸酶i活性测定方法中酶、底物及mn2+最适浓度的优化；图3为稳定细胞系中精氨酸酶1含量检测结果；图4为接种细胞数摸索及精氨酸酶活性检测结果；图5为本发明化合物的反应方程式。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。一、化合物制备实例性化合物实例1顺-3-(二苄基氨基)环丁烷羧酸甲酯反应瓶中加入3-氧代环丁烷甲酸甲酯14g(0.11mol)，四氢呋喃360ml，乙酸9.9g(0.165mol)，搅拌下加入二苄胺22.88g(0.116mol)，冰水浴降温。于15min内分批加入三乙酰氧基硼氢化钠34.97g(0.165mol)，加完撤去冰水浴，于15～25℃反应过夜。减压浓缩掉大部分四氢呋喃，剩余物加饱和碳酸钠溶液，调ph至碱性，二氯甲烷萃取，有机相饱和食盐水洗涤干燥，快速柱层析得22.6g，收率66.9％1hnmr(300m，cdcl3)：δ2.14-2.24(m，4h)，2.61-2.71(m，1h)，3.06-3.14(m，1h)，3.50(s，4h)，3.65(s，3h)，7.22-7.31(m，10h)；ms实验值m/z：310.18(m+1)。顺-3-(二苄基氨基)-n-甲氧基-n-甲基环丁烷甲酰胺顺-3-(二苄基氨基)环丁烷羧酸甲酯17g(0.055mol)溶于四氢呋喃200ml，加入2mol/lnaoh溶液300ml，于15～25℃搅拌反应过夜。用3mol/lhcl溶液调ph至6～7，乙酸乙酯萃取，盐水洗涤干燥。快速柱层析得粘稠物15.6g。粘稠物15g(0.05mol)溶于二氯甲烷200ml，加入edci19.2g(0.1mol)，n,o-二甲基羟胺盐酸盐9.7g(0.1mol)，冰盐浴降温，滴加三乙胺10.1g(0.)，控制温度不高于5℃。滴完，自然升温反应过夜。反应液中加入半饱和食盐水，搅拌分液，水相二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤干燥，柱层析得15g，收率81％。1hnmr(300m，cdcl3)：δ2.16-2.23(m，4h)，3.0(br，1h)，3.15-3.17(m，4h)，3.49-3.52(m，4h)，3.60(s，3h)，7.18-7.33(m，10h)；hrms实验值m/z：339.2174(m+1)。顺-1-(3-(二苄基氨基)环丁基)己-5-烯-1-酮顺-3-(二苄基氨基)-n-甲氧基-n-甲基环丁烷甲酰胺8.12g(0.024mol)溶于四氢呋喃30ml，冰盐浴降温，滴加0.5mol/l3-丁烯溴化镁100ml(0.05mol)，控制温度不高于5℃。滴完，自然升温反应过夜。用1mol/lhcl溶液调ph至5～6，乙酸乙酯萃取，有机相饱和食盐水洗涤干燥，快速柱层析得5.4g，收率66％。1hnmr(300m，cdcl3)：δ2.09(br，2h)，2.14-2.21(m，2h)，2.27-2.33(m，2h)，2.42-2.46(m，2h)，2.73-2.80(m，1h)，3.12-3.16(m，1h)，3.50(s，4h)，4.95-5.03(m，2h)，5.73-5.84(m，1h)，7.23-7.32(m，10h)；ms实验值m/z：334.28(m+1)。顺-1-(-3-(二苄基氨基)环丁基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)戊-1-酮将顺-1-(3-(二苄基氨基)环丁基)己-5-烯-1-酮2g(0.0058mol)，1,5-环辛二烯氯化铱二聚体300mg(0.00045mol)，1,2-双(二苯基膦)乙烷300mg(0.00075mol)加入反应瓶，抽换气三次，加入无水二氯甲烷50ml，冰水浴降温。滴加频哪醇硼烷2.5g(0.019mol)，控制温度不高于10℃，滴完自然升温过夜。反应液加入二氯甲烷稀释，饱和食盐水洗涤干燥，柱层析得2.5g，收率94％。1hnmr(300m，cdcl3)：δ0.74-0.78(t，2h)，1.23-1.27(m，12h)，1.35-1.41(m，2h)，1.50-1.56(m，2h)，2.04-2.16(m，4h)，2.30-2.34(t，2h)，2.73-2.81(m，1h)，3.08-3.16(m，1h)，3.49(s，4h)，7.22-7.30(m，10h)；ms实验值m/z：462.33(m+1)。顺-2-乙酰氨基-n-叔丁基-2-(3-(二苄基氨基)环丁基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)己酰胺反应瓶中加入顺-1-(-3-(二苄基氨基)环丁基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)戊-1-酮2.5g(0.0054mol)，乙酸铵5g(0.065mol)，三氟乙醇10ml，异氰酸叔丁酯1.5g(0.018mol)，于15～25℃反应过夜。