本发明涉及一种通过生物正交反应，利用细胞壁的生物合成途径来标记存活的革兰氏阳性细菌的方法。
背景技术
目前已知多种细菌的细胞表面标记技术。例如，可使用表达能够与细菌表面蛋白结合的目标蛋白的基因工程方法。然而，此类细胞表面工程学方法仅适用于标记蛋白和多肽类。与基因操作方法相比，基于代谢路径的化学方法可通过添加代谢类似物小分子，利用细胞自身的代谢通路将非天然化学标签共价连接至不同的非天然表位。
革兰氏阳性细菌细胞壁的典型组成成份之一为肽聚糖。肽聚糖是一种网络状杂多糖，其骨架由肽和聚糖两部分组成，其中的肽包括四肽尾和肽间桥两部分，而聚糖是由n-乙酰葡糖胺(g)和n-乙酰胞壁酸(m)两种单糖通过β-1,4糖苷键交替相连成的长链。真核细胞中不含肽聚糖，因此，肽聚糖是很好的抑制或标记细菌的靶标。然而目前，对肽聚糖在细菌中的生物合成途径知之甚少。对于肽聚糖的研究也仅限于发现其作为抑制剂靶标的潜在新用途。近十年来，对肽聚糖的合成进行追踪或编辑的研究取得了很大的进展。最近报道的肽聚糖的成像方法包括利用荧光标记的凝聚素(或抗体)、利用能够作用于细胞壁的带有荧光标签的抗生素、基于对游离的硫醇进行检测或放射性物质示踪的代谢标记的策略、利用荧光底物的酶法等。尽管这些技术已经用于揭示细菌细胞壁肽聚糖代谢的动力学过程，然而，这些技术操作过于繁杂而分辨率较低，且仅适用于特定的细菌种属，在应用的普适性方面存在很大的局限性。在上述技术中，荧光标记的抗体技术因其操作简单、物质在短时间内溶解性较高而最为广泛应用。然而，荧光标记的抗体可抑制细菌的活性，难以用其标记生长初期的革兰氏阳性菌。目前仍存在对于不干扰细菌生长的肽聚糖标记方法的需求。
生物正交反应是指具有如下特征的化学反应：在生理条件下进行，不干扰同时发生的其它生化反应或各种生物内源过程，且不会对生物体及生物内源分子造成损伤。目前最常用的生物正交反应基团对包括能够发生点击化学(clickchemistry)反应的叠氮基-炔基以及叠氮基-三芳基膦。其中，叠氮基与三芳基膦发生的施陶丁格反应(staudingerligation)或与炔基发生的环加成反应均能将与该生物正交反应基团对中的一个成员相连的糖偶联至与该生物正交反应基团对中的另一成员相连的可检测标记物，实现将可检测标记物修饰至糖的目的。其中，叠氮基团与高张力炔烃的环加成反应(strain-promotedazide-alkynecycloaddition，spaac)因其不需要添加催化剂而成为研究和应用热点。自2001年点击化学反应被提出以来，该反应已被广泛应用于表面修饰、树枝状化合物和功能聚合物的生成、细胞标记、生物医药合成、核酸或碳纳米管的修饰等。cn104039977b提出了一种利用叠氮基-炔基生物正交反应标记革兰氏阴性细菌细胞壁脂多糖的方法。然而，目前还未报道对革兰氏阳性细菌的细胞壁进行标记的方法。
技术实现要素：
本发明旨在利用革兰氏阳性细菌自身的代谢路径，将代谢类似物小分子添加至细胞壁，并基于生物正交反应来开发对存活的革兰氏阳性细菌及其细胞壁进行标记的方法。
一方面，本发明的目的在于提供一种对存活的革兰氏阳性细菌进行标记的方法，所述方法包括如下步骤：
(i)在革兰氏阳性细菌培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸，将革兰氏阳性细菌接种入所述培养基中并对所述革兰氏阳性细菌进行培养，得到细菌培养物；
(ii)收集步骤(i)得到的所述细菌培养物，通过处理得到所述细菌培养物的沉淀物；
(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀物中的细菌进行固定；
(iv)向步骤(iii)的经固定的细菌中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细菌内的肽聚糖；
(v)对所述可检测标记物进行检测。
另一方面，本发明提供了叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸用于对存活的革兰氏阳性细菌的细胞壁进行标记的用途，其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸的叠氮基与连接至可检测标记物的炔基或三芳基膦的生物正交反应来实现对存活的革兰氏阳性细菌的细胞壁的标记。
又一方面，本发明提供了叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸用于在包含细菌的样品中特异性地标记存活的革兰氏阳性细菌的用途，其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸的叠氮基与连接至可检测标记物的炔基或三芳基膦的生物正交反应来实现对存活的革兰氏阳性细菌的细胞壁的标记。
再一方面，本发明提供了一种用于检测存活的革兰氏阳性细菌的试剂盒，其中，所述试剂盒包含叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸以及连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
附图说明
图1为根据实施例2，实验组肽聚糖的hplc图谱。
图2为根据实施例2，实验组中6-叠氮基甲基-n-乙酰葡糖胺的lc-ms图谱。
图3为根据实施例2，实验组中n-乙酰葡糖胺的lc-ms图谱。
图4为根据实施例2，对照组肽聚糖的hplc图谱。
