一种基于蛋白互作用于检测细胞PD1表达情况的融合蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测细胞pd1表达情况的融合蛋白及其应用。

背景技术：

程序性死亡受体-1(programmedcelldeathprotein-1，pd1/cd279)是重要的免疫检查点，通过与其两个配体pdl1(b7-h1/cd274)和pdl2(b7-dc/cd273)的作用而抑制t细胞的活化及细胞因子的产生，在维持机体的外周耐受上发挥至关重要的作用。

免疫检查点本是人体免疫系统中起保护作用的分子，起类似刹车的作用，防止t细胞过度激活导致的炎症损伤等。而肿瘤细胞利用人体免疫系统这一特性，通过过度表达免疫检查点分子，抑制人体免疫系统反应，逃脱人体免疫监视与杀伤，从而促进肿瘤细胞的生长。

目前临床上研究和应用最广泛的免疫检查点抑制剂包括ctla-4、pd1和pdl1单抗，通过抑制免疫检查点活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，重新激活t细胞对肿瘤的免疫应答效应，从而达到抗肿瘤的作用。

淋巴细胞上pd1的表达情况是临床检查、用药指导的重要标志物(biomarker)之一，目前市售的检测pd1的抗体有以下缺点：1.成本高，抗体的研发成本和生产成本较高；2.不灵敏，由于pd1抗体药物发展，高效灵敏的抗体，多用于开发治疗性药物；3.非特异结合，抗体本身易产生非特异结合，影响结果。4.检测结果难以统一，由于每个抗体的识别区不同，结合力不同，因此可能发生由于抗体不同而直接导致结果不同的现象发生。因此，急需开发稳定高效低廉的流式抗体替代品。

由于pdl1和pd1是天然存在的配体和受体，且以pdl1检测pd1能够最真实的反应可能受到免疫检查点影响的淋巴细胞的情况，但由于pdl1与pd1结合后，可以启动程序性死亡，因此简单的以pdl1作为检测pd1的方法尚不可行。

技术实现要素：

针对上述领域中的缺陷，提供一种融合蛋白，该蛋白既保证了pdl1与pd1的结合，又确保不会因为结合而引发程序性死亡。

同时本发明还提供该融合蛋白在检测pd1表达情况中的应用。与传统的抗体检测比较，具有效率高、成本低和更灵敏的优点，是一种快速、高效、精准的检测pd1的新方法。

一种融合蛋白，其特征在于由pdl1蛋白的结合区片段第18－132位氨基酸与gfp绿色荧光蛋白通过连接肽结合而得到。

所述连接肽序列为：ggggsggggsggggs、hhhhpggsvkkr、sapgtp、sapgtpsr或pg。

所述融合蛋白的氨基酸序列如seqidno：1所示。

pdl1-gfp:aftvtvpkdlyvveygsnmtieckfpvekqldlaalivywemedkniiqfvhgeedlkvqhssyrqrarllkdqlslgnaalqitdvklqdagvyrcmisyggadykritvkvnaggggsggggsggggsmskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttfgygvqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelyk

上述融合蛋白在检测细胞pd1表达情况中的应用。

本发明基于pd1和pdl1互作的三维立体结构，分析pdl1上参与结合的氨基酸区域为18位到132位氨基酸序列，将pdl1蛋白的结合区片段与gfp绿色荧光蛋白通过连接肽融合，实验表明，本发明的融合蛋白既保证了pdl1与pd1的结合，又确保不会因为结合而引发程序性死亡。

与传统的抗体检测比较，具有效率高、成本低和更灵敏的优点，是一种快速、高效、精准的检测pd1的新方法。

附图说明

图1pdl1与pd1互作的三维结构，

图2电泳分析pcr扩增结果，

其中1：pdl1^18-132；2：pd1全长；3：gfp；4：pet28a，

图3sds-page电泳分析蛋白表达结果，

图4质谱鉴定结果，

图5sds-page电泳分析蛋白表达及纯化结果，

其中1:空载体沉淀；2:pdl1-gfp蛋白沉淀；3:空载体上清；4:pdl1-gfp蛋白上清；5:流穿样品；6:washingbuffer洗脱样品；7:elutioni洗脱的前2ml；8:elutioni洗脱样品；9:elutionii洗脱样品

图6sds-page电泳分析蛋白表达及纯化结果，

1:空载体上清；2:pdl1-gfp蛋白上清；3:流穿样品；4、5:washingbuffer洗脱样品；6:elutionii洗脱的前2ml；7、8:elutionii洗脱样品；9:h2o洗脱样品，

图7sds-page电泳分析蛋白表达及纯化结果，

1:空载体上清；2:pdl1-gfp蛋白上清；3:流穿样品；4、5:washingbuffer洗脱样品；6:elutionii洗脱的前2ml；7、8:elutionii洗脱样品；9:h2o洗脱样品，

