用于中和血管内皮生长因子的重组单株抗体vNAR的制作方法

本发明是关于生物科技领域，特别关于名为vNAR的基于鲨鱼的单株抗体生物制药的生成，其是阻碍血管内皮生长因子，且具有显著的生物学及生物物理学上的特性。所述vNAR抗体对于环境具有高度的抗性，且可不需要冷冻链。此外，其具有良好的穿透能力，因而提升其治疗活性。

背景技术：

抗体为医疗应用中的重要工具。大部分的抗体是由二重链以及二轻链所组成，重链以及轻链形成抗原结合位。非典型的抗体结构在大羊驼(llamas)、骆驼以及软骨鱼类中被发现。这些抗体是由具有四个恒定结构域以及一抗原结合位或可变结构域的单一重链所构成，其在骆驼中名为V_HH、hcAbs，在板鳃亚纲生物(elasmobranches)中被名为vNAR或V_HNAR。¹

抗体科技被发展，用于提供新的治疗以及诊断系统。其是包含，例如：单株抗体；被设计以减少非人抗原反应的人源化抗体；以及改善其特性的共轭抗体等的使用。被FDA核准用于治疗多种人类疾病的抗体的数量有所增加，大约352种抗体处于临床试验(第一期及第二期)的阶段，大约占所有于临床试验阶段的蛋白质的25％。²

具有抗原结合能力的小片段抗体，被做为医疗用途的技术性替代品。这些替代品是自重组分子获得进展，像是抗原结合的片段(fragment of antigen binding,Fab)及/或单一链可变片段(single chain variable fragment,scFv)，于单一结合结构于基于具有V_H结构域的蛋白质，其依序被用于研发新的免疫治疗及免疫诊断策略。由于稳定性的增加，以及获取无法被传统的抗体所辨识的抗原决定部位的可能性，Fad于较小的结构域的模似物是具有优势的。²

软骨鱼类具有三种同型免疫球蛋白或抗体，其中二种具有二标准重链及轻链，被命名为IgM及IgW(也称IgX或IgNARC)，以及一非典型同型名为IgNAR，其是重链的同型二聚体，并未包含轻链。鲨鱼的抗原受体免疫球蛋白(称为IgNAR或NAR)具有一单一可变结构域(sbAb片段)及二叉状高度可变结构(fork hypervariable structures)，以包含整个具有统一专一抗原变异性的谱(repertoire)。IgNAR是高度可溶及高度热稳定的小分子(12kDa)，且具有良好的活体组织穿透能力，这使得IgNAR成为抗体工程及治疗性抗体的良好来源。3,4

本发明是关于IgNAR抗体的选择及分离，特别关于该抗体的可变区域V_HNAR，其是源自免疫接种的佛氏虎鲨(Heterodontus francisci)或斑纹须鲨(Orectolobus maculatus)，对于细胞因子具有亲和力，且具有中和其活性的能力。这些抗体大体上源自于软骨鱼类(鲨鱼、鳐鱼、魟鱼及银鲛)。IgNAR抗体的分子排列是由5个固定区域以及一个可变区域所构成，其与骆驼科生物中发现的V_H非常相似，这可能代表在分子层级的趋同演化。^1,5

纳托尔(Nuttall)及合作者，透过基于斑纹须鲨的IgNAR的噬菌体展示技术(phage display technology)，得到了非免疫的鲨鱼抗体库。这些区域具有辨识蛋白质的能力，例如：源自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的牙龈蛋白酶K(gingipain K protease)、粒线体进入受体Tom70(mitochondrial import receptor Tom70)、恶性疟原虫的溶菌酶及顶端膜抗原1(Apical Membrane Antigen 1,AMA1)等蛋白质。这些区域被克隆(clone)于大肠杆菌(Escherichia coli)的表达系统中，首先对于自鲨鱼的自然谱获得的NARs的抗原专一性，作为高度亲和力的单一结构域抗体的可能来源进行描述。^6,7,8

杜利(Dooley)及合作者，在2003年选择了源自铰口鲨(Ginglymostoma cirratum)的目标库。这些鲨鱼被以鸡卵溶菌酶(hen egg lysozyme,HEL)产生对HEL抗原高度专一性的克隆，具有纳摩尔等级的亲和力(介于10^-7至10^-10M之间)，以及对于热变性具有极佳的抗性，其在100℃、3小时的培养后，仍保持超过20％的活性。

IgNAR的基因是被群组化，每一群组是由一个单一可变简单区域(VH)、三个多样性组件(D)以及一个单一连接基因(G)所组成。IgNAR V_H的主要谱系通过四个重组事件生成，产生在序列及长度上皆具有多样性的CDR3谱。⁶

在这些单一链抗原受体的发现之后，由于其具有高度功能性，随即发展出其他与鲨鱼蛋白质相关的技术。分离及克隆的可变结构域非常的稳定；相较于骆驼科的抗体，该结构域小了20％，以及相较原始受体其具有相同的抗原结合能力。

此技术的优势在于，结合传统抗体的特性与小分子的优点；其具有高度专一性及低度固有毒性；由于较小的分子量，其具有较大的可能性到达目标区域；其是具有抑制酵素的能力以及能够到达细胞受体的结合位。所有的这些特性可被开发用于治疗应用。此外，其对于通过多样化途径的给药具有极大的潜力，包括局部(topical)路径。最后，其易于生产且成本低廉。⁵

从文献中可清楚的了解，VEGF及其受体(VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3)的过度表达，导致微血管穿透性及血管生成的增加，产生眼部病症，例如：糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy)、年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)以及新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)。在视网膜的血管及神经元中，VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3受体的细胞分布，促成了VEGF家族在正常视网膜的多种特定功能。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，被描述为肿瘤衍生因子，具有诱发内皮细胞通透性、细胞增生及血管生成的能力，致使新血管的形成，特别是为癌组织供应氧气与养分的血管。虽然，许多其他的因子与血管生成相关，但VEGF是其中关键介质。

VEGF(或VEGF-A)为一种肝素结合的糖蛋白，其属于包含VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及血小板生长因子的生长因子亚族(subfamily)。由于VEGF mRNA的选择剪接模式(alternative splicing patterns)，VEGF存在至少七种同功型(isoforms)。四种主要的同功型为VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉及VEGF₂₀₆(下标数字系指蛋白质的氨基酸数量)。主要的种类为VEGF₁₆₅，对于肝素具有亲和力，因此，部分的这种同功型是结合且通过蛋白酶切割(proteolytic cleavage)释放。其他种类系游离且可供结合至内皮细胞的受体。这产生了二种不同的流程：可溶性同功型的分泌以及结合同功型的蛋白酶切割。不同的VEGF同功型在生理学上的重要性尚未明了；然而，VEGF₁₆₅系为血管生成的主要调节因子。

VEGF主要与二种受体结合：VEGF受体-1(也被称为Flt-1)及VEGF受体-2(也被称为Flk-1或KDR)。这些受体皆具有细胞外结构域(其结合VEGF)，具有七个免疫球蛋白-类型区域，单一跨膜区以及具有酪胺酸激酶活性的细胞内结构域。这些受体主要在发育中组织的血管内皮细胞中被发现。

与VEGF受体-2的结合，直接促进血管生成及活化的一系列的信号传导途径，导致血管内皮细胞的增生、血管内皮细胞的迁移、未成熟血管内皮细胞的存活以及血管通透性的增加。

虽然，VEGF受体-1起先被认为是作为“诱饵受体(decoy receptor)”的角色，通过减少可结合至VEGF受体-2的VEGF分子数量，但近期研究显示，VEGF受体-1也具有引发有丝分裂信号的能力。

血管生成为新血管结构的形成且在例如肿瘤的建立及眼部疾病的病理学过程中扮演了重要的角色。已知，糖尿病性视网膜病变(Diabetic retinopath)为视网膜中新血管的不正常生长以及纤维组织的出现；当发源于黄斑部下方时，被称为黄斑变性(Macular Degeneration)；以及当发生于虹膜时，被称为新生血管性青光眼(Neovascular Glaucoma)。

