本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测引物及方法。
背景技术：
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)是1985年开始出现的一项体外扩增核酸片段的基因检测技术，由于pcr技术简单易行、灵敏度高等优点，在临床研究和动植物病原菌检测等方面广泛应用，成为分子生物学必不可少的工具。但普通pcr反应结果需要进行凝胶电泳分析，不能实时监测；且在许多情况下，只得知某一特异dna序列是否存在，已经不能完全满足研究和实际工作的需要，因而，借助pcr技术对基因进行快速、敏感、特异而准确的定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。实时荧光定量pcr(rel-timequantitationpolymerasechainreaction，real-timepcr)技术不仅实现了pcr从定性到定量的飞跃，还以其快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、全封闭反应、可实时监测等优点成为了分子生物研究中的重要工具，目前已得到广发应用。近年来，黑斑病(walnutblight)在多地连年发生，且分布广泛，影响核桃产业的健康发展。传统核桃细菌性黑斑病的诊断鉴定是依据症状和病原菌培养特征作出判断，然而症状判断易导致错判，且病原菌分离培养操作繁琐、还需较长生长周期，往往影响及时准确的防治。所以急需找到一种能快速、准确、高效的分子生物学检测方法以实现对处于潜育期的病害进行早期诊断，以便及时做好预防和控制，为核桃黑斑病的早期防治提供技术支持。
综上所述，现有技术存在的问题是：传统的病原菌检测方法往往不够准确、操作繁琐且需要较长周期，影响及时准确的防治。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测引物及方法。
由于近年来国内外研究者广泛将pcr技术应用于对植物病原菌的检测，但到目前为止，国内外对核桃黑斑病的研究主要集中在其发病规律和防治措施等方面，未出现用pcr特异性检测引物对其进行特异性扩增的相关研究。故本发明是这样实现的，设计一种核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测引物，所述核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测引物的序列为：seqidno：1和seqidno：2。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测引物建立的核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测体系，所述核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测体系为：
进一步，所述核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测体系的反应参数为：95℃预变性3min；95℃变性10s，59.0℃退火30s，72℃延伸30s；40个循环；95℃10s；以0.5℃/5s的速率从65℃升温至95℃绘制溶解曲线。
本发明的另一目的在于提供一种所述核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测引物建立的核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测方法，所述核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测方法包括以下步骤：
步骤一，采用核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系扩增核桃黑斑病菌x.campestrispv.的特异性基因序列，利用
步骤二，通过设计核桃黑斑病菌x.campestrispv.的特异性引物，引发特异性扩增，通过荧光信号的收集处理，获得特异性扩增曲线。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测引物检测核桃黑斑病菌。
本发明可检测出来自植物组织样本的微量cdna(rna)，完全区分核桃黑斑病菌x.campestrispv.与核桃植物上存在的其他细菌，检测灵敏度高，方法快捷，易操作。本发明具有很好的重复性，每次对疑似核桃黑斑病组织进行检测时，不需要进行繁琐的病原菌分离培养，也不需要等待超过一周的病原菌生长周期，只需按照总rna提取试剂盒提取出待测组织总rna，参照takara反转录试剂盒将其反转录成cdna，用细菌通用引物细菌通用引物27f(5′-gagagtttgatcctggctcag-3′)和1492r(5′-tacggctaccttgttacgac-3′)对其进行普通pcr扩增验证cdna质量后，便可进行实时荧光pcr扩增，反应体系为：
附图说明
图1是本发明实施例提供的核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测方法流程图。
图2是本发明实施例提供的菌种鉴定及序列比对示意图。
图3是本发明实施例提供的引物的特异性分析，引物pcr扩增的电泳检测结果示意图；
图中：m为dl2000marker；ck空白对照为rnasefreeh2o；1-5为分离自不同地区的核桃黑斑病菌x.campestrispv；6-7为分离自核桃植株附近土壤的细菌，8-23为分离自不同地区的核桃植株上的其他细菌。
图4是本发明实施例提供的核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr的溶解曲线检测结果示意图；
图中：1-5为1-5为分离自不同地区的核桃黑斑病菌x.campestrispv.；ck空白对照为rnasefreeh2o。
图5是本发明实施例提供的核桃黑斑病菌x.campestrispv.与其他核桃植株相关细菌的实时荧光pcr特异性检测结果示意图；
图中：1-5为分离自不同地区的核桃黑斑病菌x.campestrispv；6-23为分离自不同地区的核桃植株上的其他细菌及分离自核桃植株附近土壤的细菌；ck空白对照为rnasefreeh2o。
图6是本发明实施例提供的灵敏度分析结果示意图；
图中：1-8分别对应以7.0μg/ml、7.0×10-1μg/ml、7.0×10-2μg/ml、7.0×10-3μg/ml、7.0×10-4μg/ml、7.0×10-5μg/ml、7.0×10-6μg/ml、7.0×10-7μg/ml8个浓度的cdna模板分别进行实时荧光pcr特异性扩增，获得的特异性扩增曲线结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实时荧光pcr是dna技术鉴定中快捷高效的技术之一，指在dna扩增反应中，通过荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法，利用实时荧光pcr对核桃黑斑病菌x.campestrispv.进行菌种识别，以实现对核桃黑斑病进行快速检测，对核桃产业的健康发展具有重要意义。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测引物为：seqidno：1和seqidno：2。
seqidno：1上游引物xc-f：5′-tacccgattgttctgacg-3′。
seqidno：2下游引物xc-r：5′-attccgctaccctctaccac-3′。
核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系还包括由其他试剂所组成的反应体系如表1：
