本发明属于干细胞领域，涉及干细胞的定向诱导分化，具体涉及诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的人工多肽及其生物制品。
背景技术：
：肝细胞移植是治疗终末期肝功能衰竭的最有效的方法之一，却受到细胞来源缺乏、体外难以大量增殖、传代后不能保持其原有特性、免疫排斥等因素的限制而影响其临床应用。随着组织工程的研究进展，干细胞治疗终末期肝病已经成为最具前景的发展方向。骨髓间充质干细胞是由feriedenstein等于20世纪70年代初首先报道发现的一类非造血干细胞。因该类细胞呈纺锤形，集落方式类似成纤维细胞，故在研究之初被称为成纤维细近年来，诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化备受关注。胞集落形成单位或骨髓基质成纤维细胞。后来，caplan于1991年把这类来源于骨髓，具有高度的自我更新和分化潜能，并且最终可分化为间充质细胞的细胞群，统一命名为骨髓间充质干细胞。在不同条件下，该类细胞不仅可被诱导成为骨细胞、肌腱细胞、骨髓基质细胞、脂肪细胞等间充质细胞，还有可能分化成为心肌细胞、神经细胞等实质性细胞。研究发现bmscs体外培养或是体内移植均具有分化为神经细胞的潜能。lee等成功在体外培养的骨髓间充质干细胞中发现分化的不同亚型神经元和胶质细胞。satake等在sci大鼠的腰椎处注射入带有绿色荧光标记的bmscs，培养数日后，发现大鼠的运动和神经功能得到一定程度的改善，镜下观察到部分移植细胞转化为神经样细胞。zurita等的实验研究发现bmscs注射到sci大鼠12个月后，有大量的神经组织再生，包括神经元、星形胶质细胞等。如何诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化也已成为研究热点。技术实现要素：本发明的目的在于提供诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的人工多肽及其生物制品。实现本发明上述目的技术方案如下：一种包含式(ⅳ)氨基酸序列的多肽：lgenqpdak(xa)pcfqedpma(xb)gtdctlmeiwn；(ⅳ)其中，xa和xb选自m,y,l,v,w或e。优选地，xa和xb选自m或w。优选地，所述多肽的氨基酸序列如下：lgenqpdakmpcfqedpmamgtdctlmeiwn(seqidno.1)；lgenqpdakwpcfqedpmawgtdctlmeiwn(seqidno.2)；lgenqpdakmpcfqedpmawgtdctlmeiwn(seqidno.3)；lgenqpdakwpcfqedpmamgtdctlmeiwn(seqidno.4)。优选地，多肽n和/或c末端被化学修饰。优选地，所述多肽的n末端被乙酰化修饰，c末端被酰胺化修饰。优选地，所述多肽为游离形式或药学上可以接受的成盐形式，包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和酒石酸盐。上述多肽在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化方面的应用。一种生物制品，含有上述的多肽和药学上可以接受的辅料。上述生物制品在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化方面的应用。本发明的突出优点：本领域人员知道，联合应用酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和抑瘤素m具有很强的诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的能力，从本实验也可以看出，酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和抑瘤素m联用组成的阳性对照组中，诱导培养14天后，细胞中甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna均呈明显的阳性表达，而甲胎蛋白和白蛋白为肝细胞的特异性标志物，证明骨髓间充质干细胞在酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和抑瘤素m联合作用下定向分化为肝细胞。本发明提供的多肽ⅳ-1～ⅳ-4具有相同的作用，证明本发明提供的多肽ⅳ-1～ⅳ-4具有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用，可以制成诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的生物制品。附图说明图1为诱导14天各组细胞甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna相对内参表达量。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。一、实验材料本发明涉及的多肽通过本领域公知的标准多肽固相合成技术合成，采用芴甲氧羰基(fmoc)n端保护策略。按照树脂固相合成的方法依次连接相应氨基酸，期间依次脱去fmoc-保护基团，然后切肽，获得粗品，粗品经c18柱分离纯化，即可制得式(ⅳ)所示的多肽。hplc和ms检测确证了本发明多肽的结构，且纯度均≥98％。多肽ⅳ-1至多肽ⅳ-4的氨基酸序列如下(n末端→c末端)，末端未经化学修饰：lgenqpdakmpcfqedpmamgtdctlmeiwn(多肽ⅳ-1，seqidno.1)；lgenqpdakwpcfqedpmawgtdctlmeiwn(多肽ⅳ-2，seqidno.2)；lgenqpdakmpcfqedpmawgtdctlmeiwn(多肽ⅳ-3，seqidno.3)；lgenqpdakwpcfqedpmamgtdctlmeiwn(多肽ⅳ-4，seqidno.4)。动物和试剂：3～4周龄清洁级雄性wistar大鼠，80～100g，购于南京大学模式动物中心；低糖dmem培养基(l-dmem)购于gibco；胎牛血清购于杭州四季青；红细胞裂解液、dapi荧光染料购于碧云天；兔抗大鼠cd44、cd45、cd90、dab试剂盒购于南京建成生物。rna抽提试剂盒，购自上海华舜生物工程有限公司；cdna合成试剂盒，revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit，fermentas公司产品；实时荧光定量pcr试剂盒sybrpremixextaq，为takara公司产品；引物由上海生工合成。二、实验方法1、骨髓间充质干细胞的分离培养及纯化颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下取四肢骨，用磷酸盐缓冲液反复冲洗骨髓腔，加入红细胞裂解液获得单个核细胞，加入含10％胎牛血清的l-dmem，调节细胞密度为2×109/l，接种于37℃、体积分数为5％的co2饱和湿度培养箱中进行培养，3d后首次换液，以后每两三天换液1次，待细胞生长至瓶底80％～90％融合时，用2.5g/l胰蛋白酶消化，按1:2～1:3传代后继续培养。