糖尿病性视网膜病变为一种视网膜的疾病，其发生在具有糖尿病(diabetes mellitus)的患者中；于患有该疾病多年后发生，第一型及第二型患者皆然，当该疾病未被良好控制特别易发。糖尿病性视网膜病变具有二种类型：早期或非增生糖尿病性视网膜病变以及增生或晚期糖尿病性视网膜病变。增生糖尿病性视网膜病变的特点为，新血管的不正常生长以及后续对应视网膜缺血及视网膜前或玻璃体出血的发展的纤维增生。¹¹其重要性在于，这在全世界是导致永久失明的主要原因之一，且可通过给予适当的预防措施以及实时施加治疗加以预防。¹¹糖尿病性视网膜病变被定义为糖尿病患者中，典型发生的微血管损伤的存在及演化。

年龄相关的黄斑变性(Age-related macular degeneration,ARMD)为造成超过60岁的患者视力丧失的主因。黄斑为视网膜的中心区域，其是负责用于阅读、看电视、看见人群以及大体上任何精密细节的影像的精密视觉。¹²年龄相关的黄斑变性为黄斑的退化性病症，其是导致视力丧失的常见原因。其可被分类为湿性(新生血管性)或干性(非新生血管性)。大约10％的患者受湿性黄斑变性之苦。

一般针对湿性黄斑变性的治疗，包含于眼内施加一种或多种称为“抗血管生成”药物的注射剂，其是试图移除新生血管膜。只要该治疗是实时的施加且没有太多的疤痕发生，透过这样的治疗，超过90％的患者达到视力的维持，以及大约二分之三的患者达到视力的改善。¹³

透过创伤或例如上述疾病所造成的损伤的循环，导致这些组织中新血管的发展。角膜新生血管形成为导致脉络膜微血管穿过布鲁赫膜(Bruch's membrane)的不正常血管生长，以及随后于视网膜色素上皮下方的增生(第一型)及/或于视网膜下方的增生(第二型)。这可因布鲁赫膜的破裂、例如VEGF的细胞因子的释放、发炎、视网膜色素上皮中的氧化压力或血管功能不全而发生。此病症是导致湿性黄斑变性的主因，且可能与多种病征相关，包含血管样纹(angioid streaks)、脉络膜破裂(choroidal rupture)、病理性近视(pathological myopia)、脉络膜视网膜病变(chorioretinal lesion)以及散弹状脉络视网膜症(birdshot chorioretinopathy)。

也有虹膜新生血管(iris neovascularization)的现象。虹膜前壁表面不正常的新血管形成通常与多种不同的病症相关，其导致视网膜缺血(retinal ischemia)，例如糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion)、颈动脉疾病(carotid artery disease)、葡萄膜黑色素瘤(melanoma uveal)、长期视网膜脱离(prolonged retinal detachment)等。新生血管形成开始于瞳孔边缘，且通常在此同时于前房角(angle of the anterior chamber)形成以及扩散至整个表面。新血管伴随纤维组织膜，其可阻挡水状液(aqueous humor)经由小梁网状结构(trabecular meshwork)穿透(新生血管性青光眼)，以及导致瞳孔边缘的葡萄膜外翻(ectropion uveae)。通常的治疗包含施加雷射光凝术(laser photocoagulation)以避免新血管的形成。

新生血管性青光眼为一种特殊形态的续发性青光眼，其是因虹膜中的新血管的形成所致。这些新血管最终导致水状液自眼前房的循环受到阻碍，引发高眼压。这导致视网膜氧气慢性及长期的缺乏。使得系统产生刺激新生血管形成的物质作为响应。

新生血管形成的现象所涉及的其他病理学过程为：视网膜新生血管形成(Retinal Neovascularization)、脉络膜新生血管形成(Choroidal Neovascularization)、角膜新生血管形成(Corneal Neovascularization)、黄斑变性(Macular Degeneration)、年龄相关的黄斑变性(Age-Related Macular Degeneration)、视网膜疾病(Retinal Diseases)、糖尿病性视网膜病变(Diabetic Retinopathy)、玻璃体出血(Vitreous Hemorrhage)、视网膜出血(Retinal Hemorrhage)、脉络膜炎(Choroiditis)、视网膜脱离(Retinal Detachment)、视网膜玻璃膜疣(Retinal Drusen)、新生血管性青光眼(Neovascular Glaucoma)、脉络膜疾病(Choroid Diseases)、葡萄膜炎(Uveitis)、近视(Myopia)、眼部疾病(Eye Diseases)、真菌性眼部感染(Fungal Eye Infections)、微血管扩张(Telangiectasia)、视网膜动脉阻塞(Retinal Artery Occlusion)、退化性近视(Degenerative Myopia)、视网膜静脉阻塞(Retinal Vein Occlusion)、脉络膜视网膜炎(Chorioretinitis)、组织胞浆菌病(Histoplasmosis)、葡萄膜疾病(Uveal Diseases)、德国麻疹(Rubella(German Measles))、眼部弓形虫病(Ocular Toxoplasmosis)、视网膜上膜(Epiretinal Membrane)、缺损(Coloboma)、脉络膜肿瘤(Choroid Neoplasms)、视网膜变性(Retinal Degeneration)、视网膜炎(Retinitis)、视网膜穿孔(Retinal Perforations)、疱疹性角膜炎(Herpetic Keratitis)、早产儿的视网膜病变(Retinopathy of Prematurity)、黄斑囊样水肿(Cystoid Macular Edema)、视乳头水肿(Papilledema)、葡萄膜脑膜脑炎综合症(Uveomeningoencephalitic Syndrome)、视盘玻璃膜疣(Optic Disk Drusen)、血管样纹(Angioid Streaks)、视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa)、视力异常(Vision Disorders)、交感性眼炎(Sympathetic Ophthalmia)、疤痕(Scar)、眼部烧伤(Ocular Burns)、复发性缺血(Recurrent Ischemia)、眼部外伤(Eye Injuries)、青光眼(Glaucoma)、眼部出血(Eye Hemorrhage)、盲点(Scotoma)、后葡萄膜炎(Posterior Uveitis)、真菌血症(Fungemia)、视网膜肿瘤(Retinal Neoplasms)、角膜疾病(Corneal Diseases)、色素失禁(Pigmentary Incontinence)、血红蛋白C疾病(Hemoglobin C Disease)、纤维化(Fibrosis)、角膜浑浊(Opacity of the Cornea)、前葡萄膜炎(Anterior Uveitis)、前房出血(Hyphema)、节结病(Sarcoidosis)、晶状体缺失症(Aphakia)、医源病(Iatrogenic Disease)、全葡萄膜炎(Panuveitis)、眼部白内障(Eye Cataract)、手术后并发症(Postoperative Complications)、镰状细胞贫血(Sickle Cell Anemia)、视网膜血管炎(Retinal Vasculitis)、骨肿瘤(Osteoma)、巨细胞病毒性视网膜炎(Cytomegalovirus Retinitis)、萎缩症(Atrophy)、静脉炎(Phlebitis)、圆锥角膜(Keratoconus)、史德格-韦伯症候群(Sturge-Weber Syndrome)、病毒性眼部感染(Viral Eye Infections)、眼部畸形(Eye Abnormalities)、物质滥用疾患(Substance-Related Disorders)、眼球穿通外伤(Penetrating Eye Injuries)、第二型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 2)、辐射损伤(Radiation Injuries)、镰状细胞特征(Sickle Cell Trait)、假晶状体(Pseudophakia)、色素痣(Pigmented Nevus)、增殖性玻璃体视网膜病变(Proliferative Vitreoretinopathy)、出血(Bleeding)、第一型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 1)、痣(Nevus)、视神经疾病(Optic Nerve Diseases)、血管疾病(Vascular Diseases)、念珠菌感染(Candidiasis)、化学烧伤(Chemical Burns)、小眼症(Microphthalmia)。