图5为根据实施例2，对照组单糖(n-乙酰葡糖胺)的lc-ms图谱。
图6为根据实施例3，实验组bcg菌细胞壁标记的荧光结果图(放大倍数100倍)。其中，1为明场，2为fitc通道，3为txred通道，4为1、2、3的叠加图。
图7为图6中的单个细菌的放大图。其中，1为明场，2为fitc通道，3为txred通道，4为1、2、3的叠加图。
图8为根据实施例3，对照组bcg菌细胞壁标记的荧光结果图(放大倍数100倍)。其中，1为明场，2为fitc通道，3为txred通道，4为1、2、3的叠加图。
具体实施方式
本发明通过革兰氏阳性细菌中的肽聚糖的生物代谢途径将叠氮修饰的n-乙酰葡糖胺-1-磷酸引入革兰氏阳性细菌细胞壁的肽聚糖中，利用生物正交反应在温和条件下引入探针分子(可检测标记物)，从而实现对存活的革兰氏阳性细菌细胞壁的标记。相比于使用遗传工程的其它标记方法，本方法操作更为简单。由于全部革兰氏阳性细菌细胞壁的骨架均为肽聚糖，且n-乙酰葡糖胺-1-磷酸(glcnac-1p)为肽聚糖的合成前体，该方法对革兰氏阳性细菌具有普适性。此外，本发明所使用的非天然n-乙酰葡糖胺-1-磷酸对细菌的生长和活性几乎没有影响，有助于实现对革兰氏阳性细菌活菌的快速、便捷的标记。
本发明所使用的术语“革兰氏阳性细菌”具有本领域公知的含义，即，由于其细胞壁主要成分为肽聚糖而能够通过革兰氏染色染成深蓝色或紫色的细菌。能够作为本发明方法检测对象的革兰氏阳性细菌为符合革兰氏阳性细菌分类定义的全部细菌，包括但不限于：分枝杆菌属(mycobacterium)、葡萄球菌属(staphylococcus)、肠球菌属(enterococcus)、梭菌属(clostridium)、李斯特氏菌属(listeria)、链球菌属(streptococcus)、芽孢杆菌属(bacillus)、棒杆菌属(corynebacterium)等。优选地，所述革兰氏阳性细菌选自于：结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、炭疽杆菌(bacillusanthracis)、白喉杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、破伤风杆菌(clostridiumtetani)。
肽聚糖是构成革兰氏阳性细菌细胞壁的主要成份，它是由n-乙酰葡糖胺(g)和n-乙酰胞壁酸(m)以及四个氨基酸缩合而成的短肽所组成。本研究使用非天然的叠氮修饰的glcnac-1-p衍生物，其能够经由活细菌的细胞壁合成途径进入细胞壁的肽聚糖，实现对革兰氏阳性细菌细胞壁的标记。
本发明中的叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸的游离羟基全部被乙酰化，从而该非天然糖被转运过膜的效率较高。事实上，所述叠氮基可通过任意方式被连接至全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸的葡萄糖六元环中的任一个碳原子。通过使非天然磷酸葡糖胺的叠氮基与带有可检测标记物的炔基或三芳基膦进行生物正交反应，将可检测标记物(即，探针)偶联至细胞壁的肽聚糖。
优选地，所述叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸为(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-2-(叠氮基甲基)-6-(膦酰基氧基)-3,4-二乙酰氧基-四氢-2h-吡喃((2r,3r,4r,5r,6r)-5-acetamido-2-(azidomethyl)-6-(phosphonooxy)tetrahydro-2h-pyran-3,4-diyldiacetate)(在本文中简称为6n3-acoglcnac-1p)，其结构如式1所示。6n3-acoglcnac-1p合成方法已为本领域所知晓，且可商购获得，例如可通过本发明中实施例1所述的步骤合成。
其中，ac为乙酰基，n3为叠氮基团。
在本发明的方法中，叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸能够与连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物发生反应，从而将可检测标记物偶联至肽聚糖的非天然糖胺(即，叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸)残基。
本文所述的可检测标记物包括但不限于放射性同位素、发色团、抗体、化学发光化合物、光谱比色标记物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
本文所述的方法中使用的可检测标记物可以是一级标记物(其中，标记物包含可被直接测定的部分或产生可被直接测定的信号的部分)或二级标记物(其中，可检测标记物结合至另一试剂以产生可测定的信号)。可检测标记物可通过共价或非共价的手段连接至炔基/三芳基膦部分。例如，可检测标记物可直接连接至炔基/三芳基膦部分；或者，可检测标记物通过配体-受体结合对、生物素-亲和素(例如链霉亲和素或卵亲和素)配偶体对或其它的此类特异性识别分子来实现与炔基或三芳基膦部分的连接。
