本发明涉及一组鉴定水蛭的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定领域。
背景技术：
水蛭俗称蚂蟥，为常用动物药材，2015年版《中国药典》规定水蛭为蚂蟥(whitmaniapigrawhitman)、水蛭(hirudonipponicawhitman)和柳叶蚂蟥(whitmaniaacranulatawhitman)的干燥全体。该中药始载于《神农本草经》，味咸、平，有破血、通经、逐淤的功效，目前临床主要用于治疗微痕积聚、血滞经闭、跌打损伤等。在中药材市场上，水蛭的主要来源为蚂蟥，另有少量的水蛭。随着近年来水蛭的中药制剂的不断开发，水蛭的市场需求增加，导致资源供应短缺，因此水蛭成为了世界性的紧俏药材之一。由于不同品种的水蛭在药理作用上存有差别，以及混伪品、掺伪品在药材市场的流通，严重影响了临床用药的安全与疗效。目前，水蛭的鉴别主要依靠传统的性状鉴别，依赖性强，准确性存疑；此外，经过炮制加工后的药材在形态上难以分辨，因此仅依赖性状鉴别不足以规范水蛭药材的来源。
dna条形码技术是利用基因组中一段公认标准短序列来进行物种鉴定的一种分子诊断新技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。目前，水蛭的dna条形码研究主要是基于coi、its、12srrna等序列进行的，其中以coi序列最为常见。如有研究者利用水蛭的coi序列对水蛭进行dna分子鉴定研究，即提取水蛭样品的dna，利用coi通用引物进行pcr扩增，将扩增产物进行测序后，构建n-j聚类分析树，实现了水蛭样品的分类，此类方法操作繁琐耗时费力，仅能够用于检验已知水蛭种类的样品，对未知品种的水蛭则需要与数据库中的序列进行比对确定，而且无法检识掺伪品，难以应用。
技术实现要素：
为了克服背景中的问题，本发明针对水蛭正品以及常见伪品的物种设计特异性引物，并提供了利用特异性引物扩增技术鉴别水蛭的新方法。该方法操作简单，无需测序，鉴别快速，能准确直观的实现水蛭真伪的鉴定。本发明为水蛭的鉴别提供一条新的途径，有助于监控水蛭药材的质量，从而为临床用药的安全和疗效提供保障，具有极高的应用价值。
本发明通过以下步骤达到快速鉴定水蛭真伪的目的：
本发明首先提供一组用于鉴定水蛭的特异性引物，所述引物对为pw或phn，具体如下所示：
pw上下游引物分别为：
pw-f：aagattccttggagacgacc
pw-r：attataaccaacccatgagcc
phn上下游引物分别为：
phn-f：ccaggtakatttctaggggat
phn-r：cccrccaatcaaaataggta
所述引物对pw或phn来自于水蛭(hirudonipponicawhitman)，并且同样能达到鉴定水蛭的目的。
所述用于鉴定水蛭的特异性引物还包括引物对pp，具体如下所示：
pp上下游引物分别为：
pp-f：ctttaattactgcacatggac
pp-r：aattaccaaacccaccgat
所述各引物序列详细信息如下：
本发明还提供一种特异性鉴定水蛭的试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物pw或phn引物对、dna阳性对照、pcr反应体系、电泳检测体系。
在上述特异性引物鉴定过程中，若受试样品为完整的水蛭个体且结果显示为阳性，则判断为正品水蛭，若受试样品为水蛭段或粉末，即为非完整的水蛭个体且结果显示为阳性，则需进一步鉴定是否为掺伪品(含有伪品菲牛蛭)，因此试剂盒还包括特异性引物pp引物对。
本发明还提供一种特异性鉴定水蛭的方法，首先制备dna供试品溶液，随后利用pcr及琼脂糖凝胶电泳技术快速检测目标片段。
其中供试品溶液的制备方法按照下述步骤进行：
(1)将水蛭产品粉碎，40目过筛，收集细粉，加入适量的sds裂解液和蛋白酶k(料液比：50～200:1mg/ml)，充分混匀，于56℃孵浴提取6h，离心后取上清液；
(2)加入与上清液等体积tris-平衡酚，充分混合，离心后取上清液，加入与上清液等量的tris-平衡酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)，充分混合，离心后取上清液；
(3)加入与上清液等量三氯甲烷-异戊醇(24:1)，充分混合，离心后取上清液，再加入上清液1/10倍量5m乙酸钾溶液和等量预冷的异丙醇，充分混合，-20℃冷冻过夜，离心后弃去上清液；
(4)加入预冷的70％乙醇500μl洗涤沉淀，离心后弃去上清液，沉淀物于室温下晾干或冻干，用适量te缓冲液溶解，-20℃或4℃下保存，备用。
一组特异性引物鉴定水蛭的方法，检测方法按照下述步骤进行：
(1)以制备的dna供试品溶液为反应模板，配制pcr反应体系，设置扩增程序，进行pcr扩增；