表1核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系的反应体系
其中，
核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系的反应参数如下表：
表2核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测体系的反应参数
对所述的核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系的应用，利用
如图1所示，本发明实施例提供的核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测方法包括以下步骤：
s101：采用核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系扩增核桃黑斑病菌x.campestrispv.的特异性基因序列，利用
s102：通过设计核桃黑斑病菌x.campestrispv.的特异性引物，引发特异性扩增，通过荧光信号的收集处理，获得特异性扩增曲线。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1荧光pcr特异性检测引物序列的设计
1.核桃黑斑病菌x.campestrispv.鉴定及序列比对
在核桃黑斑病发病时期进行野外采样，实验室分离培养，纯化出核桃黑斑病病原菌，再培养该菌的菌悬液，利用细菌dna提取试剂盒提取其总dna，取5.0μl总dna于1％的琼脂糖凝胶电泳检测总dna质量。以该菌总dna为模板，选择细菌通用引物27f(5′-gagagtttgatcctggctcag-3′)和1492r(5′-tacggctaccttgttacgac-3′)对其进行普通pcr扩增，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后委托生物公司进行pcr产物纯化和测序。利用在线软件ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的blast进行序列比对，结果如图2所示，确定该菌为核桃黑斑病菌xanthomonascampestrispv.juglandis。
2.核桃黑斑病菌x.campestrispv.特异性检测引物的设计
根据所得核桃黑斑病菌x.campestrispv.基因序列，采用primer5.0和oligo6.0软件设计引物并委托生物公司合成。
3.核桃黑斑病菌x.campestrispv.特异性检测引物的合成及特异性分析
在生物公司合成的核桃黑斑病菌x.campestrispv.特异性检测引物1对，其序列为：
上游引物xc-f：5′-tacccgattgttctgacg-3′；
下游引物xc-r：5′-attccgctaccctctaccac-3′；
用此特异性引物pcr扩增核桃黑斑病菌x.campestrispv.，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后委托生物公司进行pcr产物纯化和测序，所得序列与上一步鉴定测序所得序列吻合，长度为211bp，与预期结果一致，证明引物特异性良好。
4.核桃黑斑病菌x.campestrispv.总rna的提取
采用细菌总rna提取试剂盒提取核桃黑斑病菌x.campestrispv.的总rna，取5.0μl总rna于1％的琼脂糖凝胶电泳检测总rna质量，用紫外分光光度计nd2000c检测出模板rna的浓度为7.0μg/ml。
5.核桃黑斑病菌x.campestrispv.特异性目的片段验证测序
琼脂糖凝胶电泳检测：参照takara反转录试剂盒说明书将总rna样品转录成cdna模板，以合成的核桃黑斑病菌x.campestrispv.的特异性引物pcr扩增核桃黑斑病菌x.campestrispv.后，pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，委托生物公司进行pcr产物纯化和测序，电泳显示结果(如图3所示)，经琼脂糖凝胶电泳检测后会分别产生211bp的特异性电泳条带，电泳效果最好，pcr扩增效率最高。
6.序列验证：测序结果采用ncbi的blast程序通过序列比对进行验证，验证结果显示所测片段为特异性目的片段。
实施例2实施荧光pcr特异性检测体系的应用
核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系的应用，即利用核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系扩增核桃黑斑病菌x.campestrispv.的特异性目的片段，对核桃黑斑病菌x.campestrispv.进行实时荧光pcr特异性检测，其具体步骤如下：
表3核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系的反应体系
核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系的反应参数如下表4：
表4核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系的反应参数
采用核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测组合物进行实时荧光pcr扩增核桃黑斑病菌x.campestrispv.的特异性目的片段时，以
实施例3特异性检测
利用核桃黑斑病菌x.campestrispv.实时荧光pcr特异性检测体系进行核桃植株上相关细菌样品检测，采用rna提取试剂盒提取各待测样品的模板rna，用反转录试剂盒将模板rna分别反转录成模板cdna，用细菌通用引物进行普通pcr扩增验证模板cdna。再分别按照上述步骤4所述反应体系及反应参数进行实时荧光pcr扩增，产生的30个循环以下的特异性扩增曲线即为核桃黑斑病菌x.campestrispv.，其他样品在30个循环以后出现扩增曲线或没有扩增曲线，此方法可以准确的对桃黑斑病菌x.campestrispv.进行鉴定，具有极好的特异性，如图5所示。
实施例4灵敏度检测
采用rna提取试剂盒提取阳性样品的模板rna，用紫外分光光度计nd2000c检测所提取模板rna浓度，用反转录试剂盒将模板rna反转录成模板cdna，并进行等浓度梯度稀释，制备成7.0μg/ml、7.0×10-1μg/ml、7.0×10-2μg/ml、7.0×10-3μg/ml、7.0×10-4μg/ml、7.0×10-5μg/ml、7.0×10-6μg/ml、7.0×10-7μg/ml8个浓度梯度样品(分别与图6中的1-8对应)，分别按照上述步骤3中所述反应体系及反应参数进行实时荧光pcr扩增，以确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图6所示，所产生特异性扩增曲线即为核桃黑斑病菌x.campestrispv.，当浓度≥7.0×10-5μg/ml时，均可以特异性扩增，即该标准方法的检测灵敏度为7.0×10-5μg/ml。此方法可以准确的对核桃黑斑病菌x.campestrispv.进行鉴定，具有很好的灵敏度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>四川农业大学
<120>一种核桃黑斑病菌实时荧光pcr特异性检测引物及方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tacccgattgttctgacg18
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
attccgctaccctctaccac20