在一些实施方式中，可检测标记物可以是荧光化合物，如荧光染料分子或荧光团，包括但不限于：荧光素，例如6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、异硫氰酸荧光素(fitc)；罗丹明及其衍生物，例如n,n,n’,n’-四甲基-6羧基罗丹明(tamra或t)、6-羧基-x-罗丹明(rox或r)、5-羧基罗丹明-6g(r6g5或g5)、6-羧基罗丹明-6g(r6g6或g6)、罗丹明110、四罗丹明异硫氰酸酯(tetrarhodimineisothiocynate，tritc)；青色素染料，例如cy3、cy5和cy7染料；香豆素，例如伞形酮等。优选地，所述荧光化合物为n,n,n’,n’-四甲基-6羧基罗丹明。
在一些实施方式中，可检测标记物可以是酶，用作标记物的酶可以产生例如化学发光信号、有色信号或荧光信号，例如萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶。或者，用于可检测地标记抗体试剂的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异源性酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-vi-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
在一些实施方式中，可检测标记物是化学发光化合物，包括但不限于：光泽精、鲁米诺、(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、异鲁米诺、咪唑、吖啶酯、吖啶酰胺、三联吡啶钌和草酸酯。
在一些实施方式中，可测定标记物可以是光谱比色标记物，包括但不限于：胶体金或者有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯和乳胶)珠。
在一些实施方式中，可检测标记物可以是放射性同位素，包括但不限于：3h、125i、35s、14c、32p和33p。
在一些实施方式中，可检测标记物包括可通过如下测定的任意标记物：光谱手段；光化学手段；生物化学手段；免疫化学手段；电磁手段；放射化学手段；或化学手段，例如荧光手段、化学荧光手段、或化学发光手段、或任何其它适当的手段。
在优选的实施方式中，可检测标记物经由生物素-亲和素配偶体对连接至炔基或三芳基膦，所述炔基或三芳基膦与叠氮基形成生物正交反应基团对。
优选地，所述连接有炔基的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述
优选地，所述连接有三芳基膦的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述
上述化合物的合成方法均为本领域所知晓、或商购可得。
在一些优选的实施方式中，所述连接有炔基/三芳基膦的可检测标记物为通过含高张力炔烃的二苯并氮杂环辛烯-peg4-生物素(dibenzocyclooctyne-peg4-biotinconjugate(dbco-peg4-biotin))与链霉亲和素-可检测标记物(即，连接有链霉亲和素的可检测标记物)缀合获得。所述二苯并氮杂环辛烯-peg4-生物素的结构如式(ii-7)所示：
在另一些优选的实施方式中，所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物为含张力炔烃的二苯并氮杂环辛烯-peg4-荧光素545(dibenzocycl-ooctyne(dbco)-peg4-fluor545或dbco-peg4-tamra)，其结构如式(ii-8)所示。
上述全部化合物以及修饰有链霉亲和素的多种可检测标记物(放射性同位素、发色团、抗体、化学发光化合物、光谱比色标记物、荧光化合物、金属螯合物和酶)均可商购得到。
本发明的方法可实现对革兰氏阳性细菌(例如结核分枝杆菌)的标记，包括如下步骤：
(i)在革兰氏阳性细菌培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸，将革兰氏阳性细菌接种入所述培养基中并对所述革兰氏阳性细菌进行培养，得到细菌培养物；
(ii)收集步骤(i)得到的所述细菌培养物，通过处理得到所述细菌培养物的沉淀物；
(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀物中的细菌进行固定；
(iv)向步骤(iii)的经固定的细菌中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细菌内的肽聚糖；
(v)对所述可检测标记物进行检测。
步骤(i)的革兰氏阳性细菌的接种浓度、培养条件、培养时间等均为本领域用于细菌培养的常规条件或参数。
优选地，步骤(i)的所述叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸为所述式(i)的化合物。优选地，将所述式(i)的化合物以120-200μg/ml、优选160μg/ml的终浓度添加至培养基。
步骤(ii)中，所述收集为常规操作，例如，对于固体培养物，可采用无菌水洗涤菌落得到菌悬液作为收集得到的细菌培养物，或者对于液体培养物可直接收集至离心管中等。优选地，例如对于液体培养物在收集后通过离心得到沉淀物。进一步优选，利用pbstb缓冲液洗涤得到的细菌培养物的沉淀物，洗去未被利用的非天然化合物(即，叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸)。另外，所述离心为本领域的常规操作，本领域技术人员可以根据其掌握的本领域普通技术知识而针对不同的革兰氏阳性细菌选择适宜的离心转速等。
