一种抗血管内皮生长因子抗体及与铁调素的融合蛋白的制作方法

本发明公开了一种单链抗体及与铁调素的融合蛋白，属于免疫学和分子生物学领域。

背景技术：

肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。肿瘤的形成和发展具有非常复杂的调节机制，有非常多的生物效应分子参与其中，明晰这些生物效应分子的作用机制，对于肿瘤疾病的预防和治疗具有重要的意义。现有技术业已发现血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)和铁调素均不同程度地涉及了肿瘤的形成和发展进程的调控。vegf，早期亦称作血管通透因子(vascularpermeabilityfactor，vpf)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子(heparin-bindinggrowthfactor)，可在体内诱导血管新生。vegf是高度保守的同源二聚体糖蛋白，两条分子量各为24kda的单链以二硫键组成二聚体。vegf分解的单体无活性,去除n2糖基对生物效应无影响,但可能在细胞分泌中起作用。由于mrna不同的剪切方式，产生出vegf121、vegf145、vegf165、vegf185、vegf206等至少5种蛋白形式，其中vegf121、vegf145、vegf165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。2004年2月26日，第一个通过抑制vegf作用机制的肿瘤治疗药物阿瓦斯汀获得fda的批准，其是针对vegf的人源化单克隆抗体。

铁(fe)是体内含量最丰富的微量金属元素，也是人体生命能量转化的关键酶---血红素酶复合体中起电子传递作用的金属元素。此外，其在人体中分布很广，几乎所有的组织都含有铁，与健康有着密切的关系。铁离子具有调节细胞微环境的功能，铁离子降低会导致贫血，铁离子升高会引发细胞的氧化应激反应，导致细胞功能障碍或死亡。铁调素(gh)在调节细胞内外铁离子平衡中起到重要的作用。研究发现，肝癌细胞内铁离子浓度低，和周围正常组织以及正常肝细胞相比，肝癌细胞内铁调节基因表达下降，肿瘤细胞表面转铁蛋白受体表达量增高，使得肿瘤细胞内的铁离子向细胞外流出，肿瘤细胞处于一种低水平铁离子耐受状态。尽管现有技术已经发现了vegf和铁调素在肿瘤调控中的重要角色，但是目前还缺乏将其应用于肿瘤治疗和预防药物的具体技术手段，这也是在肿瘤药物制备领域一个需要解决的技术问题。

传统的治疗肿瘤的方法是手术或者放、化疗。随着近年生物制药技术的发展，一批优质的抗肿瘤抗体药物的问世，使得一些难治性肿瘤的生存率大大提高。抗体药物已作为肿瘤患者常规的治疗药物之一，预计2020年，单抗药物的销售额将达到2000亿美元。自从1984年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体(fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等)、多价小分子抗体(双链抗体，三链抗体，微型抗体)、某些特殊类型抗体(双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体)及抗体融合蛋白(免疫毒素、免疫粘连素)等等。另外，用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术成为继杂交瘤技术之后生命科学研究中又一突破性进展。

对于血液性肿瘤，全分子抗体药物具有一定的技术优势，它们可以激活补体和免疫细胞将血液中游走的肿瘤细胞杀死。但是对于实体肿瘤，由于全分子抗体药物分子量大，进入不到实体瘤内部，它们的抗肿瘤效果不甚理想，而小分子抗体却可以轻松进入实体瘤内部发挥抗肿瘤作用。未来的抗体药物将以小分子抗体药物为主。小分子抗体药物尤其对中国来说更为必须，因为在中国多发的肺癌、肝癌和消化道系统肿瘤中绝大多数都是实体性肿瘤。中国男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。而在肺癌中也有些是死亡率非常高的转移性肿瘤，如肺癌的脑转移发生率可以达到35％～50％，多个部位的骨转移发生率可以达到50％。对于脑和骨转移的癌症治疗，小分子抗体药物就可以发挥其无法替代的抑制转移作用。

