转基因大豆W82‑HAL1‑8062转化事件外源插入载体旁侧序列及其应用的制作方法

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转基因大豆W82‑HAL1‑8062转化事件外源插入载体旁侧序列及其应用的制造方法与工艺

本发明涉及转基因大豆领域，具体而言，涉及转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入载体旁侧序列及其应用。

背景技术：

大豆是世界上主要的油料作物。2015年全球转基因作物的种植面积高达1.797亿公顷，其中大豆种植面积为0.916亿公顷，占总面积的51％^[1]。中国不仅是农业生产大国，更是农业消费大国。自1996年以来，中国已成为大豆净进口国。随着国内需求不断地增加，转基因大豆进口量也在逐年增大。仅在2015年，中国转基因大豆进口量高达8169万吨，同比增长14.4％^[2]。

对转基因大豆生物安全问题进行科学研究和评价是对转基因大豆进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基础，而转基因检测技术是生物安全评价的关键技术之一^[3]，对于转基因植株的身份验证具有重大意义，并有助于对外源基因的表达机制和外源基因在受体基因组中产生的影响进行研究，从而有助对于转基因植株的生物安全性做出评估^[4]。

hal1基因是酿酒酵母中与耐盐相关的基因，该基因的过量表达可以提高酵母对nacl的胁迫，而敲除调该基因，则大大降低酵母的耐盐性。目前，已经有一些hal1转基因植物，但尚未研究获得hal1转基因大豆，更缺少能够有效对hal1转基因大豆进行检测的方法。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入载体左侧翼序列，所述序列包括pchal1载体上的t-dna以及该t-dna插入位点左侧的大豆基因组序列，所述序列是第1号染色体上第49468395位核苷酸处插入pchal1的t-dna的转基因大豆的特异性片段，能够特异性地指示上述转基因大豆。

本发明的第二目的在于提供转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入载体右侧翼序列，该序列包括pchal1载体上的t-dna右侧翼序列以及该t-dna插入位点右侧的大豆基因组序列，该dna片段是第1号染色体上第49468395位核苷酸处插入pchal1的t-dna的转基因大豆的特异性片段，能够特异性地指示上述转基因大豆。

本发明的第三目的在于提供上述左侧翼序列或右侧翼序列在检测转基因大豆中的应用，可以快速、准确地检测样品是否来自于第1号染色体上第49468395位核苷酸处插入pchal1的t-dna片段的转基因大豆，尤其是w82-hal1-8062或由w82-hal1-8062育种而成的转基因大豆。

本发明的第四目的在于提供根据上述左侧翼序列设计的pcr引物对，通过上述pcr引物对能够快速、准确地检测待测样品的1号染色体上第49468395位核苷酸处是否插入的pchal1的t-dna，具有检测方便、特异性好、扩增效率高、以及准确性好的优点。

本发明的第五目的在于提供根据上述右侧翼序列设计的pcr引物对，通过上述pcr引物对能够快速、准确地检测待测样品是否插入了pchal1的t-dna，具有检测方便、特异性好、扩增效率高、以及准确性好的优点。

本发明的第六目的在于提供一种用于pcr的试剂盒，所述试剂盒将上述引物对与pcr用到的其他辅助试剂集成在一起，具有使用方便的优点。

本发明的第七目的在于提供上述引物对或试剂盒的使用方法，所述方法通过简单的pcr即可检测样品是否插入了pchal1的t-dna，具有检测方便、特异性好、以及准确性好的优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入载体左侧翼序列，所述左侧翼序列的核苷酸序列如seqidno：4所示。

本发明建立在吉林省农业科学院提供的转基因大豆w82-hal1-8062基础之上。转基因大豆w82-hal1-8062是通过农杆菌介导大豆子叶节方法将带有hal1基因的质粒pchal1的t-dna部分插入到大豆威廉姆斯82基因组上而获得的，其具有较好的耐盐性，能够在盐碱地生存，具有较好的应用和育种价值。但在本发明之前，尚无人知晓t-dna的具体插入位点，更加无法建立能够有效鉴定该转基因大豆的方法。

本发明精心设计5’sp1、5’sp2和5’sp3序列，结合takara公司的genomewalkingkit试剂盒，通过tail-pcr获得转基因大豆hal1-w82上t-dna左侧的侧翼序列，通过测序以及比对，最终确定转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入载体左侧的dna片段的序列，以及t-dna的插入位点为第1号染色体上第49468395位核苷酸处。该外源基因插入的区域为非编码区。外源t-dna的整合区域与外源基因的稳定表达及基因沉默的发生具有非常密切的关系，此t-dna插入到基因非编码区，避免了外源基因的插入对内源基因表达造成的影响。因此，本发明所述转基因大豆hal1-w82为合适的转基因材料，可用于后续的育种，具有较好的应用前景。