优选地，步骤(iii)中，利用4w/v％多聚甲醛对细菌进行固定。进一步优选，在固定后进行离心，得到细菌沉淀并用pbstb缓冲液进行洗涤，以洗去多余的多聚甲醛固定液。
优选，在进行步骤(iv)之前，将生物素-炔基部分或生物素-三芳基膦部分与链霉亲和素-可检测标记物偶联，形成所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。或者，在进行步骤(iv)时，向步骤(iii)的经固定的细胞中添加生物素-炔基部分或生物素-三芳基膦部分，随后添加链霉亲和素-可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白。
优选地，步骤(iv)的所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物为所述式(ii-8)的化合物。
不希望被理论所限地，在上述反应中，被掺入肽聚糖的叠氮基浓度决定了能够被结合的式(ii-8)化合物的量，因此，只要保证用量能够满足对叠氮基进行标记即可，而没有特别限制。优选地，所述式(ii-8)化合物的用量大于5mm。进一步优选地，向所述经固定的细菌中添加10mm的所述式(ii-8)的化合物。优选，向所述经固定的细菌中添加所述式(ii-8)的化合物后孵育1.5h。
本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：
1.一种对存活的革兰氏阳性细菌进行标记的方法，所述方法包括如下步骤：
(i)在革兰氏阳性细菌培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸，将革兰氏阳性细菌接种入所述培养基中并对所述革兰氏阳性细菌进行培养，得到细菌培养物；
(ii)收集步骤(i)得到的所述细菌培养物，通过处理得到所述细菌培养物的沉淀物；
(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀物中的细菌进行固定；
(iv)向步骤(iii)的经固定的细菌中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细菌内的肽聚糖；
(v)对所述可检测标记物进行检测。
2.如段落1所述的方法，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸为(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-2-(叠氮基甲基)-6-(膦酰基氧基)-3,4-二乙酰氧基-四氢-2h-吡喃。
3.如段落1或2所述的方法，其中，所述连接有炔基的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述连接有三芳基膦的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述
4.如段落1-3中任一项所述的方法，其中，所述可检测标记物选自于：放射性同位素、发色团、抗体、化学发光化合物、光谱比色标记物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
5.如段落4所述的方法，其中，所述放射性同位素选自于：
3h、125i、35s、14c、32p和33p。
6.如段落4所述的方法，其中，所述荧光化合物选自于：
荧光素，例如6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、异硫氰酸荧光素)；罗丹明及其衍生物，例如n,n,n’,n’-四甲基-6羧基罗丹明、6-羧基-x-罗丹明、5-羧基罗丹明-6g、6-羧基罗丹明-6g、罗丹明110、四罗丹明异硫氰酸酯；青色素染料，例如cy3、cy5和cy7染料；香豆素，例如伞形酮等；
优选地，所述荧光化合物为n,n,n’,n’-四甲基-6羧基罗丹明。
7.如段落4所述的方法，其中，所述酶选自于萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶。
8.如段落4所述的方法，其中，所述酶选自于：
苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异源性酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-vi-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
9.如段落4所述的方法，其中，所述化学发光化合物选自于：
光泽精、鲁米诺、(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、异鲁米诺、咪唑、吖啶酯、吖啶酰胺、三联吡啶钌和草酸酯。
10.如段落4所述的方法，其中，所述光谱比色标记物选自于：
胶体金或者有色玻璃或塑料珠。
11.如段落1-10中任一项所述的方法，其中，所述可检测标记物直接连接至所述炔基部分或三芳基膦部分，从而形成所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