(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，于凝胶成像分析系统判定结果。
其中，步骤(1)中所述的pcr反应体系，以总体积25μl为例，包括：1×pcr缓冲液、2.0mmol/lmgcl2、0.2mmol/ldntps、0.1μmol/l～0.2μmol/l引物对、0.625utaqdna聚合酶、模板dna100ng，加灭菌双蒸水补足至25μl。
步骤(1)中所述的pcr扩增程序为：95℃3min；95℃30s，50℃～62℃10s～30s，72℃1min，循环数35；72℃，5min～7min。
步骤(2)中所述的电泳检测是指扩增产物采用含荧光染料eb的2％～3％琼脂糖凝胶进行分析后以凝胶成像系统检测，制胶及电泳的缓冲液均为tbe，上样量为10μl。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明的制备方法以sds裂解液和蛋白酶k为提取溶剂，用恒温混匀仪孵浴，从水蛭产品中提取dna，然后以酚仿法进行纯化，该方法与柱纯化相比，大大降低了成本，样品用量范围更加灵活，也扩大了适用范围。
(2)本发明的通过特异性引物鉴定水蛭的方法与传统的基于coi、its序列等的dna条形码鉴定技术相比，不需要扩增完测序的繁琐步骤，直接查看目的条带的位置就能够判断物种，并且能够检识掺伪品，结果直观准确，操作方便快捷，经济高效。
附图说明
图1是引物pw特异性验证的电泳结果图。
图2是引物pw对7批市售蚂蟥样品检测电泳结果图。
图3是引物phn特异性验证的电泳结果图。
图4是引物phn对5批市售水蛭样品检测电泳结果图。
图5是引物pp特异性验证的电泳结果图。
图6是引物pp对5批市售菲牛蛭样品检测电泳结果图。
图7是自制水蛭掺伪品检测电泳结果图。
图中，b：标准品121061-201305(蚂蟥)；k：蚂蟥(宽体金线蛭)样品；j：柳叶蚂蟥(尖细金线蛭)样品；f：菲牛蛭样品；r：水蛭(日本医蛭)样品；m：mark；n：阴性对照；数字代表不同批次。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式进一步描述。
本发明中涉及到的检测样品材料均来自市售。
本发明中涉及各样品分别为：b：标准品121061-201305(蚂蟥)；j：柳叶蚂蟥(尖细金线蛭)样品，来自安徽亳州；f：菲牛蛭样品，来自广东东莞；r：水蛭(日本医蛭)样品，来自辽宁；k：蚂蟥(宽体金线蛭)样品；n：阴性对照；m：mark。
7批市售蚂蟥样品中：1、2均来自江苏宿迁，3来自山东德州，4来自广西，5来自浙江；柳叶蚂蟥1、2均来自安徽亳州。
5批市售水蛭样品中：1、2均来自辽宁，3来自重庆，4来自山东，5来自湖南。
5批市售菲牛蛭样品中：1来自广东东莞，2、4、5均来自广西，3来自广西钦州。
实施例1：水蛭试剂盒特异性引物的设计及验证
(1)试剂
十二烷基硫酸钠、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙二胺四乙酸二钠、蛋白酶k(20mg/ml，sigma-aldrich，p6556)、tris平衡酚(
(2)方法
a.异性引物的设计
根据genebank中公开的水蛭正品(包括蚂蟥(whitmaniapigrawhitman)、柳叶蚂蟥(whitmaniaacranulatawhitman)和水蛭(hirudonipponicawhitman))及伪品菲牛蛭的基因差异，设计特异性引物，如上述表格所示，由上海生工有限公司合成。
b.引物特异性验证
将水蛭基原或药材样品(包括其常见伪品菲牛蛭)粉碎，称取40目以下粉末10mg，加入995μl的sds裂解液和5μl蛋白酶k，涡旋混匀，56℃下于恒温混匀仪(拓普森科学仪器有限公司)600rpm提取6h，离心取上清液；依次将与上清液等体积的tris平衡酚、酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)、三氯甲烷-异戊醇(24:1)分别与上清液混合，离心取上清液；在上清液中加入上清液体积0.1倍量的5m乙酸钾溶液和上清液等体积的预冷异丙醇，混合，置-20℃过夜，离心后弃去上清液；加入500μl预冷的70％乙醇洗涤沉淀，离心弃上清；室温晾干或冻干，以适量te缓冲液溶解，得到基因组dna供试品溶液，质量检查，-20℃或4℃下保存，备用。
配制pcr反应体系：1×pcr缓冲液，2.0mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntps，0.1-0.2μmol/l引物对，0.625utaqdna聚合酶，模板dna100ng，加灭菌双蒸水补足至25μl。离心后，置于pcr仪(2720@appliedbiosystems)进行扩增，反应条件：95℃3min；95℃30s，57℃或55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min。10μl扩增产物采用含eb的2-3％琼脂糖凝胶进行分析。电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据各电泳条带的有无及亮度、分子量大小以筛选特异性引物。