反应液中加水，乙酸乙酯萃取，有机相饱和食盐水洗涤干燥，快速柱层析得2.5g，收率76.4％。1hnmr(300m，cdcl3)：δ0.74-0.78(t，2h)，1.25-1.29(m，21h)，1.37-1.46(m，4h)，1.67-1.75(m，2h)，2.00(s，3h)，2.03-2.24(m，4h)，2.63-2.70(m，1h)，2.88-2.91(m，1h)，3.42-3.54(q，4h)，7.24-7.34(m，10h)；ms实验值m/z：604.51(m+1)。顺-2-乙酰氨基-2-(3-氨基环丁基)-n-叔丁基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)己酰胺醋酸盐顺-2-乙酰氨基-n-叔丁基-2-(3-(二苄基氨基)环丁基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)己酰胺1g(1.66mmol)溶于甲醇20ml，加入乙酸0.1g，5wt％钯碳0.3g，3kg压力加氢16小时。过滤除去钯碳，减压浓缩得醋酸盐0.8g。ms实验值m/z：484.36(m+1)。4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯甲醛反应瓶中依次加入对羟基苯甲醛2.01g(0.016mol)，四氢呋喃50ml，3-羟基四氢呋喃2.64g(0.015mol)，三苯基膦5.9g(0.023mol)，冰水浴降温至5～10℃。滴加偶氮二甲酸二乙酯3.92g(0.023mol)，控制温度不高于15℃，滴完自然升温反应过夜。反应液中加入食盐水，搅拌分液，水相乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤干燥，柱层析得1.4g，收率49％。1hnmr(300m，cdcl3)：δ2.18-2.28(m，2h)，3.92-4.05(m，4h)，5.02(m，1h)，6.96-7.85(m，4h)，9.89(s，1h)。顺-2-(3-(4-(四氢呋喃-3-基氧基)苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸顺-2-乙酰氨基-2-(3-氨基环丁基)-n-叔丁基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)己酰胺醋酸盐0.211g(0.43mmol)，4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯甲醛0.083g(0.43mmol)溶于二氯甲烷5ml，加入三乙酰氧基硼氢化钠0.14g(0.66mmol)，反应过夜。加入二氯甲烷稀释，碳酸钠饱和溶液搅拌，分液，有机相饱和盐水洗涤，干燥，柱层析得0.06g中间体；加6mol/l盐酸，回流搅拌16h。反应液减压浓缩干，pre-hplc纯化，冻干得19mg。1hnmr(300m，d2o)：δ0.81-0.84(t，2h)，1.19-1.28(m，1h)，1.35-1.49(m，3h)，1.66-1.74(m，1h)，1.89-2.05(m，2h)，2.16-2.23(m，1h)，2.32-2.62(m，5h)，3.68-3.72(m，1h)，3.95-4.07(m，4h)，4.14(s，2h)，5.19(m，1h)，7.06-7.45(q，4h)。ms实验值m/z：403.22(m+1-18)。实例2(r)-4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯甲醛使用4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯甲醛的制备方法，原料呋喃使用(s)-3-羟基四氢呋喃，制得(r)-4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯甲醛0.6g。1hnmr(300m，cdcl3)：δ2.11-2.33(m，2h)，3.88-4.06(m，4h)，4.99-5.04(m，1h)，6.95-7.84(m，4h)，9.88(s，1h)；顺-(r)-2-(3-(4-(四氢呋喃-3-基氧基)苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸顺-2-乙酰氨基-2-(3-氨基环丁基)-n-叔丁基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)己酰胺醋酸盐0.382g(0.79mmol)，r-4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯甲醛0.152g(0.79mmol)溶于二氯甲烷8ml，加入三乙酰氧基硼氢化钠0.28g(1.32mmol)，反应过夜。