12.如段落1-10中任一项所述的方法，其中，所述可检测标记物经由配体-受体结合对或生物素-亲和素配偶体对连接至所述炔基部分或三芳基膦部分，从而形成所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
13.如段落12所述的方法，其中，所述生物素-亲和素配偶体对中的亲和素为链霉亲和素或卵亲和素。
14.如段落13所述的方法，其中，在进行步骤(iv)之前，将生物素-炔基部分或生物素-三芳基膦部分与链霉亲和素-可检测标记物偶联，形成所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
15.如段落13所述的方法，其中，在进行步骤(iv)时，向步骤(iii)的经固定的细胞中添加生物素-炔基部分或生物素-三芳基膦部分，随后添加链霉亲和素-可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白。
16.如段落14或15所述的方法，其中，所述生物素-炔基部分为二苯并氮杂环辛烯-peg4-生物素。
17.如段落4所述的方法，其中，所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物为二苯并氮杂环辛烯-peg4-荧光素545。
18.如段落1-17中任一项所述的方法，其中，在步骤(ii)中，利用pbstb缓冲液洗涤所述细菌培养物的沉淀物。
19.如段落1-18中任一项所述的方法，其中，在步骤(iii)中，利用多聚甲醛对所述细菌进行固定；优选在所述固定后对所述经固定的细菌进行离心，得到细胞沉淀并用pbstb缓冲液进行洗涤。
20.如段落2-18中任一项所述的方法，其中，将所述(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-2-(叠氮基甲基)-6-(膦酰基氧基)-3,4-二乙酰氧基-四氢-2h-吡喃以120-200μg/ml、优选160μg/ml的终浓度添加至所述培养基。
21.如段落1-20中任一项所述的方法，其中，所述方法用于对革兰氏阳性细菌的细胞壁进行标记。
22.如段落1-21中任一项所述的方法，其中，所述革兰氏阳性细菌选自于：
分枝杆菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、梭菌属、李斯特氏菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属。
23.如段落1-21中任一项所述的方法，其中，所述革兰氏阳性细菌选自于：
结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌。
24.叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸用于对存活的革兰氏阳性细菌的细胞壁进行标记的用途，其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸的叠氮基与连接至可检测标记物的炔基或三芳基膦的生物正交反应来实现对存活的革兰氏阳性细菌的细胞壁的标记。
25.叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸用于在包含细菌的样品中特异性地标记存活的革兰氏阳性细菌的用途，其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸的叠氮基与连接至可检测标记物的炔基或三芳基膦的生物正交反应来实现对存活的革兰氏阳性细菌的细胞壁的标记。
26.如段落24或25所述的用途，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸为(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-2-(叠氮基甲基)-6-(膦酰基氧基)-3,4-二乙酰氧基-四氢-2h-吡喃。
27.如段落24-26中任一项所述的用途，其中，所述可检测标记物选自于：放射性同位素、发色团、抗体、化学发光化合物、光谱比色标记物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
28.如段落27所述的用途，其中，所述放射性同位素选自于：
3h、125i、35s、14c、32p和33p。
29.如段落27所述的用途，其中，所述荧光化合物选自于：
荧光素，例如6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、异硫氰酸荧光素)；罗丹明及其衍生物，例如n,n,n’,n’-四甲基-6羧基罗丹明、6-羧基-x-罗丹明、5-羧基罗丹明-6g、6-羧基罗丹明-6g、罗丹明110、四罗丹明异硫氰酸酯；青色素染料，例如cy3、cy5和cy7染料；香豆素，例如伞形酮等；
优选地，所述荧光化合物为n,n,n’,n’-四甲基-6羧基罗丹明。
30.如段落27所述的用途，其中，所述酶选自于萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶。
31.如段落27所述的用途，其中，所述酶选自于：
苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异源性酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-vi-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