本发明上述转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入载体以及左侧翼序列涵盖pchal1质粒部分t-dna以及该t-dna插入处左侧的大豆基因组序列，可以特异性地表征在第1号染色体的第49468395位核苷酸处插入pchal1的t-dna序列的转基因大豆。基于该序列，可以特异性地检测待测样品是否源自上述转基因大豆，在转基因大豆的检测以及种质资源的鉴定方面具有重要意义和广泛的应用前景。

本发明还提供转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入载体右侧翼序列，所述右侧翼序列的核苷酸序列如seqidno：8所示。

本发明精心设计3’sp1、3’sp2和3’sp3序列，结合takara公司的genomewalkingkit试剂盒，通过tail-pcr获得转基因大豆hal1-w82上t-dna右侧翼序列，通过测序以及比对，最终确定转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入载体右侧的dna片段的序列。

本发明上述转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入载体右侧基因也可以特异性地表征在第1号染色体的第49468395位核苷酸处插入pchal1的t-dna序列的转基因大豆。基于该序列，可以特异性地检测待测样品是否源自上述转基因大豆，在转基因大豆的检测以及种质资源的鉴定方面具有重要意义。

本发明还提供上述左侧翼序列或右侧翼序列在检测转基因大豆中的应用，所述转基因大豆的第1号染色体上第49468395位核苷酸处插入pchal1的t-dna片段；优选地，所述转基因大豆为w82-hal1-8062或由w82-hal1-8062育种而成的转基因大豆。

在一些实施方式中，所述应用包括根据上述左侧翼序列或右侧翼序列设计用于检测所述转基因大豆的pcr引物对或杂交探针。

本发明还提供根据上述左侧翼序列设计的pcr引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno：10和seqidno：11所示。

本发明上述引物对中的一条设计在t-dna的bar基因上，另一条设计在t-dna左侧的大豆基因组上，因此，在扩增时，只有以t-dna插入到1号染色体的第49468395位核苷酸处的转基因大豆为模板才能扩增得到目的片段，以其他的转基因大豆或非转基因大豆为模板不能扩增获得目的片段，从而可以容易地判断检测对象是否为t-dna插入到1号染色体的第49468395位核苷酸处的转基因大豆。另外，本发明上述引物对经过精心设计和筛选之后方获得，具有特异性好、检测效率高和准确性好的优点。因此，本发明所述引物对对提高转基因材料的鉴定效率、转基因产品的管理与检测，以及种质资源的鉴定具有重要的意义。

本发明还提供根据上述右侧翼序列设计的pcr引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno：12和seqidno：13所示。

本发明上述引物对中的一条设计在t-dna的hal1基因上，另一条设计在t-dna右侧的大豆基因组上，因此，在扩增时，只有以t-dna插入到1号染色体的第49468395位核苷酸处的转基因大豆为模板才能扩增得到目的片段，以其他的转基因大豆或非转基因大豆为模板不能扩增获得目的片段，从而可以容易地判断检测对象是否为t-dna插入到1号染色体的第49468395位核苷酸处的转基因大豆。另外，本发明上述引物对经过精心设计和筛选之后方获得，具有特异性好、检测效率高和准确性好的优点。因此，本发明所述引物对对提高转基因材料的鉴定效率、转基因产品的管理与检测，以及种质资源的鉴定具有重要的意义。

本发明还提供一种用于pcr的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对，以及其他试剂。

本发明上述试剂盒将上述引物对与pcr用到的其他辅助试剂集成在一起，具有使用方便的优点。

在一些实施方式中，所述其他试剂包括水、dna聚合酶、dntps、pcr缓冲液、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种；优选地，所述dna聚合酶选自taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4dna聚合酶、klenow片段中的一种或多种；更优选地，所述dna聚合酶为taqdna聚合酶；最优选地，所述taqdna聚合酶为热启动taqdna聚合酶。

本发明还提供上述pcr引物对或试剂盒的使用方法，所述方法包括以待测样品的dna为模板、上述引物对为上下游引物进行pcr扩增，根据pcr扩增产物判断所述样品的1号染色体上的第49468395位核苷酸处是否插入pchal1的t-dna片段。