在全世界，28500万人具有由多种因素所引起的视觉障碍，且其中的3900万人为眼盲。¹⁴“造成慢性眼盲的主因包含：白内障、青光眼、年龄相关的黄斑变性、角膜浑浊、糖尿病性视网膜病变、砂眼及幼儿眼部疾病，以及因缺少维生素A所导致的幼儿眼部疾病。年龄相关的眼盲以及因未获控制的糖尿病所导致的眼盲，在全世界有增加的趋势。四分之三的眼盲系可被预防或治疗的”。15

VEGF活性的抑制分子可被用于限制依赖VEGF活性的新生血管形成的过程。

抗-VEGF抗体结合至配体，因此消除自由循环的VEGF，且防止VEGF结合至其受体。由于抗体具有高度的专一性且仅结合至VEGF，其已被用于此用途上；由所有结合至VEGF的受体所调节的促血管形成效应(pro-angiogenic effects)可被抑制。

不同的策略被研发，以抑制VEGF-调节的讯息传递，然而，由于费拉拉(Ferrara)及戴维斯-史密斯(Davis-Smith)提出的文献中显示，特定的抗-VEGF抗体在动物模式中可抑制肿瘤的生长，人类形式的抗-VEGF抗体自1997年开始获得了发展。

贝伐单抗(Bevacizumab)为一种抗-VEGF单株抗体。其为第一个用于癌症治疗的抗血管形成抗体；其被用于结合化疗方案，作为转移性结直肠癌的第一线治疗。其被测试于多种器官的癌症，具有正面的临床结果，包含：肿瘤缩小以及中至长期存活率的增加。¹⁶

于2004年，美国食品药品监督管理局(FDA)核准了哌加他尼(Pegaptanib)，其为第一个通过玻璃体腔内注射的用于眼部给药的抗血管形成药物。此抗-VEGF药物在年龄相关的黄斑变性的患者的研究中被加以分析。其结果显示70％受治疗患者的视力获得稳定，相较之下，未受此抗体治疗的患者为50％。

于2006年，美国食品药品监督管理局(FDA)核准了眼部用的兰尼单抗(Ranibizumab)，其为抗-VEGF人化小鼠单株抗体的重组Fab片段；其也被成功地用于眼部疾病的治疗上，抑制导致眼盲的新生血管形成，特别用于治疗各种类型的黄斑变性，特别是湿性年龄相关的黄斑变性。

兰尼单抗的给药途径为玻璃体腔内注射。然而，兰尼单抗会导致视网膜脱离及严重感染等副作用。其被报导在老鼠中会导致视网膜的感光细胞及米勒细胞(Müller cells)的死亡，所述细胞对于视觉功能至关重要。

下列所示，为其他通过抑制VEGF活性而产生作用且为眼内给药的眼科用药：维替泊芬(Verteporfin)，作为与黄斑变性相关的脉络膜新生血管形成的选择治疗；阿柏西普(Aflibercept)，其被用来治疗湿性年龄相关的黄斑变性；以及地塞米松(dexamethasone)，其为皮质类固醇，当作为玻璃体内植入剂施用时，可减少导致黄斑水肿的发炎过程。

美国专利8,496,933，帕尼亚瓜-索利斯等人(Paniagua-Solís et al.)，是关于蛋白质的选择、分离及生产，该蛋白质是属于名为V_HNAR或vNAR的可变区域，源自具有抗原受体能力的板鳃亚纲生物的IgNAR-型免疫球蛋白。此vNAR被名为V13，其根据与血管内皮生长因子(VEGF)的专一性结合能力而被选择。其通过中和VEGF活性而产生作用，其特性在于序列、选择及优化，且其系本发明最接近的现有技术，通过引用以其整体并入本文。

抗-VEGF治疗上的试验，已在多种给药策略上进行测试，例如：，当治疗开始时的给药频率，以及这些策略如何在临床治疗上依循(由于第二或副作用如：高血压、蛋白尿、出血、手术伤口愈合的伤害、甚至是致命的并发症如：动脉血栓形成、胃肠道穿孔及可逆性局灶性后部脑白质病(reversible posterior focal leukoencephalopathy))、给药途径、方法的侵袭力(invasiveness)、高剂量、生体可用率(bioavailability)、不稳定性，以及其他如高昂的成本、长期的治疗，导致需要研究新颖、具有较佳表达的化合物。即便具有这些替代方案，仍存在研发用于眼部治疗之抑制VEGF活性的较佳药物的需求，通过移除或减少副作用。

本发明描述新颖克隆及名为V19、V32R的新颖分子，以及先前提及的V13分子，其特性在于三维空间结构、序列及其对于VEGF的亲和力，且可被用于治疗眼部症状，特别用于糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、新生血管性青光眼或与血管生成相关的眼科症状。

技术实现要素：

本发明是关于名为IgNARs的基于鲨鱼的治疗用单株抗体的生成，其包含免疫球蛋白的重链。特别地，本发明是关于这些重链的可变区域(vNARs)的选择。在此情况下，其特性在于具有辨识名为血管内皮生长因子(VEGF)的细胞因子的能力。由于生物学及生物物理学上的特性，vNARs在生物技术领域中受到关注。所述vNAR抗体对于环境具有高度的抗性，且对于局部治疗作用具有的高度潜力。同时，由于具有衍生自骆驼的免疫球蛋白(名为V_HH)的可变结构域，vNARs为具有辨识抗原能力的最小生物分子。由于这些特性，vNARs克服了传统单株抗体治疗的缺点与不足。

此外，本发明是关于蛋白质的选择、分离及纯化，所述蛋白质属于名为V_HNAR或vNAR的可变区，其源自具有抗原受体能力的板鳃亚纲生物的IgNAR-型免疫球蛋白。所述蛋白质的来源克隆名为VEGFvNAR V32R及V19，以及相应抗体名为V32R及V19(也被定义为v19或v32R)。

本发明描述名为V19、V32R及后续提及的V13的新颖克隆以及分子，其特性在于三维空间结构、序列及其对于VEGF的亲和力，且可被用于治疗眼部症状，特别用于糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、新生血管性青光眼或与血管生成相关的眼科症状。

为了证明新颖的克隆并非实验室手段(laboratory artifice)，且其实际上包含了差异性抗体(differential antibodies)，其是令人惊讶且无法预期地提供超越先前技术的技术优势，有关克隆V13特性也被包含于本文中-在前文美国专利8,496,933中被描述-，且为了对结果进行比较，其被相同地以本发明所研发的分离及纯化程序执行。此外，为了改善产率，在本发明的研发期间，进行不同的测试以及表达及纯化的方法，通过检测及得到表达及纯化蛋白质的最佳条件，并得到对于每一获得的克隆的结合与中和VEGF性能的后续评估。

附图说明

图1为抗-VEGF蛋白vNAR V13的氨基酸序列，标示检测出的被认为的保守结构域

图2为对应克隆V13、V32R及V19的序列之间的比对

图3为使用于产生重组体(constructs)的表达载体：A:pET20b+(vNAR 1及3),B:pET28a+(vNAR 2及 4)

图4为培养大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)直到其获得周质部分(periplasmic fractions)以及可溶及不可溶胞质部分(cytoplasmic fractions)的过程