32.如段落27所述的用途，其中，所述化学发光化合物选自于：
光泽精、鲁米诺、(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、异鲁米诺、咪唑、吖啶酯、吖啶酰胺、三联吡啶钌和草酸酯。
33.如段落27所述的方法，其中，所述光谱比色标记物选自于：
胶体金或者有色玻璃或塑料珠。
34.一种用于检测存活的革兰氏阳性细菌的试剂盒，其中，所述试剂盒包含叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸以及连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
35.如段落34所述的试剂盒，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸为(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-2-(叠氮基甲基)-6-(膦酰基氧基)-3,4-二乙酰氧基-四氢-2h-吡喃。
36.如段落34或35所述的试剂盒，其中，所述连接有炔基的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述连接有三芳基膦的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述
37.如段落34-36中任一项所述的试剂盒，其中，所述可检测标记物选自于：放射性同位素、发色团、抗体、化学发光化合物、光谱比色标记物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
38.如段落37所述的试剂盒，其中，所述放射性同位素选自于：
3h、125i、35s、14c、32p和33p。
39.如段落37所述的试剂盒，其中，所述荧光化合物选自于：
荧光素，例如6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、异硫氰酸荧光素)；罗丹明及其衍生物，例如n,n,n’,n’-四甲基-6羧基罗丹明、6-羧基-x-罗丹明、5-羧基罗丹明-6g、6-羧基罗丹明-6g、罗丹明110、四罗丹明异硫氰酸酯；青色素染料，例如cy3、cy5和cy7染料；香豆素，例如伞形酮等；
优选地，所述荧光化合物为n,n,n’,n’-四甲基-6羧基罗丹明。
40.如段落37所述的试剂盒，其中，所述酶选自于萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶。
41.如段落37所述的试剂盒，其中，所述酶选自于：
苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异源性酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-vi-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
42.如段落37所述的试剂盒，其中，所述化学发光化合物选自于：
光泽精、鲁米诺、(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、异鲁米诺、咪唑、吖啶酯、吖啶酰胺、三联吡啶钌和草酸酯。
43.如段落37所述的试剂盒，其中，所述光谱比色标记物选自于：
胶体金或者有色玻璃或塑料珠。
实施例
结核病是由人结核分枝杆菌(m.tuberculosis)引起的慢性感染性疾病，是世界范围内第二大传染性疾病，目前治疗结核的药物靶点很多为结核分枝杆菌细胞壁。在本发明的实施例中，我们以与人结核分枝杆菌同源的牛结核分枝杆菌作为示例性的待检测革兰氏阳性菌，利用本发明的方法对其细胞壁进行标记。
下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特别说明，全部试剂购自sigma-aldrich。
实施例中所用试剂：
7h9培养基：在180ml双蒸水中加入0.94g7h9培养基粉末、0.4ml甘油、0.1mltween80，121℃灭菌10min。使用前加入20ml经过滤灭菌的增菌剂oadc。
oadc：在30ml双蒸水中加入0.255gnacl、1.5gbsa-v、0.6g葡萄糖、0.016g油酸钠、0.0012g过氧化氢酶(catalase)，过滤除菌。
pbs缓冲液(10mm)：溶剂为水，溶质为nah2po4、na2hpo4、kcl和nacl，所述溶质nah2po4、na2hpo4、kcl和nacl在所述pbs缓冲液中的浓度分别为0.24g/l、1.42g/l、0.2g/l和8.0g/l；所述pbs缓冲液的ph值为7.4。
pbstb缓冲液(10mm)：溶剂为水，溶质为nah2po4、na2hpo4、kcl、nacl、bsa和吐温20，所述溶质nah2po4、na2hpo4、kcl、nacl、bsa和吐温20在所述pbs缓冲液中的浓度分别为0.24g/l、1.42g/l、0.2g/l、8.0g/l、0.5w/v％和0.1v/v％。所述pbstb缓冲液的ph值为7.4。
pb缓冲溶液：溶剂为水，溶质为nah2po4、na2hpo4、所述溶质nah2po4、na2hpo4在所述pbs缓冲液中的浓度分别为0.24g/l和1.42g/l。所述pb缓冲液的ph值为7.4。
