本发明涉及活性多糖提取技术领域，具体地，涉及一种从鱼鳔中提取类肝素化合物的方法。
背景技术：
我国是水产品生产、贸易和消费大国。随着渔业和水产品养殖业的不断发展，我国水产品的产量自1980到2016年间从449.7万吨提高到6900万吨，占全球水产品产量的三分之一以上。同时，水产品加工业也迅猛发展，每年产生大量的加工下脚料不仅造成了渔业资源的浪费，也对环境造成严重污染。其中，鱼鳔作为药食兼用宝贵资源，富含活性成分，值得充分开发利用。
肝素是一种主要由糖醛酸与葡萄糖胺的组成的酸性粘多糖，其作为高效的抗凝血和抗血栓药物一直被广泛应用。国内外制取肝素的原料多以猪小肠粘膜、牛肺、猪肺为主，这些肝素长期使用会出现自发性出血、血小板减少症及许多不可预见性的副作用。因此，寻找新的肝素类候选药物一直是研究热点。类肝素是指与肝素结构相似，天然、合成或半合成的，与肝素有类似作用，但与肝素在分子量和某些药理性质上有所不同的物质。类肝素的抗凝血作用弱而缓和、用药安全，长期使用副作用少。类肝素化合物提取工艺是根据不同种类的糖胺聚糖电荷密度不同的原理，采用阴离子交换树脂吸附，低浓度氯化钠溶液洗脱，以除去中性和电荷密度较低的糖胺聚糖、蛋白质和色素等杂质，再用高浓度氯化钠溶液洗脱下电荷密度较高的类肝素化合物。传统的工艺采用的是大孔阴离子交换树脂吸附静态吸附，并用浓度高达2～5mol/l的氯化钠溶液洗脱。该方法虽然操作简单，但类肝素化合物与其他糖胺聚糖分离效果低，所制备的类肝素粗品纯度低，且高浓度氯化钠影响后续的醇沉效果。
因此，仍需研究一种类肝素化合物与其他糖胺聚糖分离效果好、纯度高的提取方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从鱼鳔中提取类肝素化合物的方法，本发明提供的方法所提取得到的类肝素化合物纯度高，其含量高达85%以上，并且与其它糖胺聚糖的分离效果好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从鱼鳔中提取类肝素化合物的方法，所述方法包括如下步骤：
s1：将鱼鳔干燥并粉碎，然后加入氯化钠溶液和蛋白酶酶解，酶解条件为料液比1:20～35，ph7.5～9，温度为45～60℃，酶解时间4～8h；
s2:将s1所得酶解液灭酶、离心，取上清液过阴离子交换树脂吸附，并选用摩尔分数为0.7～0.9mol/l的氯化钠溶液进行第一次洗脱，然后再选用摩尔分数为1～1.5mol/l的氯化钠溶液进行第二次洗脱；
s3：将s2第二次洗脱所得洗脱液经超滤后醇沉、冷冻干燥即得所述类肝素化合物；
其中，所述蛋白酶为质量分数为2～5%的碱性蛋白酶和质量分数为1～4%的菠萝蛋白酶。
优选地，s1中，将鱼鳔干燥并粉碎成粒径为150～300μm的粉末。
优选地，s3中，所述超滤选用分子量为1000～3000da的超滤膜；选用此范围之内的超滤膜能够有效出去盐和小分子杂质。
优选地，s1酶解完成后，将所得酶解液于沸水浴灭酶15～20分钟。
优选地，s2中，所述离心的转速为3500～5000r/min，离心时间为10～25分钟。
优选地，s2中，所述吸附的过程中保持温度为45～60℃；酶解液的上样量为4～8倍柱床体积，并以0.5～2倍柱床体积/小时的速度流入层析柱。
在本发明中，所述层析柱中的树脂需进行预处理；具体地，将所述树脂用蒸馏水浸泡过夜，使其充分溶胀，然后用3～5倍的再生液处理2～4小时，再用蒸馏水水洗至中性。
优选地，所述树脂为罗门哈斯fpa98cl树脂；所述再生液为质量分数为10%的氯化钠溶液和质量分数为0.2～0.5%的氢氧化钠溶液。