图5为具有信号肽(signal peptide,sp)的VEGFvNAR v32R的亚细胞部分(subcellular fractions)检测的分析：A:SDS PAGE 15％丙烯酰胺还原条件，使用考马斯蓝(Coomasie blue)染色；B:电印迹(Electroblotted)至硝化纤维素膜，使用抗-组胺酸(anti-His)(1:3000)加上结合至过氧化物酶的抗-老鼠二级抗体(1:3000)进行杂合。通过增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)显影。各道(lane)的样本：1)spVEGFvNAR v32R胞外部分(extracellular fraction)30℃；2)spVEGFvNAR v32R胞外部分30℃,3)spVEGFvNAR v32R周质部分30℃；4)spVEGFvNAR v32R周质部分37℃；5)spVEGFvNAR v32R可溶胞质部分30℃；6)spVEGFvNAR v32R可溶胞质部分37℃；7)spVEGFvNAR v32R不可溶胞质部分(内含体(Inclusion bodies))30℃；8)spVEGFvNAR v32R不可溶胞质部分(内含体(Inclusion bodies))37℃

图6为不具有信号肽(signal peptide,sp)的VEGFvNAR v32R的亚细胞部分(subcellular fractions)检测的分析：A:SDS PAGE 15％丙烯酰胺还原条件，使用考马斯蓝(Coomasie blue)染色；B:电印迹(Electroblotted)至硝化纤维素膜，使用抗-组胺酸(anti-His)(1:3000)加上结合至过氧化物酶的抗-老鼠二级抗体(1:3000)进行杂合。通过增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)显影。各道(lane)的样本：1)VEGFvNAR v32R胞外部分(extracellular fraction)30℃；2)VEGFvNAR v32R胞外部分30℃,3)VEGFvNAR v32R周质部分30℃；4)VEGFvNAR v32R周质部分37℃；5)VEGFvNAR v32R可溶胞质部分30℃；6)VEGFvNAR v32R可溶胞质部分37℃；7)VEGFvNAR v32R不可溶胞质部分(内含体(Inclusion bodies))30℃；8)VEGFvNAR v32R不可溶胞质部分(内含体(Inclusion bodies))37℃

图7为具有信号肽(signal peptide,sp)的VEGFvNAR v19的亚细胞部分(subcellular fractions)检测的分析：A:SDS PAGE 15％丙烯酰胺还原条件，使用考马斯蓝(Coomasie blue)染色；B:电印迹(Electroblotted)至硝化纤维素膜，使用抗-组胺酸(anti-His)(1:3000)加上结合至过氧化物酶的抗-老鼠二级抗体(1:3000)进行杂合。通过增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)显影。各道(lane)的样本：1)spVEGFvNAR v19胞外部分(extracellular fraction)30℃；2)spVEGFvNAR v19胞外部分30℃,3)spVEGFvNAR v19周质部分30℃；4)spVEGFvNAR v19周质部分37℃；5)spVEGFvNAR v19可溶胞质部分30℃；6)spVEGFvNAR v19可溶胞质部分37℃；7)spVEGFvNAR v19不可溶胞质部分(内含体(Inclusion bodies))30℃；8)spVEGFvNAR v19不可溶胞质部分(内含体(Inclusion bodies))37℃

图8为不具有信号肽(signal peptide,sp)的VEGFvNAR v19的亚细胞部分(subcellular fractions)检测的分析：A：SDS PAGE 15％丙烯酰胺还原条件，使用考马斯蓝(Coomasie blue)染色；B：电印迹(Electroblotted)至硝化纤维素膜，使用抗-组胺酸(anti-His)(1:3000)加上结合至过氧化物酶的抗-老鼠二级抗体(1:3000)进行杂合。通过增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)显影。各道(lane)的样本：1)VEGFvNAR v19胞外部分(extracellular fraction)30℃；2)VEGFvNAR v19胞外部分30℃,3)VEGFvNAR v19周质部分30℃；4)VEGFvNAR v19周质部分37℃；5)VEGFvNAR v19可溶胞质部分30℃；6)VEGFvNAR v19可溶胞质部分37℃；7)VEGFvNAR v19不可溶胞质部分(内含体(Inclusion bodies))30℃；8)VEGFvNAR v19不可溶胞质部分(内含体(Inclusion bodies))37℃

图9为对应具有信号肽的VEGFvNAR v32R不可溶胞质部分A：增溶(Solubilization)所添加的蛋白质，以及于HisTrap FF粗1ml亲和层析柱(HisTrap FF crude 1ml affinity columns)以快速蛋白液相层析法(FPLC)(柱上重新折叠(on-column refolding))层析；B：通过丙烯酰胺凝胶电泳(15％SDS-PAGE)分析

图10为对应不具有信号肽的VEGFvNAR v32R不可溶胞质部分A：增溶(Solubilization)所添加的蛋白质，以及于HisTrap FF粗1ml亲和层析柱(HisTrap FF crude 1ml affinity columns)以快速蛋白液相层析法(FPLC)(柱上重新折叠(on-column refolding))层析；B：通过丙烯酰胺凝胶电泳(15％SDS-PAGE)分析

图11为对应具有信号肽的VEGFvNAR v19不可溶胞质部分A：增溶(Solubilization)所添加的蛋白质，以及于HisTrap FF粗1ml亲和层析柱(HisTrap FF crude 1ml affinity columns)以快速蛋白液相层析法(FPLC)(柱上重新折叠(on-column refolding))层析；B：通过丙烯酰胺凝胶电泳(15％SDS-PAGE)分析

图12为对应不具有信号肽的VEGFvNAR v19不可溶胞质部分A：增溶(Solubilization)所添加的蛋白质，以及于HisTrap FF粗1ml亲和层析柱(HisTrap FF crude 1ml affinity columns)以快速蛋白液相层析法(FPLC)(柱上重新折叠(on-column refolding))层析；B：通过丙烯酰胺凝胶电泳(15％SDS-PAGE)分析

图13为间接酶联免疫吸附试验(Indirect ELISA)，装载(upholstered)200-300ng/well的rhVEGF。一级抗体vNAR V13、V19或V32R，预产物(preps B)，通过柱上重新折叠纯化。对照组：通过柱上重新折叠纯化支一级抗体vNAR(1mg/ml)。二级抗体：兔子抗-HA 1:1000，三级抗体：山羊抗-兔子-HRPO 1:1000。对照组+抗-VEGF(Abcam)，500或50ng/well。使用TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine))显影，测量450nm通过吸亮度。

图14为免疫印迹(Western-Blot)分析。rhVEGF样本(500ng)及BSA对照组(5000ng)的丙烯酰胺凝胶电泳(15％SDS-PAGE)。B：电印迹(Electroblotted)至硝化纤维素膜，以及随后使用对应的vNAR(10μg)，抗-His(1:3000)加上结合至过氧化物酶的抗-老鼠二级抗体(1:3000)进行杂合。通过增强化学发光(ECL)显影。

图15为U937细胞(10⁶)的流式细胞仪检测(Flow cytometry)；细胞在其膜中被通透化(permeabilized)，且以VEGFvNAR1处理，名为SP-VEGFvNARORF-6His-HA，在此例中，V13(可溶胞外)+抗-HIS抗体(1:200)+山羊抗-兔子-alexa fluor 488抗体(1:200)。a)VEGFvNAR1胞外。b)对照组抗-VEGF(Abcam)。

图16为U937细胞(10⁶)的流式细胞仪检测(Flow cytometry)；细胞在其膜中被通透化(permeabilized)，且以VEGFvNAR2处理，在此例中，名为SP-VEGFvNARORF-6His-HA，V13(重新折叠的不可溶胞质部分)+抗-HIS抗体(1:200)+山羊抗-兔子-alexa fluor 488抗体(1:200)。A)VEGFvNAR2(重新折叠)。B)对照组抗-VEGF(Abcam)。

图17为VEGF的6ns模拟期间所测量的均方根误差(Root Mean Square Deviation,RMSD)值。Y轴代表RMSD及X轴代表动力学的步骤编号(每一步骤为2皮秒)。

图18为VEGF残基(residues)的平均波动(Average fluctuations)。Y轴代表RMSD及X轴代表残基的编号。

图19为重叠VEGF动力学模拟的初始(灰色)及最后(青色)结构。

图20为vNAR V19的5ns模拟期间所测量的均方根误差(Root Mean Square Deviation,RMSD)值。Y轴代表RMSD及X轴代表动力学的步骤编号(每一步骤为2皮秒)。