目前小分子抗体开发成药物主要以两种形式为主，一种是抗体偶联复合物(antibodyconjugatecomplex，adc)。抗体-药物偶联物是一种新型的靶向治疗，比如抗肿瘤治疗中，adcs由一个抗体或一个抗体片段scfv连接着一个有效载荷的药物(通常是毒素)形成一个免疫复合物。抗体使这个免疫复合物结合到特定的肿瘤细胞上，通常这个免疫复合物会内化到肿瘤细胞内部，然后药物释放到细胞内引起肿瘤细胞损伤和死亡。抗体偶联复合物虽然具有很好的肿瘤识别能力和抗瘤效应，但是其制备过程中需要与另外的化学基团偶联，不仅增加了制备成本，还难以保证产物的均一性，偶联的化学基团与抗体的抗原识别区往往还容易产生空间位阻效应，有时对机体还具有毒副作用，这些因素都影响抗体偶联复合物实际的抗瘤效果。

小分子抗体片段的另外一个形式是双特异抗体。双特异性抗体(bsabs)就是可以识别两个不同表位的抗体。相比正常抗体，bsabs在癌症治疗中有一些无法比拟的优势：1.bsabs可增强特异性免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用。2.bsabs可以同时作用于两种不同的通路，发挥独特或加倍的抗肿瘤作用。3.bsabs可识别靶细胞表面两个抗原表位，增强结合能力。双特异抗体尽管具有很好的肿瘤识别能力，但是往往还需要借助其它的调节蛋白或细胞来促进机体产生抗瘤效应，因此难以保证高效的协同效应，其抗瘤效果仍然难以达到令人满意的效果。

技术实现要素：

基于现有技术存在的问题，本发明的目的是研发出一种具有特异性识别能力的抗血管内皮生长因子的单链抗体，进而提供一种介于上述两种新型抗体药物之间的具有增强的抗肿瘤作用的抗体融合蛋白。

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗血管内皮生长因子的单链抗体，所述抗体的轻链cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seqidno.1、2和3所示，所述抗体的重链cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seqidno.5、6和7所示。

在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如seqidno.4和8所示。

在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接肽相连。

在一个最为优选的技术方案中，所述连接肽的氨基酸序列如seqidno.9所示。

其次，本发明还提供了一种含有上述单链抗体的融合蛋白。

在一个优选的技术方案中，所述融合蛋白还含有氨基酸序列如seqidno.10所示的铁调素蛋白。

在一个更为优选的技术方案中，在所述抗体和所述铁调素蛋白之间以连接肽相连。

在一个又为优选的技术方案中，所述连接肽的氨基酸序列如seqidno.11所示。

在一个最为优选的技术方案中，所述铁调素蛋白位于融合蛋白的氨基端。

最后，本发明提供了上述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明选取具有确定性抗肿瘤作用的靶点血管内皮生长因子入手，利用噬菌体抗体库方法筛选高亲和力抗vegf的scfv，然后利用连接短肽将另外一种可以调节铁吸收利用的蛋白—铁调素(gh)串联起来，构建成抗体融合蛋白。该融合蛋白既不同于双特异抗体，因为串联的另一端是一种具有抗肿瘤活性的调节蛋白而不是抗体；也不同于抗体偶联复合物，因为连接抗体的是另外一种蛋白质，而不是用在抗体偶联复合物中的化合物或毒素。adc偶联的方法是物理方法，而本发明的抗体融合蛋白不需要物理方法，而是和抗体一起表达出来，这样既保证了抗体融合蛋白的均质性，同时本发明使用的特定连接短肽又保证了抗体和另一种调节蛋白的空间结构不受影响，保证抗体融合蛋白发挥两种不同的抗肿瘤作用。

本发明独特的发明构思在于抗体与其他具有活性蛋白融合表达的技术方案，这种抗体融合蛋白既具有抗体的特异性识别作用，同时又融合了另外一种具有抗肿瘤效果的调节蛋白，不仅能拓宽了抗肿瘤方式，而且还具有增强了的抗肿瘤作用。在细胞实验中，本发明的抗体融合蛋白对三种不同类型的肺癌细胞系，均有明显的生长抑制作用。在动物实验中，本发明的抗体融合蛋白均可以使小鼠肺肿瘤组织较对照组组有明显减小，其抑瘤效应与化学抗瘤药物相当。而且由于本发明选用的是抗体小分子片段，该抗体融合蛋白的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。