加入二氯甲烷稀释，碳酸钠饱和溶液搅拌，分液，有机相饱和盐水洗涤，干燥，柱层析得0.18g中间体；加6mol/l盐酸，回流搅拌16h。反应液减压浓缩干，pre-hplc纯化，冻干得39mg；1hnmr(300m，d2o)：δ0.73-0.77(t，2h)，1.14-1.18(m，1h)，1.33-1.41(m，3h)，1.65-1.72(m，1h)，1.87-2.01(m，2h)，2.09-2.16(m，1h)，2.25-2.60(m，5h)，3.62-3.65(m，1h)，3.86-4.00(m，4h)，4.08(s，2h)，5.12(m，1h)，7.00-7.38(q，4h)；hrms实验值m/z：403.2402(m+1-18)。实例3(s)-4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯甲醛使用4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯甲醛制备方法，原料呋喃使用(r)-3-羟基四氢呋喃，制得(s)-4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯甲醛1.1g。1hnmr(300m，cdcl3)：δ2.11-2.33(m，2h)，3.88-4.05(m，4h)，4.99-5.04(m，1h)，6.95-7.85(m，4h)，9.88(s，1h)。顺-(s)-2-(3-(4-(四氢呋喃-3-基氧基)苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸顺-2-乙酰氨基-2-(3-氨基环丁基)-n-叔丁基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)己酰胺醋酸盐0.693g(1.43mmol)，s-4-(四氢呋喃-3-基氧基)苯甲醛0.274g(1.43mmol)溶于二氯甲烷10ml，加入三乙酰氧基硼氢化钠0.59(2.8mmol)，反应过夜。加入二氯甲烷稀释，碳酸钠饱和溶液搅拌，分液，有机相饱和盐水洗涤，干燥，柱层析得0.39g中间体；加6mol/l盐酸，回流搅拌16h。反应液减压浓缩干，pre-hplc纯化，冻干得69mg。1hnmr(300m，d2o)：δ0.74-0.78(t，2h)，1.15-1.19(m，1h)，1.30-1.41(m，3h)，1.59-1.68(m，1h)，1.82-1.99(m，2h)，2.10-2.18(m，1h)，2.27-2.55(m，5h)，3.64-3.66(m，1h)，3.89-4.02(m，4h)，4.08(s，2h)，5.13(m，1h)，7.01-7.39(q，4h)；ms实验值m/z：403.19(m+1-18)。实例4顺-2-(3-(4-乙酰基苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸顺-2-乙酰氨基-2-(3-氨基环丁基)-n-叔丁基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)己酰胺醋酸盐0.379g(0.79mmol)，4-乙酰基苯甲醛0.117g(0.79mmol)溶于二氯甲烷10ml，加入三乙酰氧基硼氢化钠0.29g(1.33mmol)，反应过夜。加入二氯甲烷稀释，碳酸钠饱和溶液搅拌，分液，有机相饱和盐水洗涤，干燥，柱层析得0.19g中间体；加6mol/l盐酸，回流搅拌16h。反应液减压浓缩干，pre-hplc纯化，冻干得29mg；1hnmr(300m，d2o)：δ0.75-0.79(t，2h)，1.14-1.18(m，1h)，1.30-1.42(m，3h)，1.58-1.66(m，1h)，1.82-1.89(m，1h)，1.94-2.01(m，1h)，2.38-2.55(m，4h)，2.66(s，3h)，3.68-3.72(m，1h)，4.23(s，2h)，7.57-8.05(q，4h)；ms实验值m/z：359.23(m+1-18)。实例54-(2-甲氧基乙氧基)苯甲醛对羟基苯甲醛1.83g(0.015mol)，碳酸钾4g(0.029mol)，2-溴乙基甲基醚1.39g(0.01mol)，丙酮30ml加入反应瓶，常温搅拌24h。过滤，浓缩柱层析得0.8g，收率44.5％。1hnmr(300m，cdcl3)：δ3.45(s，3h)，3.76-3.79(m，2h)，4.19-4.21(m，2h)，7.01-7.83(q，4h)，9.88(s，1h)。