图21为vNAR V19残基(residues)的平均波动(Average fluctuations)。Y轴代表RMSD及X轴代表残基的编号。

图22为重叠vNAR V19动力学模拟的初始(灰色)及最后(青色)结构。

图23为vNAR V32R的20ns模拟期间所测量的均方根误差(Root Mean Square Deviation,RMSD)值。Y轴代表RMSD及X轴代表动力学的步骤编号(每一步骤为2皮秒)。

图24为vNAR V32R残基(residues)的平均波动(Average fluctuations)。Y轴代表RMSD及X轴代表残基的编号。

图25为vNAR V32R结构的影像，通过色彩显示于动力学仿真期间的波动，从红色(具有较大可动性的区域)至蓝色(较为静态)。

图26为重叠vNAR V32R动力学模拟的初始(灰色)及最后(青色)结构，可以深蓝色强调动性最大的区域。

图27为vNAR V32R的动力学模拟的每一瞬间的结合自由能值(每一步骤为2皮秒)。Y轴代表全局能量(global energy)单位为kcal/mol及X轴代表动力学的步骤编号。

图28为vNAR V32R于动力学仿真期间所达到的密度能量(Density energy)值。Y轴显示密度及X轴显示全局能量(global energy)单位为kcal/mol。虚线代表与分布相关的高斯函数(Gaussian function)。

图29为VEGF(以绿色和青色连接)与vNAR V19(以洋红色连接)的复合体(complex)的模式1。

图30为VEGF(以绿色和青色连接)与vNAR V19(以洋红色连接)的复合体(complex)的模式2。

图31为VEGF(以绿色和青色连接)与vNAR V19(以洋红色连接)的复合体(complex)的模式3。

图32为VEGF(以绿色和青色连接)与vNAR V19(以洋红色连接)的复合体(complex)的模式4。

图33为VEGF(以绿色和青色连接)与vNAR V19(以洋红色连接)的复合体(complex)的模式5。

图34为复合体对照组(2Z8V)的交互作用的地图。该图显示V19同源物(homolog)(垂直标示的D链)以及其受体(水平标示的A链)之间的交互作用。色阶是基于交互作用能量的值：颜色较红是表示较为良好的交互作用，以及颜色较蓝是表示较不良好的交互作用。

图35a、35b、35c、35d、35e为VEGF-V19复合体的交互作用的地图。该图显示V19(垂直标示的C链)以及其受体(水平标示的A链及B链)之间的交互作用。色阶是基于交互作用能量的值：颜色较红是表示较为良好的交互作用，以及颜色较蓝是表示较不良好的交互作用。

图36为VEGF(以绿色和青色连接)与vNAR V32R(以洋红色连接)的复合体(complex)的模式1。

图37为VEGF(以绿色和青色连接)与vNAR V32R(以洋红色连接)的复合体(complex)的模式2。

图38为VEGF(以绿色和青色连接)与vNAR V32R(以洋红色连接)的复合体(complex)的模式3。

图39为VEGF(以绿色和青色连接)与vNAR V32R(以洋红色连接)的复合体(complex)的模式4。

图40a、40b、40c、40d为VEGF-V32R复合体的交互作用的地图。该图显示V19(垂直标示的C链)以及其受体(水平标示的A链及B链)之间的交互作用。色阶是基于交互作用能量的值：颜色较红是表示较为良好的交互作用，以及颜色较蓝是表示较不良好的交互作用。

图41为VEGF的双硫桥键(Disulfide bridges)。

图42为vNAR V19的双硫桥键(Disulfide bridges)。

图43为vNAR V32R的双硫桥键(Disulfide bridges)。

图44为多重序列比对。

图45为V19(黄色)结合至VEGF(绿色)的抗原结合部位(CDRs)(洋红色)的呈现。

图46是为V19与VEGF的抗原结合部位区域的更为重要的交互作用。a)V19的ARG101与VEGF的GLU17。b)GLU103与ARG10。

图47为V32R(黄色)结合至VEGF(绿色)的抗原结合部位(CDRs)(洋红色)的呈现。

图48为V32R与VEGF的抗原结合部位区域的更为重要的交互作用。a)V32R的GLU98与VEGF的ARG43及GLN24。b)V32R的LYS95与VEGF的GLU25；ARG100与GLU54；TYR104与CYS55。

图49为原位(in situ)重新折叠HisTrap应用模板(HisTrap application template)的理论梯度。总分离时间＝160分钟+样本的应用时间。

图50为实验的设计。系显示于96孔ELISA盘中测试的vNAR抗体浓度(为进行4重复，需要A-H行，1-12栏)，以及在整个实验中是使用阳性对照(positive control)及阴性对照(negative control)。

图51为显示在使用抗体的情况下管状结构长度(tube length)分析的曲线下面积的平均加上标准偏差的直方图：(A)参考抗体*；(B)V13**；(C)V32R；(D)V19。*兰尼单抗(Ranibizumab(Genentech/Roche))。**参考专利US8,496,9335中的克隆。

图52为显示在使用抗体的情况下分支点(branching points)分析的曲线下面积的平均加上标准偏差的直方图：(A)参考抗体*；(B)V13**；(C)V32R；(D)V19。*兰尼单抗(Ranibizumab(Genentech/Roche))。**参考专利US 8,496,9335中的克隆。

图53为VEGF及vNAR V32R抗体在网络形成的效果的图像。未经处理的对照组(A)在14天的测试的过程中，显示最小的管状结构形成。相对于对照组，使用VEGF 4ng/mL显示管状结构形成的增加(B)。可观察到，V32R抗体的浓度越高，管状结构形成则越低(C-H)。

图54为VEGF及vNAR V19抗体在网络形成的效果的图像。未经处理的对照组(A)在14天的测试的过程中，显示最小的管状结构形成。相对于对照组，使用VEGF 4ng/mL显示管状结构形成的增加(B)。可观察到，V19抗体的浓度越高，管状结构形成则越低(C-H)。

图55为VEGF及vNAR V13*抗体在网络形成的效果的图像。未经处理的对照组(A)在14天的测试的过程中，显示最小的管状结构形成。相对于对照组，使用VEGF 4ng/mL显示管状结构形成的增加(B)。可观察到，V13抗体的浓度越高，管状结构形成则越低(C-H)。*参考专利US 8,496,9335中的克隆。

图56为VEGF及参考抗体*在网络形成的效果的图像。未经处理的对照组(A)在14天的测试的过程中，显示最小的管状结构形成。相对于对照组，使用VEGF 4ng/mL显示管状结构形成的增加(B)。可观察到，参考抗体的浓度越高，管状结构形成则越低(C-H)。*兰尼单抗(Ranibizumab(Genentech/Roche))。

具体实施方式

本发明是关于名为IgNAR(通过新抗原受体的缩写)的基于鲨鱼的治疗用单株抗体的生成，其包含免疫球蛋白的重链。特别地，本发明是关于这些重链的可变区域(vNARs)的选择。在此情况下，其特性在于具有辨识名为血管内皮生长因子(VEGF)的细胞因子的能力。由于生物学及生物物理学上的特性，vNARs在生物技术领域中受到关注。所述vNAR抗体对于环境具有高度的抗性，且对于局部治疗作用具有的高度潜力。同时，由于具有衍生自骆驼的免疫球蛋白(名为V_HH)的可变结构域，vNARs为具有辨识抗原能力的最小生物分子。由于这些特性，vNARs克服了传统单株抗体治疗的缺点与不足。

本发明是关于蛋白质的选择、分离及纯化，所述蛋白质属于名为V_HNAR或vNAR的可变区，其是源自具有抗原受体能力的板鳃亚纲生物的IgNAR-型免疫球蛋白。所述蛋白质的来源克隆名为VEGFvNAR V32R及V19，以及相应抗体名为V32R及V19(也被定义为v19或v32R)。