图8pdl1-gfp蛋白纯化(g25脱盐)，

图9sds-page电泳分析蛋白表达及纯化结果，

其中1－5:洗脱峰；6:纯化前蛋白

图10流式检测pbmc凋亡情况，

图11流式细胞仪检测pd1表达情况，

其中1－阴性对照，2－流式抗体，3－pdl1-gfp，

图12荧光显微镜观察细胞pd1表达情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

下述实验材料均为市售。

实施例1

实验方法：

1、pdl1上参与结合的区域结构分析

根据解析的pdl1和pd1互作时的三维结构(图1)，分析pdl1上参与结合的氨基酸区域为18位到132位氨基酸序列(框内)，其中红色标出的为结合位点。参与结合的氨基酸序列为¹⁸aftvtvpkdlyvveygsnmtieckfpvekqldlaalivywemedkniiqfvhgeedlkvqhssyrqrarllkdqlslgnaalqitdvklqdagvyrcmisyggadykritvkvna¹³²，标记为：pdl1^18-132。

pdl1-gfp融合蛋白氨基酸序列设计

pdl1-gfp:aftvtvpkdlyvveygsnmtieckfpvekqldlaalivywemedkniiqfvhgeedlkvqhssyrqrarllkdqlslgnaalqitdvklqdagvyrcmisyggadykritvkvna

ggggsggggsggggs(hhhhpggsvkkr)(sapgtp)(sapgtpsr)(pg)*

mskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttfgygvqc

farypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghk

leynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskd

pnekrdhmvllefvtaagithgmdelyk

*：()中的序列为下画线部分序列的替代序列，为连接肽

2、构建pdl1^18-132与gfp的融合蛋白

利用pcr反应，以cdna序列为模版，扩增pdl1^18-132及gfp序列

pcr体系如下：

pcr条件如下：

3、利用同源重组方法，将扩增的到的pdl1^18-132和gfp片段以及载体进行链接，标记为：pdl1-gfp，反应体系如下：

50℃孵育15min，冰上冷却1min，取2μl重组产物转入dh5α感受态细胞中，加入950μllb培养基37℃200rpm培养1h，取100μl涂布于含100μg/ml卡那霉素的lb的平板，37℃培养过夜。

4、阳性克隆转入rosetta(de3)感受态细胞中

测序正确的阳性克隆，保种并提取质粒，转入rosetta(de3)感受态细胞中。

5、蛋白诱导表达

1)接菌于5ml液体lb培养基(k抗性)中，37℃，220rpm培养12h后，将5ml培养液全部转入300ml液体lb培养基(k抗性)中，培养约3h，od600达到0.5，加入iptg终浓度可以为0.1-1.0mm，温度可以为16℃-30℃，培养过夜12h；

2)10000rpm离心10min收集菌体，沉淀溶于20mmtris-hclph8.2的缓冲液中，进行超声破碎(冰浴)，功率65％，时间5min，超3s停5s。超声后10000rpm离心20min，收集上清，沉淀用少量20mmtris-hclph8.2重悬；

3)sds-page分析蛋白表达情况。

6、蛋白纯化

1)ni柱以20mmtris-hcl冲洗5个柱体积后，上样，并收集流穿样品；

2)以5个柱体积的washingbuffer(20mmtris-hcl、100mm咪唑、500mmnacl)洗去杂蛋白收集样品；

3)以5个柱体积的elutonbufferi(20mmtris-hcl、250mm咪唑、500mmnacl)洗目的蛋白，收集样品；

4)以5个柱体积的elutonbufferii(20mmtris-hcl、500mm咪唑、500mmnacl)洗目的蛋白，收集样品；

5)sds-page分析各收集样品中的蛋白情况。

7、培养过程中pbmc凋亡的情况检测

1)pbmc处理：1000rpm离心5min，收集细胞，重悬于用0.5mlpbs洗一次，再以okm+5％fbs中，加入pdl1-gfp蛋白，终浓度为10μg/ml，37℃5％co2培养24h；

2)小心吸取pbmc，2000rpm离心10min；

3)以500μlpbs洗一次，2000rpm离心10min；

4)再以100μlpbs重悬细胞，分别加入7aad和annexinv进行单染，实验组同时加入7aad和annexinv进行双染，避光孵育30min；

5)加入1mlpbs，2000rpm离心10min；

6)再以1mlpbs洗一次，2000rpm离心10min，最后重悬于500μlpbs中备用。

实验结果：

1.pcr扩增pdl1^18-132及gfp片段

以h358的rna反转录的cdna为模板，分别扩增出pdl1^18-132片段和gfp片段，(图2)再与pet28a经同源重组进行链接，转入dh5α感受态细胞中，测序正确后，再转入rosetta(de3)中，进行表达；