附图说明

图1.vh和vlpcr产物鉴定图；

图2.重组载体电泳鉴定图；

图3.vegfscfv与vegf-165蛋白亲和力筛选图谱；

图4.纯化后的vefgscfv聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图；

图5.vegf和vegf抗体对乳腺癌细胞系侵袭力影响的显微镜观察图；

图6.vegf抗体抑制乳腺癌细胞系侵袭力的侵袭细胞计数对照图；

图7.肿瘤模型小鼠的肺标本观察图；

图8.不同处理条件下的肿瘤模型小鼠肺重量对照图；

图9.不同处理条件下的肿瘤模型小鼠肺部恶性淋巴结数量对照图；

图10.不同处理条件下的肿瘤模型小鼠存活时间对照图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1抗vegf双特异抗体的制备

1.1高库容量天然抗体库的建立。

分离人外周血单个核淋巴细胞：随机选取100个健康成年人，抽取每人外周血10ml。用含10％肝素的rpmi-1640培养液1:1稀释，加到装有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液的体积比为2:1)中，2,000×g，离心17分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单个核细胞层，pbs缓冲液洗两次。

1.2细胞总rna的提取

按每5×10⁶细胞/ml的比例加入trizol试剂，吹打细胞使之裂解。室温孵育5分钟，移入经depc处理的ep管中，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟。4℃，10,000×g离心15分钟，吸取上层水相至一个新的离心管中，加入1/2体积的异丙醇，冰浴10分钟。4℃，12,000×g离心10分钟，弃上清，加入1ml75％乙醇清洗沉淀。4℃，7,500×g离心5分钟，弃上清，室温干燥沉淀，溶于无rnase的水或沉淀于无水乙醇内，-80℃保存备用。

1.3逆转录合成cdna第一链

先用无rnase的dnaseⅰ处理总rna以消除残存的基因组dna。取处理过的rna样品2μg和oligo(dt)15(500μg/ml)1μl，补加depc水至12μl，70℃，加热10。取出后马上置于冰浴中，依次加入5×buffer5μl；dntp(10mmol/l)5μl；rna酶抑制剂1μl,mmlv逆转录酶1μl,补加depc水至25μl，42℃，保温60分钟进行逆转录反应，70℃，15分钟灭活酶活性。

1.4pcr扩增vh和vl基因

以逆转录合成cdna第一链为模板，采用人scfv抗体库引物扩增所表达的vh和vl基因。

反应体系如下：

加去离子水至终体积为50μl。

pcr参数：94℃变性3分钟后，再以94℃30秒；61℃30秒；72℃1分钟，进行pcr，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。反应结束后取5μl反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。

pcr产物回收

(1)pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶上切下目的dna片段，放入1.5ml离心管中。

(2)加入400μl溶胶液a，70℃溶解5分钟，至凝胶全部溶解。

(3)加入200μl溶胶液b，混均后将全部液体吸入回收柱中。

(4)12,000×g离心1分钟，弃废液。

(5)加入500μl中和液，12,000×g离心1分钟，弃废液。

(6)加入700μl洗涤液，12,000×g离心1分钟，弃废液。

重复步骤(6)1次。

(7)12,000×g离心2分钟，弃废液，将回收柱移入新的接收管上，室温干燥5分钟。

(8)加入30μl去离子水，12,000×g离心1分钟，洗脱dna片段，于-20℃保存备用。

1.5搭桥pcr法进行vh和vl的拼接

将制备的vh和vl片段作为模板，进行vh和vl片段的串联。

pcr反应体系：

pcr反应条件为94℃预变性5分钟，然后按如下参数进行30个循环：94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分钟半，最后72℃延伸10分钟。重复胶回收步骤，pcr产物溶于30μlddh2o中。图1为vh和vlpcr产物鉴定图，其中泳道1vl，泳道2vh，泳道3vh+vl串联体。

1.6连接到噬菌体载体上，

sfi1酶切载体和pcr产物

37℃酶切2小时，用相同的方法回收酶切片段。

连接反应

上述反应物充分混匀并离心使其沉于管底后，4℃连接过夜。酶切后的片段与pcomb3xss载体片段连接，构建成重组质粒。图2为重组载体电泳鉴定图。其中，1为重组体片段pcomb3xss载体酶切图谱，2为分子量标记。