本发明也关于基于vNAR的生物制药的研发，由于其是对于血管内皮生长因子(VEGF)具有高度且非常专一性的亲和力，其可阻碍VEGF。针对所产生的分子，已进行不同的分离及纯化程序。其特性在于例如：序列及三维空间结构的固有性质，以及对于目标分子的亲和力与辨识能力，这使得其相较于其他相关分子具有更有效率的中和能力。

用于选择克隆的载体为：pCOMb3X，其对于氨苄青霉素(Ampicillin)及羧芐青霉素(Carbenicillin)具有抵抗力。生产菌株(production strain)为ER2537，以及所使用的表达菌株(expression strains)为TOP10F’及BL21(DE3)，因为蛋白酶的缺乏对于改善产率具有贡献，后者被选择用于表达。

在实施例1中，说明通过噬菌体呈现进行免疫接种的V19及V32R克隆来源样本的基因库的获得，也说明现有技术中提及的V13克隆，其是用于比较V19及V32R的特性。使用vNAR蛋白进行ELISA，其是从TOP10F’所表达的周质间隙(periplasmic space)中选择。在用于表达及辨识抗-VEGF vNAR的ELISA结果中，通过对于VEGF的亲和力筛选克隆，并随后获得每一克隆的序列。

为了证明新颖的克隆并非实验室手段(laboratory artifice)，且其实际上包含了差异性抗体(differential antibodies)，其是令人惊讶且无法预期地提供超越现有技术的技术优势，有关克隆V13特性也被包含于本文中-在前文美国专利8,496,933中被描述-，且为了对结果进行比较，其是被相同地以本发明所研发的分离及纯化程序执行。

用于编码对于VEGF具有专一性的克隆V13的蛋白质的DNA序列如下列所示(于序列表中，标示为SEQ.ID NO:1)。实施例4描述获得该序列的方法：

GCAAGCCTGGACCAAACACCAAGAACGGCAACGAGAGAGACAGGCGAATCCCTGAGCATTAACTGCGTCCTCACTGATACTAGCCATATTTTGTTCGGCACAAAATGGCTCTGGAATAATCCGGGTTCAA

CAGATTGGGAAAGCATAACGATTGGCGGACGATATGCTGAATCAGTCAACAACCAAGCAAAGTCATTTTCTCTGCAAATCAAGGACCTGACAGTTGAAGACAGTGGCACCTATTACTGCAAGCGCAAAC

CATAGGAAGACGCAAAAATCTACTTCCACGCCCATTGGTGAACGGTATAGCTGCGATGGGGTATAGCTCCAGTGACTACGACGGAGCTGGCACCGTGCTGACTGTGAAC

所获得的克隆V13，其特性在于对于人类VEGF具有高度专一性，其氨基酸序列如下列所示(于序列表中，标示为SEQ.ID NO:2)：

ASLDQTPRTA TRETGESLSI NCVLTDTSHI LFGTKWLWNN PGSTDWESIT IGGRYAESVN NQAKSFSLQI KDLTVEDSGT YYCKAQTIGR RKNLLPRPLV NGIAAMGYSS SDYDGAGTVL TVN

图1显示抗-VEGF蛋白vNAR V13的氨基酸序列，标示美国专利8,496,933所描述的保守结构域。

克隆V19是选择自物种斑纹须鲨(Orectolobus maculatus)的针对细胞因子VEGF₁₆₅的第四轮筛选(panning round 4)。

克隆V19(418bp)的质粒DNA序列如下列所示，其对应SEQ.ID.NO.3：

CAACGGGTTGAACAAACACCAAGAACAGCAACAAAAGAGACGGGCGAATCACTGACCATCAACTGCGTCCTAAGAGATGCTAGTTTTGAATTAAAAGACACGGGCTGGTATCGGACAAAATTGGGTTCAACAAATGAGCAGAGTATATCAATTGGCGGACGATATGTTGAAACAGTCAACAAGGGATCAAAGTCCTTTTCTCTGAGAATTAGTGATCTGAGAGTTGAAGACAGTGGCACGTATAAGTGTCAAGCATTCTATTCTCTTCCGTTGGGCGATTACAACTATTCTCTGCTGTTTAGGGGTGAGAAAGGAGCTGGCACCGTGCTGACTGTGAAC

vNAR19(V19)的氨基酸序列对应SEQ.ID.NO.4：

AQRVEQTPRTATKETGESLTINCVLRDASFELKDTGWYRTKLGSTNEQSISIGGRYVETVNKGS

KSFSLRISDLRVEDSGTYKCQAFYSLPLGDYNYSLLFRGEKGAGTVLTVN

克隆V32R(421bp)的质粒DNA序列如下列所示，其选择自采用第四轮免疫接种计划的物种佛氏虎鲨(Heterodontus francisci)，对应SEQ.ID.NO.5：

GCAAGCCTGGACCAAACACCAAGAACGGCAACGAGAGAGACGGGCGAATCCCTGACCATTAACTGCGTCTTCACTGATTCTAGCTGTGGTTTGTGCGGCACATCTTGGTTCCGGAATAATCCGGGTTCAACAGATTGGGAACGCATAACGATTGGCGGACGATATGTTGAATCAGTCAACAAGGGAGCAAAGTCATTTTCTCTGCAAATCAAGGACCTGACAGTTGAAGACAGTGTCACCTATTACTGCAAAGCGCAAGGTCATCGATACTTCAGTAAGGTGTGCGAGCTGCGATGTCCCAGTTACTACTACGACGGAGCTGGCACCGTGCTGACTGTGAAC

vNAR v32R的氨基酸序列对应SEQ.ID.NO.6：

AASLDQTPRTATRETGESLTINCVFTDSSCGLCGTSWFRNNPGSTDWERITIGGRYVESVNKGAKSFSLQIKDLTVEDSVTYYCKAQGHRYFSKVCELRCPSYYYDGAGTVLTVN

图2为对应克隆V13、V32R及V19的序列之间的比对，作为参照，且标示其中的差异。

为了改善先前获得的产率，在本发明的研发期间，进行不同的测试以及表达及纯化的方法，通过检测以便得到表达及纯化蛋白质的最佳条件，并得到对于每一获得的克隆的结合与中和VEGF性能的后续评估。

基因的合成是将编码VEGFvNAR抗体的基因的羧基端融合至6His及HA标记(6His and HA tags)。这一合成的关键特征在于优化用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的密码子(codons)。该合成基因是在二细菌质粒中克隆。其是用于转形合适的大肠杆菌DH5α菌株细胞。表1显示被用于测试V13、V19y V32R的各个序列的重组体。

表1

图3A及图3B所示的使用于产生重组体的表达质粒为pET20b+(vNAR 1及3)，以及pET28a+(vNAR 2及4)。目的序列(sequence of interest)的亚克隆(Subcloning)在载体中表达，其包含信号肽pelB。

VEGFvNAR的克隆是在细菌表达载体(pET20b+)中执行。通过使用特定寡核苷酸(oligonucleotides)的聚合酶链锁反应(Polymerase chain reaction,PCR)，自合成基因中放大以及分离重组抗体的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。通过限制酶(restriction enzymes)的使用，扩增的片段被亚克隆至特定选择的细菌表达载体中，且包含pelB信号，当被表达时，其可引导蛋白质至周质。在合适的大肠杆菌DH5α菌株细胞中转形连接混合物(质体+插入序列(insert))后，获得该克隆。

未包含信号肽pelB的插入目的序列进入载体的亚克隆：并行地执行在细菌表达载体(pET28a+)中的VEGFvNAR克隆，以及自同样的合成cDNA模板执行该抗体的第二亚克隆，该模板是被用于先前的克隆，但此时排除用于引导蛋白质至周质的信号肽。