tca溶液：10g三氯乙酸溶于100ml水，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。
结合缓冲液(ph7.5)：溶剂为水，溶质为tris、nacl。所述溶质tris、nacl在所述结合缓冲液的浓度分别为2.4g/l，2.9g/l；所述结合缓冲液的ph值为7.5。
含张力炔烃的二苯并氮杂环辛烯-peg4-荧光素545(dibenzocycl-ooctyne(dbco)-peg4-fluor545)购自sigma-aldrich(货号760773)。
牛结核分枝杆菌(拉丁名为mycobacteriumbovis，本领域通用名称为bacilluscalmette–guérin)：菌株为bcg菌株/bcgpasteur1173p2，该菌株带有puv3583c-gfp质粒，能够表达gfp。bcg菌株/bcgpasteur1173p2的构建和说明请参见fungalbiotransformationoftanshinoneresultsin[4+2]cycloadditionwithsorbicillinol:evidenceforenzymecatalysisandincreasedantibacterialactivity，wennihe等，appliedmicrobiologyandbiotechnology，2016。
实施例1(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-2-(叠氮基甲基)-6-(膦酰基氧基)-3,4-二乙酰氧基-四氢-2h-吡喃(6n3-acoglcnac-1p)的化学合成
6n3-acoglcnac-1p的合成为利用氮乙酰葡糖胺作为起始物进行。合成路径如下：
其中，ac为乙酰基，n3为叠氮基团，ts为对甲苯磺酰基，me为甲基。
向10.00g氮乙酰葡糖胺(0.045mol)(购自sigma，货号a3286)中加入10.35g对甲基苯磺酰氯(0.054mol)，用300ml吡啶溶解，搅拌反应过夜。加入45ml乙酸酐(0.528mol)反应6h，用油泵旋干吡啶，再分别用1m盐酸和饱和碳酸氢钠萃取洗涤。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。旋干后，使用柱相快速层析分离化合物(流动相：乙酸乙酯/石油醚＝2:1)得到糖浆状化合物6c(12.00g，产率70％)。向10.00g化合物6c(0.026mol)中加入4.00g叠氮化钠(0.059mol)，溶于150ml二甲基甲酰胺，65℃加热回流12h，旋干后再用饱和氯化钠和乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干，使用柱相快速层析分离化合物(流动相：乙酸乙酯/石油醚＝1:1)，得化合物6d(7.20g，产率75％)。加入甲醇钠/甲醇(1m)并调节ph至9，室温下反应3h后，使用h+离子交换树脂中和，过滤、旋干，得到白色固体化合物6e(4.40g，产率93％)。在10ml反应体系中，向54.1mg化合物6e(22mm)中加入112mgatp(20mm)和7.5mgn-乙酰氨基己糖1-位激酶(nahk)(0.75mg/ml)；缓冲液为100mmtris-hcl(含10mmmgcl2)，ph9.0；反应温度为37℃，反应时间为12h。煮沸5min停止反应，12000g离心5min，收取上清液悬蒸浓缩后过凝胶柱，得到化合物6f(64mg，产率90％)，用茴香醛显色剂显色。将100mg化合物6f(0.31mmol)溶解至10ml吡啶，冰浴下缓慢滴加醋酸酐(0.92mmol)反应6h，旋干后溶解于二氯甲烷，依次采用1m盐酸和饱和碳酸氢钠洗涤，合并有机相并用无水硫酸钠干燥。旋干后，使用柱相快速层析分离化合物(流动相：乙酸乙酯/甲醇＝1:1)得到白色固体化合物6(95mg，产率75％)，即6n3-acoglcnac-1p，其结构式如式(i)所示。
化合物6结构鉴定如下：1hnmr(500mhz,d2o):δ＝5.38(dd,1h,j＝7.1hz,3.2hz,h-1),5.23(t,1h,j＝9.5hz),5.07(t,1h,j＝9.7hz),4.23(dd,2h,j＝21.05,10.55hz),3.64-3.56(m,1h),3.39-3.36(m,1h),2.01(s,3h),1.95(s,3h),1.90(s,3h).hresimscaledforc12h19n4o10p(m-h)-:409.0826；foundm/z409.0749。
实施例2结核分枝杆菌肽聚糖的提取
为了证明式(i)化合物经细菌代谢能够被插入到细胞壁的肽聚糖中，我们将式(i)化合物与牛结核分枝杆菌共同孵育，提取其肽聚糖，或者用溶菌酶处理释放单糖，再用hplc-ms分析肽聚糖或单糖的成分。其中，溶菌酶可以专一性地作用于肽聚糖分子的n-乙酰胞壁酸与n-乙酰葡糖胺之间的β-1,4糖苷链，使之断裂获得单糖。
(1)将bcg菌分别接种于两瓶2l甘油丙氨酸培养基中，37℃轻微摇10天，使bcg菌生长至对数中期。在其中一瓶细胞培养物中加入终浓度为160μg/ml的实施例1获得的式(i)的化合物(实验组)，另一瓶不加入任何化合物作为阴性对照(对照组)，继续培养7天。