培养过程中在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况。用免疫荧光染色的方法进行鉴定。2、骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化取第4代骨髓间充质干细胞，用2.5g/l胰蛋白酶消化，以5×107/l接种于人纤维连接蛋白包被6孔板中(200ng/cm2)。分6组：第1组加入多肽ⅳ-1；第2组加入多肽ⅳ-2；第3组加入多肽ⅳ-3；第4组加入多肽ⅳ-4；第5组作为阴性对照，不加多肽ⅳ-1～多肽ⅳ-4；第6组为阳性对照，加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素m，三者终末浓度均为20μg/l。多肽组所加入的各多肽终末浓度均为10μm。3、肝细胞特异性标志物检测(基因水平)诱导第14天取各组细胞，检测白蛋白、甲胎蛋白的基因表达水平。采用实时荧光定量pcr检测。rna抽提试剂盒提取细胞总rna，根据说明书方法逆转录合成cdna。采用25μl反应系统进行实时定量pcr反应，程序设定为：95℃，预变性60s，95℃15s，60℃60s，×40循环。目的基因与内参照基因在相同反应条件下，同时扩增。将pcr所得的ctsybr值输入excel，采用相对定量2-δδct法分析结果。引物如下：白蛋白上游引物：5’-aagaaacctgggaagagtgggc-3’；白蛋白下游引物：5’-tcgctcactggggtcttctca-3’；甲胎蛋白上游引物：5’-gggtgtttagaaaaccagctatctg-3’；甲胎蛋白下游引物：5’-gagtctggagcggtcttcttgc-3’；β-actin上游引物：5’-acgcaccccaactacaactc-3’；β-actin下游引物：5’-tctccttaatgtcacgcacga-3’。4、数据处理数据分析采用spss20.0软件进行，数据表示方法为均值±标准差，组间比较采用t检验，p<0.05认为有统计学差异。三、实验结果1、形态学变化诱导前骨髓间充质干细胞呈梭形或纺锤形，随着诱导时间延长，阳性对照组和多肽ⅳ-1～ⅳ-4组均出现异形细胞，且数量有增多趋势，诱导后细胞生长速度较诱导前变慢，细胞有聚集趋势，1:2传代后约1～2周铺满瓶底。阴性对照组始终未出现细胞形态及增殖速度的改变。2、细胞生长曲线的测定阳性对照组和多肽ⅳ-1～ⅳ-4诱导组骨髓间充质干细胞传代培养潜伏期约为24～48h，第3天进入对数增殖期，第5～6天进入平台期。与阴性对照组比较，阳性对照组和多肽诱导组细胞生长增殖速度增快(p<0.05)。3、肝细胞特异性标志物检测诱导0、14d，阴性对照组细胞中甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna均呈阴性表达；阳性对照组和多肽ⅳ-1～ⅳ-4诱导组诱导培养14天后，细胞中甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna呈显著阳性表达。表1和图1为诱导14天后各组细胞中甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna相对内参表达量。表1诱导14天各组细胞甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna相对内参表达量甲胎蛋白mrna/β-actinmrna白蛋白mrna/β-actinmrna多肽ⅳ-1诱导组1.241.35多肽ⅳ-2诱导组1.381.19多肽ⅳ-3诱导组1.211.23多肽ⅳ-4诱导组1.271.31阴性对照组00阳性对照组1.171.08本领域人员知道，联合应用酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和抑瘤素m具有很强的诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的能力，从本实验也可以看出，酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和抑瘤素m联用组成的阳性对照组中，诱导培养14天后，细胞中甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna均呈明显的阳性表达，而甲胎蛋白和白蛋白为肝细胞的特异性标志物，证明骨髓间充质干细胞在酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和抑瘤素m联合作用下定向分化为肝细胞。本发明提供的多肽ⅳ-1～ⅳ-4具有相同的作用，证明本发明提供的多肽ⅳ-1～ⅳ-4具有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用，可以制成诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的生物制品。上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。sequencelisting<110>南京盖斯夫医药科技有限公司<120>诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的人工多肽及其生物制品<130>1<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>31<212>prt<213>人工序列<400>1leuglygluasnglnproaspalalysmetprocyspheglngluasp151015prometalametglythraspcysthrleumetgluiletrpasn202530<210>2<211>31<212>prt<213>人工序列<400>2leuglygluasnglnproaspalalystrpprocyspheglngluasp151015prometalatrpglythraspcysthrleumetgluiletrpasn202530<210>3<211>31<212>prt<213>人工序列<400>3leuglygluasnglnproaspalalysmetprocyspheglngluasp151015prometalatrpglythraspcysthrleumetgluiletrpasn202530<210>4<211>31<212>prt<213>人工序列<400>4leuglygluasnglnproaspalalystrpprocyspheglngluasp151015prometalametglythraspcysthrleumetgluiletrpasn202530当前第1页12