在pET20b+及pET28a+中，通过在固体培养基(LB琼脂(LB Agar)/氨苄青霉素(Ampicillin))中选择来个别化(individualized)，获得转化体(transformants)，以及通过用于保存的基因结构以及通过序列测定的质粒DNA分析，作为验证方法，选择二转化体。

使用最后一点的纯化的重组DNA，我们后续于如前所述的BL21(DE3)菌株中，转化适合表达蛋白质的大肠杆菌品系。所获得的克隆被个体化，以及其性质通过菌落-PCR(colony-PCR)及琼脂糖凝胶电泳确认。

通过使用阳性克隆，蛋白质的表达被小规模的评估，在二温度下(30℃及37℃)开始50ml的细菌培养，以及二培育时间：16及20小时。为了得到用于制造蛋白质的最好条件，温度及时间的变因被研究。这一试验性研究(pilot study)是基于液体培养基中的细菌培养，其是使用大肠杆菌BL21(DE3)中的生产克隆及表达诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。

培养基进行离心程序，借此将细胞从培养基质中分离。处理该细胞以获得周质部分，一方面，通过蔗糖-介质渗透压冲击(sucrose-mediated osmotic shock)；以及另一方面，使用溶菌酶(lysozyme)、清洁剂(detergent)及超声波处理(sonication)将其溶解，以自其中提取通过离心分离的可溶及不可溶细胞内成分。程序示意图是如图4所示，于实施例3中描述其方法。

在此阶段，于每一不同的细胞部分，分析目标重组蛋白(recombinant protein of interest)的表达量(分泌至培养基质、周质、胞质及内含体的蛋白质)，通过评估于每一细胞部分中的蛋白质量，以及接着确定其功能，也即针对获取自每一部分的蛋白质，评估其对于hVEGF的辨识或专一性结合能力。

所有克隆的重组体，不论是否具有信号肽，皆被实施，保留组胺酸尾巴(histidine tails)以及HA。每一重组体的表达量皆被评估。

vNARs蛋白质的不同位置，分泌或细胞内(可溶或不可溶部分)，皆被分析。表2呈现的结果是对应于vNAR的表达量。这一结果显示，vNAR蛋白质是于内含体中表达，这意味其发生在不可溶细胞内部分中。

细胞外的VEGFvNAR1为原先考虑的最佳候选之一。其是通过电泳识别，但通过ELISA进行亲和力测试的后，我们发现这一蛋白质部分对于目标分子几乎没有亲和力，而不可溶细胞内为最具有活性的部分。实施例2描述生产克隆BL21(DE3)的获得，以及进一步的程序直到进行免疫印迹法(Western blot)及ELISA分析，以测量辨识先前纯化的每一vNAR的表达。

实施例3描述获得亚细胞部分：周质、细胞外以及可溶细胞内及对应于内含体的不可溶细胞内的程序。在每一部分中，测试蛋白质浓度，同时进行免疫印迹法分析。其结果显示于图5至图8。

从所获得的结果中，我们得到信号肽的存在并未于任何部分中改善表达的结论；进一步，于作为内含体的不可溶胞内部分中，信号肽的缺乏改善了所获得的不同vNARs的浓度。

由于活性vNARs蛋白质是通过后续提及的重组方法所获得，其是被发现于内含体中形成，本发明的研发期间中所进行的研究是通过施行特定的替代方法，该方法涉及溶解所述蛋白质，借此解聚(disaggregate)所述蛋白质，以及在无论过程、不牺牲蛋白质对于目标分子的结合能力的情况下，获得纯化状态及可溶的蛋白质。

为了改善先前获得的产率，在本发明的研发期间，进行不同的测试以及表达及纯化的方法，借此检测及得到表达及纯化蛋白质的最佳条件，并得到对于每一获得的克隆的结合与中和VEGF性能的后续评估。

表2

使用于V13分子的第一纯化方法，为名为工作台上重新折叠(On-bench refolding)的方法，基本上，其包含下列步骤：1)通过超声波处理溶解细胞；2)分离内含体；3)使用尿素的缓冲液溶解；4)通过亲和力层析柱或固定化金属离子(TALON^TM)纯化；5)使用包含谷胱甘肽氧化还原系统(glutathione redox system(GSH,G-S-S-G))重新折叠；以及6)洗脱(elution)稳定化的蛋白质，以及使用非变性缓冲液(non-denaturing buffers)使其在透过亲和力层析法(His陷阱(His Trap))的过程中重新折叠。

本发明所包含的替代性方法，名为柱上重新折叠(on-column refolding)(或称原位重新折叠(refolding in situ))，包含下列步骤：1)通过超声波处理溶解细胞；2)分离内含体；3)使用氯化胍(guanidine chloride)溶解，通过于His-Trap管柱上层析来纯化蛋白质，以及使用尿素的变性缓冲液柱上重新折叠(column refolding)；4)洗脱稳定化及重新折叠的蛋白质。使用上述二方法，vNARs将经历变性及重新折叠的过程，以再次获得其三级结构，以下进一步详述其细节。

柱上重新折叠技术的程序的进行，始于经大肠杆菌中表达优化的包含目标序列的质粒。使用包含开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)的设计，其是编码由vNAR抗体以及六个HIS及HA标签所组成的融合蛋白质。这些卷标被融合至该目标分子是必需的，因为其使得所表达的生物系统产物及其后续的纯化可被监控；此时，使用标准化程序，这些卷标的存在并不会以任何方式干扰该分子的性能，且其在后续的生产阶段将被移除。

柱上重新折叠的方法为一种纯化的程序，其是通过固定化金属上的亲和力层析；使用特定用于具有六个His的融合蛋白的亲和力树脂，此时目标蛋白质位于不可溶部分中。在柱上重新折叠程序发生前，该蛋白质系使用氯化胍增溶(Solubilization)。在柱上重新折叠程序期间，该变性蛋白质的样本注入管柱中，其中当保留结合缓冲液(A1)时，该蛋白质是通过亲和力留置于管柱中，请见实施例5。当转换至增溶缓冲液(A2)后，重新折叠梯度(refolding gradient)开始上升至100％。此时，蛋白质重新折叠的程序完成。随后，这一缓冲液系逐渐由洗脱缓冲液(A3)取代，这造成原先结合至亲和力管柱的蛋白质的释放。最后，该包含蛋白质的洗脱部分是通过丙烯酰胺凝胶电泳-SDS(acrylamide gel electrophoresis-SDS)进行分析，以研究其尺寸及组成。

于280nm下具有吸亮度的1ml部分，为增溶形式且通过亲和力管柱固定，以及其是原位(in situ)重新折叠，且随后通过添加咪唑(imidazole)于不同部位来进行洗脱。

这一层析法系统所洗脱的蛋白质，是通过丙烯酰胺凝胶电泳(每一部分15μL)分析，以及通过免疫印迹法来验证其性质。由此回收的样本被建立于20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris HCl)，0.5M NaCl，1mMβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，0.3M咪唑(imidazole)，100mM L-精胺酸(L-arginine)的缓冲液中。这一程序的结果于图9至图12中描述。随后，通过分析其结合至目标分子(人类VEGF A同功型(isoforms)165)的特性，进行抗-VEGF vNAR的功能验证。为了功能验证所进行的分析为ELISA、斑点印迹法(Dot-blot)、免疫印迹法以及流式细胞仪、免疫荧光法(immunofluorescence)及免疫组织化学法(immunohistochemistry)。可以看到反映出较高亲和力的蛋白质为V32R，以及所有蛋白质在亲和力方面皆超越了已授权的美国专利8,496,933中所提及的V13分子。当使用二种不同的程序针对相同的V13分子进行比较，可观察到所获得的改善是通过施行“新颖”的方法所达成。ELISA检测的结果显示于图13。免疫印迹法分析的结果系显示于图14。