(2)以12000g转速将培养的细菌离心，并用pbs缓冲液冲洗，高温100℃煮沸灭活。用0.22μm滤膜过滤，将细菌细胞与培养基分离，得到9g细菌细胞(湿重)，用4.5mltse(10mmtris-hcl、150mmnacl和1mmedta)重悬细胞，用低温高压破碎仪(jnbio-mini)4℃高压(1500bar)破碎，将经破碎的细胞悬浮液在4℃、2500g离心20min，去掉未破碎的细胞以及碎片，收集上清液，在4℃、27000g，离心1h，得到细胞壁。
(3)向细胞壁中加入8w/v％的十二烷基磺酸钠(sds)后，沸水浴煮沸10min，冷却至室温后，12000r/min离心15min收集沉淀。用pbs缓冲液反复洗涤沉淀至无泡沫为止。将得到的沉淀加入到0.lmol/l、ph值7.8的pb缓冲溶液(含有3mg/ml的胰蛋白酶)中处理3h，然后将混合液在3000r/min离心5min收集上清液。将所得上清液12000r/min离心15min收集沉淀。
(4)将步骤(3)中最后所得的沉淀用10g/dl的tca溶液重悬，90℃水浴20min之后冷却至室温。12000r/min离心15min，收集沉淀，用蒸馏水洗涤三次。
(5)将步骤(4)获得的沉淀用乙醚重悬，静置30min后再12000r/min离心15min，收集沉淀，用无水乙醇脱水，70℃干燥，获得肽聚糖。
(6)在3.5ml的pbs中将步骤(1)培养的细菌稀释，超声降解。将变溶菌素(购买自萨恩化学技术有限公司，货号：a07m9901)与溶菌酶(购买自华博德亿，货号cl6951)溶解至500μl的tris-hcl(0.5mm，ph6.5)中，使其终浓度分别为150μg/ml和100μg/ml，随后与超声降解获得的碎片缓慢混合，在37℃孵4h。将样品在90℃加热5分钟，将变溶菌酶及溶菌酶灭活。
(7)利用hplc-ms对步骤(5)获得的肽聚糖和步骤(6)获得的单糖的出峰情况进行检测。
hplc条件如下：采用nova-pakc18(3.9×150mm，4μm)色谱柱，以20mm三乙胺-醋酸(ph4.0)为流动相，流速0.5ml/min，检测波长为260nm，柱温为室温。
图1为实验组肽聚糖的hplc图谱。图2为实验组单糖中6-叠氮基甲基-n-乙酰葡糖胺的lc-ms图谱。图3为实验组中n-乙酰葡糖胺的lc-ms图谱。由图1-3可以看出，实验组提取的肽聚糖在单糖分子量范围可找到两个明显峰：氮乙酰葡糖胺(glc-nac，m＝221.08)以及6-叠氮基甲基-n-乙酰葡糖胺(6n3-glcnac，m＝246.10)。
图4为对照组中bcg菌肽聚糖的hplc图谱。图5为对照组中氮乙酰葡糖胺的lc-ms图谱。由图4和5可知，在培养基中未加入实施例1获得的式(i)化合物时，培养得到的bcg菌所提取的肽聚糖在单糖分子量范围只可找到一个明显峰：n-乙酰葡糖胺(glc-nac，m＝221.08)，而没有6n3-glcnac的峰。
以上结果可证明式(i)的化合物能够被插入到肽聚糖中。
实施例3结核分枝杆菌细胞壁的标记
(i)准备两瓶2l甘油丙氨酸培养基，一瓶加入终浓度为160μg/ml的实施例1获得的式(i)的化合物(实验组)，另一瓶不加入任何化合物作为阴性对照(对照组)，将处于对数生长期的结核分枝杆菌(bcg菌)分别接种于上述培养基，37℃培养14天，得到细胞培养液。
(ii)收集步骤(i)得到的细胞悬液，12000g离心，得到所述细胞的沉淀；离心后用pbstb缓冲液将菌沉淀冲洗3遍。
(iii)用4w/v％甲醛对步骤(ii)获得的所述沉淀中的细胞固定20min，再用pbstb缓冲液冲洗三遍。
(iv)向步骤(iii)的经固定的细胞中添加10mmdbco-peg4-fluor545，室温下孵育1.5h，从而将红色荧光标记物偶联至细菌内的肽聚糖。
(v)利用共聚焦显微镜对所述可检测标记物进行检测。
结果如图6-8所示。
图6为100倍镜下实验组bcg菌细胞壁的标记的荧光照片。如图6所示，其中，(1)为明场下观察到的bcg菌的形态；(2)为fitc通道的结果，显示bcg菌表达的gfp(吸收峰395nm，发射峰509nm)的分布；(3)为txred通道的结果，显示fluor545(吸收峰545nm，发射峰567nm)的分布；(4)为(1)-(3)的叠加图。可以看到，bcg菌表面有红色荧光(图6(3))，说明式(i)的化合物被成功标记在结核分枝杆菌的细胞壁上。
图7为图6中一个细菌的放大图(放大倍数100倍)。其中，(1)为明场下观察到的bcg菌的形态；(2)为fitc通道的结果，显示bcg菌表达的gfp(吸收峰395nm，发射峰509nm)的分布；(3)为txred通道的结果，显示fluor545(吸收峰545nm，发射峰567nm)的分布；(4)为(1)-(3)的叠加图。可以看到，gfp与fluor545共定位，说明式(i)的化合物被成功标记在结核分枝杆菌的细胞壁上。
图8为100倍镜下对照组bcg菌细胞壁标记的荧光照片。如图8所示，其中，(1)为明场下观察到的bcg菌的形态；(2)为fitc通道的结果，显示bcg菌表达的gfp(吸收峰395nm，发射峰509nm)的分布；(3)为txred通道的结果，显示fluor545(吸收峰545nm，发射峰567nm)的分布；(4)为(1)-(3)的叠加图。可以看到，图(3)中无任何信号，说明细胞壁没有被标记。
上述实施例证明了肽聚糖合成前体glcnac-1p的类似物—叠氮修饰的全乙酰化n-乙酰葡糖胺-1-磷酸可被结核分枝杆菌自身的glmu酶所利用，代谢到了结核分枝杆菌细胞壁上，从而能够被用于实现对存活的结核分枝杆菌细胞壁的标记。