1.7转化和表达

将构建好的载体(质粒)转化(电转)到大肠杆菌内(特定的大肠杆菌)，扩增大肠杆菌并加辅助噬菌体，收集重组后的噬菌体即为噬菌体抗体库。

经检测百人天然scfv抗体库的库容量为2*10¹⁰，完全满足抗体筛选的需要。

1.8vegf抗体的筛选

从抗体库中取出10ul在大肠杆菌中扩增，收集扩增后的抗体库，vegfa亚型蛋白包被elisa板后加入抗体库，孵育后冲洗非特异噬菌体，消化特异结合噬菌体，富集后将消化的噬菌体感染大肠杆菌涂板，挑取单克隆菌团并小量诱导，小量诱导后的单克隆菌上清做elisa筛选阳性克隆，经过多次验证，选取亲和力和特异性都高(亲和力达到10^-8-10^-9kd)的阳性克隆进行抗体表达。图3为筛选出的vegfscfv与vegf-165蛋白的结合试验，抗体ab7显示出了与vegf-165蛋白非常好的亲和活性。

将阳性克隆中的质粒提取并转化到其他表达菌，或将抗体基因连接到其他载体再转化到相应表达菌中，筛选最佳表达条件进行大量诱导表达，最后选择最佳的纯化方法及缓冲液，获得抗体蛋白。图4为纯化后的vefgscfv聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图。选取抗体ab7进入下一步的融合蛋白构建。

大肠杆菌dh5α为本室保存，基因型为：supe44δlacu169hsdr17reca1end1gyr96thi-1rela1,用于质粒的扩增与转化。

大肠杆菌bl21(de3),基因型为hsdsgal(λcits857ind1sam7nin5lacuv5-t7),用于重组蛋白质的表达。

pgem-teasy：用于pcr产物的克隆，购自promega公司。

原核表达质粒载体pet30，pet42，pgex-4t-1均为本室保存。

实施例2.融合蛋白的构建

生物合成铁调素dna和选取的linkerdna，并使用pcr技术连接到vegfscfvdna上。

pcr反应反应体系：

加去离子水至终体积为50μl。

pcr参数：94℃变性3分钟后，再以94℃30秒；61℃30秒；72℃1分钟，进行pcr，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。反应结束后取5μl反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。

连接反应反应体系：

上述反应物充分混匀并离心使其沉于管底后，4℃连接过夜。

重组质粒的转化(步骤同前)。

阳性克隆dna片段的序列分析。

经菌液pcr鉴定阳性的克隆，取1ml菌液由诺塞基因生物技术公司完成测序，测序引物为t载体的通用引物。用dnaman软件分析测序结果。

测序结果：

抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如seqidno.4和8所示，两者由如seqidno.9所示氨基酸序列的连接肽连接；

铁调素蛋白氨基酸序列如seqidno.10所示，抗体和铁调素之间由seqidno.11所示氨基酸序列的连接肽连接。所述铁调素蛋白位于融合蛋白的氨基端。

鉴定完成后转化到表达菌株中，进行大量表达，最后获得抗体-铁调素融合蛋白。

从经过鉴定的阳性菌保存板中挑单菌落接种于5mllb培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。

将上述菌液按1:100的比例接种到一个含有400mllb(抗生素)的锥形瓶中，37℃剧烈振荡培养2小时。

加入终浓度为1mmol/liptg，于37℃诱导表达3-4小时。

收集培养液，5,000rpm离心10分钟，弃上清。pbs洗菌体沉淀。

用pbs按照5ml/g重悬，冰浴下以工作10秒/300w/30次，每次间隔15秒的参数，超声破碎细胞。12,000rpm离心20分钟，收集上清。

重组蛋白质的纯化

将含有六个组氨酸标记的融合蛋白vegfscfv-gh-his6以0.45μm滤膜过滤，准备过柱。

histrapkit亲和柱用bindingbuffer10ml平衡后，加入已经准备好的待纯化样品。调节流速约为8-10滴/分钟。

使用bindingbuffer洗柱。

使用6mlelutionbuffer洗脱柱子。分管收集洗脱液。取少量进行sds-page鉴定，富含目的蛋白的各管于-70℃保存。

实施例3.融合蛋白对不同乳腺癌细胞生长的抑制作用

使用transwell小室(3428型，孔径8um，美国corning-costar公司)测定细胞体外侵袭力(按操作说明书进行)

制备条件培养液(作为趋化因子)：小鼠成纤维细胞系nih3t3，用含10％小牛血清的rpmi-1640培养液在37℃、5％co2条件下培养，待长势良好时换无血清培养液培养24小时后，收集上清液，过滤除菌，冰冻保存备用。