本发明上述使用方法通过简单的pcr方法即可检测样品的1号染色体上第49468395位核苷酸处是否插入的hal1基因，具有检测方便、特异性好、以及准确性好的优点。

在一些实施方式中，所述pcr反应的退火温度为50-54℃，循环数为30-35；优选地，所述pcr反应的退火温度为52℃，循环数为35。

在一些实施方式中，所述pcr反应的退火温度为48-50℃，循环数为30-35，优选地，所述pcr反应的退火温度为49℃，循环数为35。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明涉及转基因大豆w82-hal1-8062，所述大豆的第1号染色体上第49468395位核苷酸处插入pchal1上的t-dna序列，从而获得hal1基因，所述转基因大豆能够耐盐碱，在盐碱地生存，具有很好的应用前景。本发明首次获得转基因大豆w82-hal1-8062转化事件外源插入左侧翼序列和右侧翼序列，设计了相应的pcr引物和建立了特异性pcr检测方法，能够准确地检测待测样品是否来自第1号染色体上第49468395位核苷酸处插入pchal1的t-dna序列的转基因大豆，该方法灵敏，准确，简单，可靠，具有广阔的市场前景，对提高转基因材料的鉴定效率、转基因产品的管理与检测以及种质资源的鉴定具有重要的意义。

其次，本发明上述引物对经精心设计和反复筛选方最终获得，分别设计在t-dna和t-dna侧翼的大豆基因组上，只有以t-dna插入到1号染色体的第49468395位核苷酸处的转基因大豆为模板才能扩增得到目的片段，以其他的转基因大豆或非转基因大豆为模板不能扩增获得目的片段，从而可以容易地判断检测对象是否为t-dna插入到1号染色体的第49468395位核苷酸处的转基因大豆。另外，本发明上述引物对还具有特异性好、检测效率高和准确性好的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为pchal1质粒图谱；

图2为左边界tail-pcr电泳结果，其中，m1：λ-hindⅲdigest；1-3：ap11st2nd3rd；4-6：ap21st2nd3rd；7-9：ap31st2nd3rd；10-12：ap41st2nd3rd；13-15：正对照1st2nd3rd；m2：dl2000；

图3为左边界tail-pcr的测序结果，其中，加框部分为大豆基因组序列，加粗斜体部分为未匹配序列，带阴影部分为t-dna的bar基因序列；

图4为右边界tail-pcr电泳结果，其中，m1：λ-hindⅲdigest；1-3：ap11st2nd3rd；4-6：ap21st2nd3rd；7-9：ap31st2nd3rd；10-12：ap41st2nd3rd；13-15：正对照1st2nd3rd；m2：dl2000；

图5为右边界tail-pcr的测序结果，其中，加框部分为t-dna的hal1基因，加粗斜体部分为未匹配序列，带阴影部分为大豆基因组序列；

图6为大豆基因组chr01:49468395..49469837序列；

图7为转基因大豆f1h6018左右边界引物位置图；

图8为转基因大豆hal1-w82的特异性pcr检测结果(标带bp)，其中，1-5泳道为右边界引物3’f和3’r的扩增结果(1，2，3为阳性材料，4为阴性对照，5为质粒)；6-10泳道为左边界引物5’f和5’r的扩增结果(6，7，8为阳性材料，9为阴性对照，10为质粒)；m为100bpmarker。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

通过以下方法获取转基因大豆w82-hal1-8062左边界侧翼序列：

1、取大田种植的转基因大豆w82-hal1-8062(所述转基因大豆w82-hal1-8062获取自吉林省农业科学院)的叶片于-80℃保存，所述转基因大豆w82-hal1-8062是以大豆威廉姆斯82为受体材料，以质粒pchal1为转化载体，通过农杆菌介导大豆子叶节转化方法获得，所述质粒pchal1的图谱参见说明书附图图1。

2、采用ctab方法提取大豆叶片dna，用nanodrop检测提取的dna样品的纯度和浓度，具体方法参见参考文献5。

3、根据pchal1质粒图谱上的bar基因设计3条特异性引物，具体引物序列参见表1。

表1左边界特异性引物

4、以1μl(500ng)的转基因大豆基因组dna为模板，以5’sp1、5’sp2、5’sp3和takaragenomewalkingkit(codeno.6108)试剂盒中的ap1、ap2和ap3、ap4，以及ck引物，按takaragenomewalkingkit(codeno.6108)试剂盒说明书进行5次，每次3轮tail-pcr反应。

对pcr产物进行电泳，电泳结果如说明书附图图2所示，图2显示4个简并引物ap1、ap2、ap3、ap4的第3轮pcr反应(3、6、9、12泳道)均得到比试剂盒所提供正对照(15泳道)清晰的特异性条带。

5、选取大小适中的5’ap3-3rd约1.0kbp的扩增产物条带(9泳道)，使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0(codeno.9762)切胶回收特异性扩增产物条带。

6、胶回收产物与pmdtm19-tvector(codeno.6013)连接，转化至e.colicompetentcellsjm109(codeno.9052)中。