2.pdl1-gfp蛋白提取

以pet28a转入rosetta(de3)的菌株为阴性对照，蛋白表达情况如图3所示，与载体相比，pdl1-gfp蛋白的上清和沉淀均有一条明显的表达带(图3箭头所指)，质谱鉴定结果如图4所示，表达的蛋白为pdl1片段。

3.pdl1-gfp蛋白纯化工艺优化

1)ni柱纯化

扩大培养体系，大量制备pdl1-gfp蛋白纯化后以进行后续实验；蛋白纯化结果如图5(泳道8和9)所示，箭头所示位置为pdl1-gfp蛋白，在洗脱液中，均能得到pdl1-gfp蛋白的粗纯品，但浓度较低；以超滤管进行浓缩后，蛋白如图6(泳道7和8)所示，虽然，目的蛋白pdl1-gfp的浓度增加，但其它杂带也显现出来，因此，需要改进纯化条件，以得到高质量的粗纯品。

2)阴离子交换柱纯化

阴离子交换柱对原核表达的pdl1-gfp进行进一步纯化，结果如图7所示(泳道7-9)，与图6相比，可以得到较纯的pdl1-gfp蛋白。

3)g25脱盐柱对离子交换对pdl1-gfp蛋白进行脱盐处理

g25脱盐柱对(2)中所得样品进行进一步纯化，结果如图8和图9所示(泳道1、2和4)，与纯化前图9(泳道6)相比，可以得到较纯的pdl1-gfp蛋白。

4.pdl1-gfp蛋白短期内不会引起pbmc的凋亡

pd1/pdl1——程序性死亡受体/程序性死亡配体，因其功能而得名，在肿瘤免疫微环境中，肿瘤细胞上的pdl1，通过结合淋巴细胞上pd1，进而影响淋巴细胞发挥功能，因此，以pdl1检测pd1的首要条件是不能引发细胞程序性死亡，导致细胞凋亡。体外的凋亡实验表明(图10)：没有任何处理的pbmc对照，早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例为2.2％；加入pdl1-gfp蛋白后24h时，早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例为2.1％，与对照组相似；48h后，pbmc早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例为2.2％，说明，pdl1-gfp蛋白在短期内，并不能引发pbmc的凋亡，可用于细胞pd1的检测。

5.pdl1-gfp蛋白检测pd1表达情况——流式细胞仪

分别以市售pdl1流式检测抗体(thermoscientific，pd-1monoclonalantibody，ma5-16134)和本文构建的pdl1-gfp对pbmc上的pd1表达情况进行检测，结果如图11所示，1为阴性对照，2为市售pdl1流式检测抗体，可以检测到pd1的存在，阳性比例为67.9％，3为pdl1-gfp检测到的pd1+细胞，比例为99.6％远高于流式体检测到的比例；两种方法的比较见表1，以pdl1-gfp检测pd1，具有成本低，效率高和灵敏度高等优点，因此是体外检测pd1的最佳方法。

表1不同方法检测pd1的比较

6.pdl1-gfp蛋白检测pd1表达情况——荧光显微镜

以pdl1-gfp蛋白对pbmc上的pd1表达情况进行检测，荧光显微镜下观察的结果如图12所示，绿色的pbmc即为表达pd1的细胞。

综上所述，与抗体检测方法比较，以pdl1-gfp可以通过流式检测以及荧光显微镜检测对pd1的表达情况进行分析，且具有成本低、速度快和灵敏度高的优点，因此，以pdl1-gfp检测pd1是行之有效的新方法。

序列表

<110>北京鼎成肽源生物技术有限公司

<120>一种基于蛋白互作用于检测细胞pd1表达情况的融合蛋白及其应用

<130>pp17072－dct

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>368

<212>prt

<213>programmedcelldeathprotein-1

<400>1

alaphethrvalthrvalprolysaspleutyrvalvalglutyrgly

151015

serasnmetthrileglucyslyspheprovalglulysglnleuasp

202530

leualaalaleuilevaltyrtrpglumetgluasplysasnileile

354045

glnphevalhisglyglugluaspleulysvalglnhissersertyr

505560

argglnargalaargleuleulysaspglnleuserleuglyasnala

65707580

alaleuglnilethraspvallysleuglnaspalaglyvaltyrarg

859095

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100105110

valasnalaglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglygly

115120125

glysermetserlysglyglugluleuphethrglyvalvalproile

130135140

leuvalgluleuaspglyaspvalasnglyhislyspheservalser

145150155160

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165170175

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180185190

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210215220

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245250255

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260265270

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275280285

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290295300

servalglnleualaasphistyrglnglnasnthrproileglyasp

305310315320

glyprovalleuleuproaspasnhistyrleuserthrglnserala

325330335

leuserlysaspproasnglulysargasphismetvalleuleuglu

340345350

phevalthralaalaglyilethrhisglymetaspgluleutyrlys

355360365