200ul/孔细胞外基质包被transwell小室底部，37℃培养箱中聚合1小时。

6孔板中加入含0.1％bsa的高糖dmem培养基1ml于37℃水化基底膜30分钟。

吸弃培养液，加入1:1条件培养液和完全培养液2.5ml于下室。

接种转染细胞2×10⁵/孔于上室，37℃、5％co2孵化培养箱内培养48小时，每组设三个复孔。

取出小室，用棉签擦去上室中的细胞，95％酒精固定15分钟，苏木素染色10分钟，蒸馏水漂洗后，再用伊红染色，梯度酒精70％、80％、90％、95％、100％脱水，二甲苯透明，手术刀取下膜，中性树胶固定封片。在400倍光镜下随机取5个视野计数穿模细胞数，取其平均值代表侵袭力的值。

本实验使用三种人乳腺癌细胞系细胞系来验证vegf抗体的抗侵袭性。分别是mcf-7，mda-mb-468，mda-mb-231，均购于中国医学科学院细胞中心。试验设为无处理组，加入vegf外源蛋白组(使用浓度50ng/ml)，加入抗vegf抗体组(使用浓度50ng/ml)，加入同型抗体对照组(使用浓度50ng/ml)。

实验结果：

通过transwell小室微孔膜后的细胞形态没有变化，经过染色后呈蓝色。图5为在光学显微镜下肿瘤细胞通过微孔膜的情况。可以看到三种人乳腺癌细胞系由于本身可以分泌vegf，在没有处理因素情况下，48小时后都有细胞通过微孔，其中mda-mb-231的侵袭性最强；在加入外源vegf蛋白后这些细胞的侵袭性增强，染色细胞变多；当加入vegf抗体后可见三种细胞的侵袭性明显被抑制，细胞数远远少于无处理组；而同型抗体对照的侵袭细胞数和无处理组相当。因此，本发明的抗体可以明显抑制人乳腺癌细胞侵袭。图6为计数侵袭细胞取其平均值所得的统计结果。vegf组和vegf抗体组与无处理组都有统计学差异。

实施例4.融合蛋白对不同肺癌细胞生长的抑制作用

原位肺癌抑制小鼠模型的建立

将肺癌a549细胞系悬浮于pbs中，调整细胞浓度为5×10⁶/ml。

消毒裸鼠尾部皮肤(裸鼠购于中国医学科学院实验动物中心)，将0.2ml细胞悬液用1ml带有27g1/2针头的注射器尾静脉注射接种裸鼠，干棉签压迫。5周后处死裸鼠，取出肺转移肿瘤组织，行原代培养后再次接种裸鼠，反复4次，筛选出的a549肺癌细胞系尾静脉接种后可在裸鼠肺部产生稳定的肿瘤转移灶。此时的小鼠肺癌模型可用于下述的药物鉴定。

试验分为六组，每组10只裸鼠。其中正常组不做任何处理，其余裸鼠均为肺癌模型组。各处理因素分别是：化疗组(环磷酰胺ctx)，vegf抗体组，铁调素组，vegf抗体-铁调素融合蛋白组。

图7-10为本发明的抗体融合蛋白抗肿瘤的动物试效果比较。图7为不同处理组的肺组织大小比较图。由图7可见，model组为未处理肺癌模型组的肺组织最大而且呈明显淤血状态，而使用化药ctx和抗体以及gh和抗体融合蛋白组后，肺组织均较model组有明显减小，大小类似正常肺组织而且淤血状态有不同程度减轻。图8为不同处理组的肺组织重量的比较图，由图8可见，可见其他处理组均较模型组有显著性降低，且抗体融合蛋白组的肺组织重量最接近正常肺组织。图9为不同处理组的肺组织中恶性淋巴结个数统计。由图9可见，肿瘤模型组的肺部恶性淋巴结数量最多，其他治疗组的恶性淋巴结数量明显减少，其中使用vegf抗体融合蛋白组的裸鼠恶性淋巴结数量最少。图10为不同处理组的生存曲线。使用抗体治疗和铁调素治疗后的肿瘤小鼠的存活时间都较肿瘤模型组有明显延长。

序列表

<110>北京格根生物科技有限公司

<120>一种抗血管内皮生长因子抗体及与铁调素的融合蛋白

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