7、挑取阳性单菌落，进行测序，最终获得5’端未知侧翼序列，测序结果如seqidno：4所示(参见说明书附图图3)。

实施例2

通过以下方法获取转基因大豆w82-hal1-8062右边界侧翼序列：

1、根据pchal1质粒图谱上的hal1基因设计3条特异性引物，具体引物序列参见表2。

表2右边界特异性引物

2、以1μl(500ng)实施例1制备的基因组dna为模板，以3’sp1、3’sp2、3’sp3和takaragenomewalkingkit(codeno.6108)试剂盒中的ap1、ap2和ap3、ap4，以及ck引物，按takaragenomewalkingkit(codeno.6108)试剂盒说明书进行5次，每次3轮tail-pcr反应。

对pcr产物进行电泳，电泳结果如图4所示。图4显示引物ap1、ap2、ap3的第3轮pcr反应(3、6、9泳道)均得到比试剂盒所提供正对照(15泳道)清晰的特异性条带，并且分子量大小相似。

3、为方便测序选取与5’相同引物的3’ap3-3rd的扩增产物条带(9泳道)，使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0(codeno.9762)，切胶回收进行测序，测序结果如seqidno：8所示(见说明书附图图5)。

实施例3

按照以下方法确定外源t-dna在大豆基因组中的整合位点：

根据获得的侧翼序列测序结果在soybase网站(https://www.soybase.org/glycineblastpages/)比对大豆基因组，确定t-dna插入大豆基因组1号染色体非编码区49468395碱基处。

如图6大豆基因组gm01_49468395..49469837序列(seqidno：9)所示，带框显示的前半部分与左边界测序结果带框部分序列匹配(图3)，带阴影部分所显示的后半部分与右边界测序结果加框部分的序列匹配(图5)，这些结果说明左右边侧翼侧序列定位的t-dna在大豆基因组中的整合区域完全一致，此转基因事件为单拷贝转基因事件。t-dna在整合到大豆基因组的过程中，载体左右边界序列均被删除，左边界填充了8bp的一段未知来源的核苷酸序列，右边界填充了4bp的一段未知来源的核苷酸序列。

实施例4转基因大豆特异性pcr检测

1、根据侧翼序列测序结果设计pcr引物对：设计pcr引物对，其一端在t-dna序列，另一端在大豆基因组中：如5’f上游引物在左边界基因组上，5’r下游引物在t-dna上，3’f上游引物在t-dna上，3’r下游引物在右边界基因组上(图7)。具体引物序列参见表3。

表3：5’和3’端特异性引物

2、使用上述引物进行pcr检测，其中5’反应条件为：

第1步：94℃2min

第2步：94℃30s

第3步：52℃30s

第4步：72℃1min

第5步：72℃5min

第6步：16℃1h

第2～4步循环35次。

3’反应条件为：

第1步：94℃2min

第2步：94℃30s

第3步：49℃30s

第4步：72℃1min

第5步：72℃5min

第6步：16℃1h

第2～4步循环35次。

3、扩增产物利用2％琼脂糖凝胶检测，在质粒和阴性材料均不能扩增到条带，只有转基因阳性材料获得了预期大小的片段(图8)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

参考文献：

[1]clivejames.2015年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[j].中国生物工程杂志，2016，36(4):1-11.(jamesc.globalbiotechnology/gmcropscommercializationdevelopmenttrendin2015[j].chinabiotechnology2016,36(4):1-11(inchinese))

[2]崔宁波，张正岩.转基因大豆研究及应用进展[j].西北农业学报,2016,25(8):1111-1124.(cuinb,zhangzy.researchandapplicationoftransgenicsoybean[j].actaageiculturaeboreali-occidentalissinia2016,25(8):1111-1124.)

[3]郭斌，祁洋，尉亚辉.转基因植物检测技术的研究进展[j].中国生物工程杂志，2010，30(2)：120-126.(guob,qiy,wieyh.progressintheresearchoftransgenicplanttesting[j].chinabiotechnology2010,30(2):120-126.)

[4]刘蓓.外源基因插入位点旁侧序列的研究方法及进展[j].农业与技术，2012(4)：97.(wangxb,jianglx,2,weil,etal.integrationandinsertionsiteofepspsgeneonthesoybeangenomeingeneticallymodifiedglyphosate-resistantsoybean[j].actaagronomicasinica2010,36(3):365-375.)

[5]fultontm,chunwongsej,tanksleysd.microprepprotocolforextractionofdnafromtomatoandotherherbaceousplants[j].plantmolecularbiologyreporter,1995,13(3):207-209.

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<110>吉林省农业科学院

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