在本发明中，所述层析柱的规格为0.28cm*100cm；并且所述层析柱放置于恒温箱中，并使用恒流泵将酶解液泵入层析柱中。
在本发明中，所述吸附的具体过程为：阴离子交换树脂吸附完毕后，用蒸馏水冲洗层析柱，直至柱下流出液为无色透明溶液为止，然后用浓度为0.7～0.9mol/l的氯化钠溶液洗脱，以除去中性多糖、蛋白质和色素等杂质；再用1～1.5mol/l的氯化钠溶液洗脱，并收集第二次洗脱液供后续步骤超滤用。
优选地，s3中，所述醇沉为：向超滤后所得溶液中加入0.8～1.5倍体积的无水乙醇，搅拌20分钟后于4℃冰箱内静置过夜，离心取沉淀，并将沉淀物用无水乙醇洗涤多次。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明针对目前提取类肝素化合物回收率低、纯度低、洗脱过程中氯化钠浓度太高影响醇沉效果等问题，提出了采用阴离子交换树脂动态吸附类肝素化合物的方法。本发明提供的方法采用阴离子交换树脂动态吸附、梯度洗脱，不仅减少了氯化钠的使用，还有效避免了氯化钠浓度对后期醇沉效果的影响；显著提高了类肝素化合物与其他糖胺聚糖的分离效果，并且所得到的产品类肝素化合物的含量在85%以上。本发明利用水产品加工下脚料鱼鳔来提取类肝素化合物，提高了资源利用率；并且本发明工艺简单、操作方便，具有较大的推广应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1从鱼鳔中提取类肝素化合物的方法
一种鱼鳔提取类肝素化合物的制备方法，包括原料预处理、酶解、吸附、洗脱、沉淀和干燥步骤完成类肝素化合物的制备。具体步骤如下：
（1）原料粉碎：鱼鳔于50℃烘箱烘干，然后粉碎成300µm的粉末；
（2）双酶酶解：将鱼鳔粉与蒸馏水以1:20的比例配成悬浮液，再加入质量分数为1.2%的氯化钠、质量分数为3%的碱性蛋白酶和质量分数为2%的菠萝蛋白酶，用2mol/l的氢氧化钠溶液调节ph=8，在温度为45℃的磁力搅拌水浴锅中酶解4小时；
（3）灭酶离心：将步骤（2）所得的酶解液于沸水浴灭酶15分钟，冷却至室温后，以3500～5000转/分钟的速度离心10分钟；
（4）树脂预处理:将罗门哈斯fpa98cl树脂用蒸馏水浸泡过夜，使其充分溶胀，然后用3～5倍的再生液（质量分数为10%氯化钠和0.2%氢氧化钠溶液）处理2小时，再用蒸馏水洗至中性；
（5）吸附：取一支层析柱（0.28cm*100cm），用步骤（4）处理后的树脂装柱。将柱子置于恒温箱中，用恒流泵将步骤（3）所得的酶解液以0.5倍柱床体积/小时的速度流入柱子，交换过程中保持恒温箱的温度在45℃。
（6）洗脱：吸附完毕后，用蒸馏水冲洗柱子，直至柱下流出液为无色透明溶液为止，然后用0.7mol/l的氯化钠溶液洗脱，以除去中性多糖、蛋白质和色素等杂质，再用1mol/l的氯化钠溶液洗脱，收集第二次洗脱液。
（7）超滤：将步骤（6）收集的洗脱液经3000da超滤膜过滤以除盐和小分子杂质，弃去滤液；
（8）醇沉：在步骤（7）所得溶液中缓慢加入1倍体积的无水乙醇，磁力搅拌20分钟后于4℃冰箱里静置过夜，离心取沉淀，沉淀物再用无水乙醇洗涤两次。
（9）干燥：用步骤（8）所得的沉淀进行冷冻干燥即得类肝素化合物粗品。该粗品用阿利新蓝染色法检测得出类肝素化合物的含量为87.58%。
实施例2从鱼鳔中提取类肝素化合物的方法
一种鱼鳔提取类肝素化合物的制备方法，包括原料预处理、酶解、吸附、洗脱、沉淀和干燥步骤完成类肝素化合物的制备。具体步骤如下：
（1）原料粉碎：鱼鳔于50℃烘箱烘干，然后粉碎成300µm的粉末；