结果如图1、3、5所示，图1中模板dna为100mg，引物浓度0.1μmol/l，退火温度57℃；图3中模板dna为100mg，引物浓度0.2μmol/l，退火温度55℃；图5中模板dna为100mg，引物浓度0.2μmol/l，退火温度57℃。由图可见，各特异性引物对其相应物种进行扩增分析结果均有明亮的条带，其分子量与预期扩增的目的片段长度相一致。
实施例2：本发明的特异性引物对市售水蛭样品的检测
将不同批次市售水蛭样品(包括伪品菲牛蛭)粉碎，称取40目以下粉末10mg，通过sds法进行提取纯化及质量检查，得到dna供试品溶液，具体操作如下：
(1)将水蛭产品粉碎，40目过筛，收集细粉，加入适量的sds裂解液和蛋白酶k(料液比：50～200:1mg/ml)，充分混匀，于56℃孵浴提取6h，离心后取上清液；
(2)加入与上清液等体积tris-平衡酚，充分混合，离心后取上清液，加入与上清液等量的tris-平衡酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)，充分混合，离心后取上清液；
(3)加入与上清液等量三氯甲烷-异戊醇(24:1)，充分混合，离心后取上清液，再加入上清液1/10倍量5m乙酸钾溶液和等量预冷的异丙醇，充分混合，-20℃冷冻过夜，离心后弃去上清液；
(4)加入预冷的70％乙醇500μl洗涤沉淀，离心后弃去上清液，沉淀物于室温下晾干或冻干，用适量te缓冲液溶解，-20℃或4℃下保存，备用。
此后，配制pcr反应体系，将其置pcr仪按实施例1中的条件进行扩增。随后，将10μl扩增产物采用含eb的2-3％琼脂糖凝胶及tbe缓冲液进行分析，电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据电泳条带的有无以及分子量大小以判定水蛭的真伪，此外，蚂蟥、柳叶蚂蟥或水蛭的阳性对照物质通过分别称取40目以下基原样品粉末10mg，通过sds法进行提取纯化及质量检查后，冻干制备dna阳性对照物质，并注明其中dna的质量。
结果如图2、4、6所示，各批次样品的dna通过水蛭试剂盒引物检测后，样品中正品蚂蟥和柳叶蚂蟥及水蛭的dna通过特异性引物进行扩增后在分别在63bp、102bp处产生条带；其常见混伪品菲牛蛭则在75bp处产生条带，而且与正品蚂蟥和柳叶蚂蟥及水蛭的特异性引物无交叉反应，体现出了很强的专属性。表明该试剂盒能够很好的完成对水蛭品种的鉴定。
实施例3：水蛭试剂盒对自制掺伪品的检测
用预先粉碎的正品水蛭及伪品菲牛蛭样品按5种不同的比例(9:1、7:3、1:1、3:7、1:9)混合制备水蛭掺伪品，每个样品的终质量为20mg。然后通过sds法进行提取纯化，按照实施例2的方法进行分析。
如图7所示，5种不同比例的进行混合的水蛭掺伪品由相应物种的特异性引物扩增分析，其条带位置与预期扩增的目的片段长度相一致，表明特异性引物能鉴定出掺伪品中的相应物种。
序列表
<110>江苏大学
<120>一组鉴定水蛭的特异性引物及其鉴定方法
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>水蛭(hirudonipponica)
<400>1
aagattccttggagacgacc20
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>水蛭(hirudonipponica)
<400>2
attataaccaacccatgagcc21
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>水蛭(hirudonipponica)
<400>3
ccaggtakatttctaggggat21
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>水蛭(hirudonipponica)
<400>4
cccrccaatcaaaataggta20
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>菲牛蛭(poecilobdella)
<400>5
ctttaattactgcacatggac21
<210>6
<211>19
<212>dna
<213>菲牛蛭(poecilobdella)
<400>6
aattaccaaacccaccgat19