顺-2-(3-(4-(2-甲氧基乙氧基)苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸使用顺-2-(3-(4-(四氢呋喃-3-基氧基)苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸的制备方法，原料醛使用4-(2-甲氧基乙氧基)苯甲醛，制得目标产物43mg。1hnmr(300m，d2o)：δ0.75-0.79(t，2h)，1.16-1.19(m，1h)，1.30-1.42(m，3h)，1.58-1.68(m，1h)，1.81-1.98(m，2h)，2.27-2.56(m，5h)，3.45(s，3h)，3.64-3.66(m，1h)，3.77-3.80(m，2h)，3.89-4.02(m，4h)，4.08(s，2h)，4.18-4.20(m，2h)，7.01-7.39(q，4h)；ms实验值m/z：391.29(m+1-18)。实例64-环丙基甲氧基苯甲醛对羟基苯甲醛1.83g(0.015mol)，碳酸钾4g(0.029mol)，溴甲基环丙烷1.35g(0.01mol)，丙酮30ml加入反应瓶，常温搅拌24h。过滤，浓缩柱层析得1.2g，收率67％。1hnmr(300m，cdcl3)：δ0.36-0.38(m，2h)，0.66-0.68(m，2h)，1.23-1.32(m，1h)，3.87-3.89(d，2h)，6.97-7.81(q，4h)，9.87(s，1h)。顺-2-(3-(4-环丙甲基苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸使用顺-2-(3-(4-(四氢呋喃-3-基氧基)苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸的制备方法，原料醛使用4-环丙基甲氧基苯甲醛，制得目标产物38mg；1hnmr(300m，d2o)：δ0.36-0.38(m，2h)，0.67-0.69(m，2h)，0.75-0.79(t，2h)，1.14-1.18(m，1h)，1.23-1.42(m，4h)，1.58-1.66(m，1h)，1.82-1.89(m，1h)，1.94-2.01(m，1h)，2.38-2.55(m，4h)，3.68-3.72(m，1h)，3.88-3.90(d，2h)，4.23(s，2h)，7.00-7.38(q，4h)ms实验值m/z：387.29(m+1-18)。实例7顺-2-(3-(4-乙炔基苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸使用顺-2-(3-(4-(四氢呋喃-3-基氧基)苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸的制备方法，原料醛使用4-乙炔基苯甲醛，制得目标产物16mg。1hnmr(300m，d2o)：δ0.74-0.78(t，2h)，1.15-1.19(m，1h)，1.30-1.41(m，3h)，1.59-1.68(m，1h)，1.82-1.99(m，2h)，2.27-2.55(m，5h)，3.22(s，1h)，3.64-3.66(m，1h)，4.08(s，2h)，5.13(m，1h)，7.01-7.39(q，4h)。ms实验值m/z：341.3(m+1-18)。实例84-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苯甲醛对羟基苯甲醛0.5g(4mmol)，碳酸铯0.5g(6mmol)，3-溴氧杂环丁烷0.5g(3.6mmol)，n,n-二甲基甲酰胺5ml加入反应瓶，80℃反应过夜。加水，萃取，洗涤，干燥浓缩柱层析得0.51g。1hnmr(300m，cdcl3)：δ4.76-4.79(q，2h)，4.99-5.02(t，2h)，5.26-5.32(m，1h)，6.79-7.84(q，4h)，9.89(s，1h)顺-2-(3-(4-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苄氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸使用顺-2-(3-(4-(四氢呋喃-3-基氧基)苄基氨基)环丁基)-2-氨基-6-硼酸己酸的制备方法，原料醛使用4-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苯甲醛，制得目标产物41mg；1hnmr(300m，d2o)：δ0.76-0.80(t，2h)，1.15-1.19(m，1h)，1.30-1.43(m，3h)，1.58-1.66(m，1h)，1.82-1.89(m，1h)，1.95-2.02(m，1h)，2.38-2.55(m，4h)，3.69-3.73(m，1h)，4.23(s，2h)，4.75-4.78(q，2h)，4.98-5.01(t，2h)，5.24-5.30(m，1h)，7.02-7.40(q，4h)；ms实验值m/z：389.25(m+1-18)。