（2）双酶酶解：将鱼鳔粉与蒸馏水以1:25的比例配成悬浮液，再加入质量分数为1.6%的氯化钠、质量分数为4%的碱性蛋白酶和质量分数为3%的菠萝蛋白酶，用2mol/l的氢氧化钠溶液调节ph=7.5，在温度为50℃的磁力搅拌水浴锅中酶解6小时；
（3）灭酶离心：将步骤（2）所得的酶解液于沸水浴灭酶15分钟，冷却至室温后，以3500～5000转/分钟的速度离心15分钟；
（4）树脂预处理：将罗门哈斯fpa98cl树脂用蒸馏水浸泡过夜，使其充分溶胀，然后用3～5倍的再生液（质量分数为10%氯化钠和0.4%氢氧化钠溶液）处理4小时，再用蒸馏水洗至中性；
（5）吸附：取一支层析柱（0.28cm*100cm），用步骤（4）处理后的树脂装柱。将柱子置于恒温箱中，用恒流泵将步骤（3）所得的酶解液以1倍柱床体积/小时的速度流入柱子，交换过程中保持恒温箱的温度在55℃。
（6）洗脱：吸附完毕后，用蒸馏水冲洗柱子，直至柱下流出液为无色透明溶液为止，然后用0.9mol/l的氯化钠溶液洗脱，以除去中性多糖、蛋白质和色素等杂质，再用1.5mol/l的氯化钠溶液洗脱，收集第二次洗脱液。
（7）超滤：将步骤（6）收集的洗脱液经1000da超滤膜过滤以除盐和小分子杂质，弃去滤液；
（8）醇沉：在步骤（7）所得溶液中缓慢加入0.8倍体积的无水乙醇，磁力搅拌20分钟后于4℃冰箱里静置过夜，离心取沉淀，沉淀物再用无水乙醇洗涤两次。
（9）干燥：用步骤（8）所得的沉淀进行冷冻干燥即得类肝素化合物粗品。该粗品用阿利新蓝染色法检测得出类肝素化合物的含量为85.43%。
实施例3从鱼鳔中提取类肝素化合物的方法
一种鱼鳔提取类肝素化合物的制备方法，包括原料预处理、酶解、吸附、洗脱、沉淀和干燥步骤完成类肝素化合物的制备。具体步骤如下：
（1）原料粉碎：鱼鳔于50℃烘箱烘干，然后粉碎成200µm的粉末；
（2）双酶酶解：将鱼鳔粉与蒸馏水以1:35的比例配成悬浮液，再加入质量分数为1.5%的氯化钠、质量分数为4%的碱性蛋白酶和质量分数为4%的菠萝蛋白酶，用2mol/l的氢氧化钠溶液调节ph=9，在温度为60℃的磁力搅拌水浴锅中酶解8小时；
（3）灭酶离心：将步骤（2）所得的酶解液于沸水浴灭酶10分钟，冷却至室温后，以3500～5000转/分钟的速度离心20分钟；
（4）树脂预处理：将罗门哈斯fpa98cl树脂用蒸馏水浸泡过夜，使其充分溶胀，然后用3～5倍的再生液（质量分数为10%氯化钠和0.4%氢氧化钠溶液）处理2小时，再用蒸馏水洗至中性；
（5）吸附：取一支层析柱（0.28cm*100cm），用步骤（4）处理后的树脂装柱。将柱子置于恒温箱中，用恒流泵将步骤（3）所得的酶解液以1.5倍柱床体积/小时的速度流入柱子，交换过程中保持恒温箱的温度在55℃。
（6）洗脱：吸附完毕后，用蒸馏水冲洗柱子，直至柱下流出液为无色透明溶液为止，然后用0.8mol/l的氯化钠溶液洗脱，以除去中性多糖、蛋白质和色素等杂质，再用1.2mol/l的氯化钠溶液洗脱，收集第二次洗脱液。
（7）超滤：将步骤（6）收集的洗脱液经2000da超滤膜过滤以除盐和小分子杂质，弃去滤液；
（8）醇沉：在步骤（7）所得溶液中缓慢加入1.5倍体积的无水乙醇，磁力搅拌20分钟后于4℃冰箱里静置过夜，离心取沉淀，沉淀物再用无水乙醇洗涤两次。
（9）干燥：用步骤（8）所得的沉淀进行冷冻干燥即得类肝素化合物粗品。该粗品用阿利新蓝染色法检测得出类肝素化合物的含量为86.26%。
上述实施例只是本发明的较佳实施例，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。