本发明属于分子生物学技术领域，涉及与产肠毒素大肠杆菌f4型仔猪腹泻抗性相关的snp标记、其检测方法和用途。
背景技术：
当前畜牧业生产，畜禽传染病已经不仅仅是畜牧业发展的制约因素，亦已成为人类食品安全乃至人类健康的严重威胁。药物和疫苗作为防治畜禽传染病的主要手段，虽然发挥了关键作用，但在药物防治同时，病原微生物抗药性和变异也在同时增强，使得疾病预防和药物治疗的难度越来越大。如何摆脱畜牧生产对药物的过度依赖，减少抗生素的使用，从本质上提高畜禽自身免疫力和抗病力已成为当前畜牧业发展重中之重的问题，通过开发和利用新的分子选育标记来提高仔猪抗腹泻性能也倍受重视。
仔猪腹泻是养猪生产中一种常见病和多发病，也是困扰规模化养猪生产的主要难题之一。引起仔猪腹泻的原因通常有大肠杆菌病、传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒感染等，其中，大肠杆菌是造成新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最主要病原体。目前国际上公认的致病性大肠杆菌有五种，即致病性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌和肠集聚性大肠杆菌。引起新生或断奶仔猪被感染后腹泻死亡的主要是产肠毒素型大肠杆菌（etec），造成的死亡率约占仔猪腹泻死亡率的11％。尤其是f4产肠毒素大肠杆菌是导致仔猪断奶前腹泻的主要病原。大量研究表明仔猪对大肠杆菌易感和抗性是由于仔猪小肠上皮有无大肠杆菌菌毛受体基因决定的，其本质是菌毛与小肠上皮表面受体之间的识别过程。如有受体，大肠杆菌可特异性黏附到小肠上，抵御肠道蠕动和肠液冲刷，定居于小肠，繁殖产生大量毒素，引起小肠内水、电解质失去平衡，导致腹泻。仔猪小肠黏附受体的有无可通过小肠上皮细胞体外黏附试验来检测。同时，肠道受体的有无是由常染色体上多基因决定的，具有完全的显隐性关系，隐形纯合子表现为无受体，对大肠杆菌具有抗性。因此，通过鉴别出大肠杆菌f4受体基因，应用于标记辅助选择，培育出具有f4大肠杆菌抗性的新品系，降低养猪生产中由仔猪腹泻导致的经济损失和提高肉产品安全有着非常重要的意义。
目前多数研究认为受体基因可能位于猪基因组（10.2版）13号染色体1mb区间内，但仍无法确定真正的关键基因及其因果变异位点，大肠杆菌f4抗性调控机制至今还无可靠定论。因此，因此难以直接应用于仔猪腹泻抗性选育。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术不足，腹泻抗性仔猪选育难，提供与产肠毒素大肠杆菌f4型仔猪腹泻抗性相关的snp标记。
本发明的另一个目的在于提供用于检测上述snp标记的引物和检测方法。
本发明的另一个目的在于提供上述snp标记的用途。
一种与产肠毒素大肠杆菌f4型仔猪腹泻抗性相关的snp标记，所述snp标记位于猪猪13号染色体上的整合素受体蛋白itgb5基因的核苷酸序列上，所述snp标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪13号染色体上g.145109683核苷酸位点，且具有为c/t多态性，所述snp标记与产肠毒素大肠杆菌f4型仔猪腹泻抗性极显著相关。g.145109683位点具有tt基因型的仔猪腹泻抗性显著高于具有cc基因型的仔猪。
一种基于本发明所述的snp开发分子标记的方法，以含有本发明所述的snp标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以猪基因组dna为模板进行pcr扩增，使本发明所述的snp标记转化为分子标记。
其中，所述的引物对序列为上游引物：seqidno：2，下游引物：seqidno：3；所述的分子标记序列如seqidno：1所示，所述的snp位点位于第194位，存在c/t多态性。
按照本发明上述方法得到的分子标记。
所述的分子标记优选序列如seqidno：1所示，所述的snp位点位于第194位，存在c/t多态性。
一种用于检测所述的snp标记的引物对，上游引物为：seqidno：2，下游引物为：seqidno：3。
一种检测本发明所述的snp标记的方法，包含pcr扩增猪基因组中含有本发明所述的snp标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的c/t多态性。
所述的检测本发明所述的snp标记的方法，优选包括以下步骤：
(1)取一头长白猪的耳组织样品并提取总dna；
(2)用已提取的猪基因组dna为模板，使用所述的引物进行pcr扩增；
(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seqidno：1第194位的c/t多态性。
其中，步骤（2）所述的pcr扩增反应体系为：dna模板1.0μl、seqidno：2和seqidno：3所示的引物各1.0μl、taq酶试剂0.125μl、双蒸水17.38μl；其中所述dna模板浓度为50ng/μl，所述引物的浓度为10mol/l，所述taq酶为大连takara生物科技有限公司的试剂；pcr扩增的反应程序为：预变性95℃1min；变性95℃10s；退火60℃30s，延伸72℃30s，34个循环；延伸72℃5min。
本发明所述的snp标记、所述的分子标记、所述的引物在筛选产肠毒素大肠杆菌f4型仔猪腹泻抗性品系中的应用。
一种筛选产肠毒素大肠杆菌f4型仔猪腹泻抗性品系的方法，包括检测仔猪g.145109683核苷酸位点的基因型，选育g.145109683核苷酸位点的tt型个体作为种猪。
有益效果：
本发明提供的snp标记与产肠毒素大肠杆菌f4型仔猪腹泻抗性相关，因此，可以通过鉴定该snp标记来筛选仔猪腹泻抗性品系，所得的腹泻抗性相关品系具有重要的经济效益与社会价值。
附图说明
图1为仔猪腹泻大肠杆菌f4受体全基因组关联分析的染色体水平显著snp标记结果。其中，猪18条常染色体及x染色体信息标识于x轴。
图2为使用本发明的引物扩增itgb5基因的电泳图。
图3为itgb5基因的突变位点不同基因型的dna测序结果峰图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
1、实验动物来源
采自中国农业科学院昌平实验猪场。
长白猪79头，大白猪203头，松辽黑猪86头，其中包括301头仔猪，共348头。
2、粘附表型测定
35日龄后屠宰采集小肠上皮组织进行大肠杆菌f4的粘附实验，分为粘附和不粘附两种类型。
3、提取基因组dna
采集猪耳组织样品，放置于装有70%酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。