本发明制备的化合物或其医药上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、同位素或前药可用于制备于抑制细胞中的精氨酸酶i、精氨酸酶ii或其组合的医药；或其用于制备用于治疗或者预防个体中于精氨酸酶i、精氨酸酶ii或其组合的表达或活性有关的疾病或症状的医药。二、精氨酸酶i活性测定方法的建立及对部分抑制剂的筛选一、筛选方法的建立与验证。1.反应体系中参数的优化。在方法建立过程中，我们对以下参数进行了不同使用浓度的摸索，从而确定了最佳反应体系。参数及摸索梯度如下(表1)：表1反应体系中不同试剂的摸索浓度及条件参数使用梯度精氨酸酶i浓度(ng)0,2,10,50,100l-精氨酸浓度(500mm,μl)1,5硫酸锰浓度(500mm,μl)0.5,1吸收波长(nm)450,490根据最终的反应结果(图1，图2)，我们确定反应体系中所有试剂的最适浓度(表2)。表2反应体系中不同试剂的最适浓度及条件精氨酸酶i浓度50ng/100ull-精氨酸浓度5mm硫酸锰浓度2.5mm吸收波长450nm2.方法操作流程的确定。a.配制所需试剂。其中包含：500mml-精氨酸(a600205-0100,sangon)；250mm硫酸锰(a601717-0250,sangon)；不同浓度的抑制剂(1000×)；200μg/ml精氨酸酶i(ar1-h5228,acrobiosystems)；缓冲液a(组分见表3)；缓冲液b(组分见表3)。表3缓冲液a和缓冲液b的组成及产品相关信息b.试验流程。·活性反应在96孔板中进行，每组试验分为单独的5个重复，9种不同的抑制剂浓度梯度处理。每孔反应混合物添加比例按照表4中进行。表4每孔反应体系组成及用量(总100μl)·37℃下静置2小时。·每孔添加150μl停止缓冲液(缓冲液a:缓冲液b＝1:1)。·室温下，静置1小时。·酶标仪读取od450数值。·根据数据进行非线性拟合(expdec1)并计算ic50。3.筛选方法的可靠性验证。为了验证建立的筛选方法是否可行，我们前后共进行了8次的abh(abh盐酸盐,一种商品化的精氨酸酶i抑制剂,sigma,sml1466)的抑制试验，最终得到abh的ic50为2.4±1.2μm，通过和文献报道相比较(1.6±0.8μm，生物化学,2004,43,8987-8999)，我们认为利用建立的方法对抑制剂进行初步的筛选的可信的。二、筛选方法的建立与验证。利用建立的反应体系，对抑制剂进行了初步的筛选，筛选结果5见所示。表5抑制剂对精氨酸酶i效力注效力1:0.1nm～250nm,2:251nm～1000nm,3:1001nm～2000nm,4:2001nm～5000nm,5:>5001nm。三、细胞功能检测为了进一步确认抑制剂对精氨酸酶i的抑制效果，我们构建了cho细胞稳定过表达人精氨酸酶i的细胞系，并对构建好的细胞系进行精氨酸酶i表达量和表达活性的检测。同时初步检测了abh抑制剂对细胞的抑制效果。3.1cho细胞稳定过表达人精氨酸酶i的细胞系构建以cho细胞的cdna为模板扩增出hargi片段，并构建到慢病毒载体plvx-ires-puro(cat#632183，clontech)中去。使用转染试剂将plvx-hargi与慢病毒体系的质粒共转入293t细胞中，48h后收集毒液。将毒液加入到cho细胞中，8-12小时后换成新鲜培养基。侵染2-3天后使用浓度为10μg/ml的嘌呤霉素进行抗药性筛选并获得稳定过表达细胞系。3.2稳定过表达细胞系中精氨酸酶i表达量和表达活性的检测收集过表达细胞，提取rna，反转录后进行实时荧光定量pcr检测，定量检测结果见图3。对构建的细胞系进行精氨酸酶活性检测并摸索合适的接种数，检测结果见图4。根据实验结果和观察，接种1.5×104个/孔细胞比较合适，且过表达细胞系有精氨酸酶活性。实验步骤依据之前体外实验摸索并参考文献(journalofmedicinalchemistry,2013,56,2568-2580)而来，具体操作如下：第一天：接种细胞(96孔板)。分别计数并依次接种0，0.5，1.0，1.5，2，2.5，3，4(×104)个细胞；第二天：24小时后，去上清，向每孔中加入100ul、终浓度为5mm的l-精氨酸；第三天：48小时后，取上清至新孔中，向每孔中加入150μl停止缓冲液(缓冲液a:缓冲液b＝1:1)，室温孵育2小时后，酶标仪读取od450数值。当前第1页12