使用动物血液/组织基因组dna提取试剂盒提取基因组dna，所需试剂包括：
裂解液实验室配备
蛋白酶k（德国merck生物科技有限公司）
血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒：北京天根生物科技公司（tiangen）
dntpmixture(2.5mmeach)：宝生物工程(大连)有限公司
10×pcrbuffer：宝生物工程(大连)有限公司
taq(5units/μl)：宝生物工程(大连)有限公司
dnamarker（dl2000，dl1000）：宝生物工程(大连)有限公司
6×loadingbuffer：宝生物工程(大连)有限公司
琼脂糖：gene有限公司
tae(50×)溶液：北京百泰克生物技术有限公司
具体步骤如下所述：
（1）取30mg左右耳组织于离心管中，剪碎，加200μl缓冲液ga，震荡。
（2）加入20μlproteinasek溶液，震荡混匀，放置于56℃水浴锅中消化过夜。
（3）加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，离心30s。
（4）加人200μl无水乙醇，振荡混匀15s，离心30s。
（5）所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中12000rpm(~13400×g)离心30s，倒掉废液。
（6）加入500μl缓冲液gd，12000rpm(~13400×g)离心30s，倒掉废液。
（7）向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm(~13400×g)离30s，倒掉废液。
（8）重复步骤7。
（9）12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于55℃烘箱20min。
（10）将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μlddh2o，室温放置20min，12000rpm(~13400×g)离心2min。
（11）测定浓度，经过nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μl于-20℃下保存备用。
3、猪基因组6万个（60k）snp基因型检测
上述个体的dna在illuminabeadstation平台上根据公司标准流程进行猪全基因组基因型判定。采用高密度porcinesnp60beadchip芯片（illuminacompany,usa）对资源群体301个有粘附表型记录的仔猪个体进行snp基因型检测。通过对62,163个snp标记检测结果进行质控分析，得到50,483个有效snp标记的基因型。利用拟似然打分检验统计方法，检测到15个基因组水平显著snps集中猪13号染色体上一个2.6mb区间内（图1）。
实施例2
本实施例为实施例1中得到的snp位点g.145109683c/t在长白、大白猪、松辽黑猪群体内的验证。
1、提取猪基因组dna
采集具有黏附记录的资源群体三个品种猪耳组织样品，放置于装有70%酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。利用上述方法提取猪耳组织基因组dna，经过质量、浓度检测后将浓度稀释到50ng/μl于-20℃下保存备用。
2、目的片段pcr扩增与测序
用已提取猪dna为模板，根据所设计的引物，进行pcr扩增：pcr扩增反应体系为：dna模板1.0μl、seqidno：2和seqidno：3所示的引物各1.0μl、taq酶试剂0.125μl、双蒸水17.38μl；；pcr扩增的反应程序为：预变性95℃1min；变性95℃10s；退火60℃30s，延伸72℃30s，34个循环；延伸72℃5min。
pcr产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小为360bp，电泳图见图2，将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用dnaman软件与genbank中猪itgb5基因片段序列比对、分析，判读g.145109683c/t基因型（参见图3），利用sas9.4软件的卡方检验模块，进行snp基因型和黏附表型性状的单标记关联分析。
表1给出了g.145109683c/t突变位点在资源群体中对粘附性状的影响效应。由表1可知，snp位点(g.145109683c/t)cc基因型个体与tt型个体相比较：tt型个体非黏附比例显著的高。由此可见，在种猪选留中，继代选育g.145109683c/t位点的tt型个体，均可逐步猪群的f4大肠杆菌腹泻抗性，达到猪群整体抗f4大肠杆菌腹泻感染的目的。
表1、snp位点(g.145109683c/t)与大肠杆菌f4粘附表型性状的关联分析
<110>南京农业大学
<120>一种与产肠毒素大肠杆菌f4型仔猪腹泻抗性相关的snp标记及检测方法
<160>3
<210>1
<211>360
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(121~300)
<223>n=a或g或c或t
<220>
<223>含g.145109683核苷酸位点的分子标记
<400>1
ggtctcccctatacagttcctcagttagcagctgccaggggcagatgctttcacaggtga1
tggcttcctgagtgctcgttcaagccaggcgctcgagtctcagtttaccggacatgttac120
agcctcaacttttgccttgtccccaggactatccatcccttgccttgcttggagagaagc180
tggcagagaacaacatcaacctcatctttgcagtgacaaaaggccattatatgctctaca240
aggtacacttggagggagtgagggaggctggtggcctgaatctgggggctgtgctgaccc300
gaaggtgaatgggagattagaacgtggggtcgggcaaagcatgggaggcagggtgagggg360
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物
<400>2
ggtctcccctatacagttcctca23
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220><223>下游引物
<400>3
cgaccccacgttctaatctc20