图14显示在比较方法中，本发明的vNAR V19及V32对照所获得的V13蛋白质，可辨识VEGF的数量上的差异。新蛋白质V19及V32R，相较于V13，皆显著具有较高的亲和力及辨识能力。

抗-VEGF vNAR分子已被优化，以及其亲和力特性已被显著地提升，因此，其中和能力也被提升，且中和VEGF所需要的vNAR量系被降低。见实施例10。

简言之，在亲和力测试中，我们发现所获得的新的目标分子在亲和力及活性方面，高于美国专利8,496,933中所获得的分子。

通过流式细胞仪检测，对于纯化及重新折叠的vNARs进行功能验证。为达这一目的，使用可表达不同细胞因子(cytokines)及趋化因子(chemokines)的U937细胞株，该细胞株为骨髓系统(myeloid lineage)的单核细胞(monocytes)。VEGF被持续的表达及分泌。这一细胞株为生物医学科学中常用的模型。在细胞内水平的抗-VEGF vNAR V13、V19及V32R的结合能力被测定。该检测在实施例6中被描述。V13的结果显示于图15及图16。

本发明所提供的分子是通过计算机仿真(in silico)了解特性。通过同源模拟法(homology modeling)制备三维结构(三级)，并通过分子动力学模拟(molecular dynamics simulations)精制(refinement)该结构。

透过三个连续的筛选，寻找最佳结构：1)基于其接触模式(pattern of contacts)的复合体分组(complex grouping)；2)每一组别的最佳代表的初步能量分析；3)对于具有较佳能量的二蛋白质-蛋白质复合体(complex protein–protein)进行分子动力学模拟，来寻找最稳定的结合模式。针对最佳结构分析交互作用的能量模式。

分析V19的相近同源物(homologue)与AMA1蛋白质(蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)编号：2Z8V)的交互作用，做为对照组，这为这一型态的交互作用提供了结合自由能(free-energy-of-binding)的参照。

在V19与VEGF分子的情况中，自已被发表的现有的同源物结晶结构中产生最佳结构，在此情况下仅缺失的残基被建模，以及通过分子动力学模拟松弛(relaxed)所得结构。所使用的模拟时间为5-6奈秒(ns)。V19蛋白质的结构源自蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)编号：1VES¹⁹的结晶结构，将丙胺酸111变异(mutating)为缬胺酸。VEGF蛋白质的晶体是自蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)编号：1VPF²⁰获得。

于分子动力学模拟的过程中，测量蛋白质相较于起始结构的方均根偏差(Root-mean-square deviation,RMSD)，借此评价该结构的稳定性。较小的RMSD值代表较为稳定。于全局及残基层级皆进行测量。分析该结构后，获得蛋白质-蛋白质复合体。为此，针对每一复合体，进行多个蛋白质-蛋白质(嵌合)分析，其中评价不同的结合区域及方位，直到确定何者最佳。

VEGF

在动力学模拟的过程中，全局波动值(fluctuation global values)(RMSD)并未超过(图17)，但在此值附近有许多的波动。这一系统为一二聚体(dimer)，其由二组通过一或二转折的α螺旋连接的β折板所组成。这些结构模块(motifs)具有高度可动性，其产生了所述的波动。

除了大约每25个残基坐落的β折板的交互连结环圈(interconnecting loops)之外，一般而言，每一残基的的波动并未超过(图18)。由于其为二聚体(dimer)，该波动模式在二次单元(subunits)中重复。

经迭合，起始结构与最后500皮秒(ps)的仿真的最小化平均结构相符(图19)。

V19

在整体的波动方面，该系统是稳定的。分子动力学模拟过程中，全局RMSD值并未超过(图20)。V19的结构由多个通过循环连结的β折板所组成，这些循环的可动性以及其对于溶剂的重新定向，造成蛋白质的RMSD产生波动。

残基85-100之间的区域的波动值达到除此之外，各残基的波动是低的(图21)，一般而言并未超过此一区域对应于抗体的可变区域，皆由一环圈连接的二β折板所组成，其具有高度弹性，以及其为用于结合至其他蛋白质的辨识位置(recognition site)。

当迭合起始结构与最后500皮秒(ps)的仿真的最小化平均结构时，除了先前提及位于残基85-100的循环之外，可观察到结构之间的相似度(图22)。

V32R

进行同源建模(homology modeling)，并通过分子动力学模拟精制(refinement)。其起始于一基于结构 2Z8V¹⁸及 2I26²¹的模型，使用20奈秒(ns)的模拟时间。于分子动力学模拟的过程中测量相对于起始结构的RMSD值，借此评价所述结构的稳定性，于全局及残基层级皆进行测量。

整体的波动达到在第一奈秒中，该模型移动离开其初始结构，在其余的仿真过程中保持稳定(图23)。

各残基的波动显示，在位于残基40-50及90-110之间的二区域有显著的波动，到达超过之值。一旦对应残基90-110的循环展开(unfolding)，该蛋白质为稳定。剩余的波动在连接β折板的循环及C-末端(C-terminal end)中累积(见图24)。

图25显示呈现vNAR V32R的大可动性的区域的影像。在迭合起始结构与最后500皮秒(ps)的仿真的最小化平均结构中，可发现二结构相似。在残基G89-Y105及R39-R49侦测到波动(图26)。V32R的能量分析显示，该分子最有可能的能量值为-3250Kcal/ml(图27及图28)。

蛋白质-蛋白质嵌合(Protein-protein docking)

使用蛋白质-蛋白质嵌合的技术建立交互作用模型。所获得的结果是经筛选，借此寻找不同的结合区域及最佳方位。该筛选的步骤系如下述：

1)基于其接触模式(pattern of contacts)的复合体分组(complex grouping)，以及移除其中vNARs并非透过抗体辨识循环与VEGF交互作用的解决方案。

2)通过计算自适应泊松-玻尔兹曼解算(Adaptive Poisson-Boltzmann Solver,APBS)研究受体及配体的静电力，以及移除观察到静电冲击(electrostatic shocks)的解决方案。

3)每一组别的最佳代表的初步能量分析。计算其他模型的能量，以及以二蛋白质的接触表面之间的函数校正其值。

4)基于下列条件，选择用于研究的模型：

·总能量值(kcal/mol)

·凡得瓦能量(Van der Waals energy)

·凡得瓦能量以及氢桥的能量(energy of the hydrogen bridges)

V19-VEGF的蛋白质-蛋白质嵌合

为了研究结构、能量稳定性及接触地图(contact map)，经这一筛选程序后，获得5个结合模式(图29-33)，并对其施行分子动力学模拟。

相对于对照组模型的能量比较

为了试图选择出最能表达VEGF及V19之间的结合模式的模型，对照对照组复合体(在2Z8V晶体中的V19同源物)，针对每一模型的交互作用能量，进行比较研究。基于交互作用表面校正所述能量值；由于能量是以总和的方式计算，所获得的数值与所涉及的表面之间，存在显著相关性。另一方面，总能量中包含一库伦项(Coulomb term)；也包含其他与凡得瓦力相关的能量，以及氢桥的强度，以完成总能量之计算。在AMA1-V19同源物复合体的情况中可观察到，当选择人为的实际交互作用时，不具库伦项的能量评价较具区别性。表3的结果中也呈现个别能量。

表3显示所选择的VEGF-V19复合体模型的交互作用能量(kcal/mol)。其是计算分子动力学模拟中最后500皮秒(ps)的最小平均结构的能量值及遮蔽表面(occluded surface)。(E_total：总能量；E_vdw：凡得瓦能量；E_HB：氢桥能量；SASA:溶剂可及的表面区域(solvent accessible surface area))。

表3：所选择的VEGF-V19复合体模型的交互作用能量(kcal/mol)

鉴于上述数据，以及先前章节所研究的结构稳定性，舍弃模型2的VEGF与V19的结合模式。

相对于对照组模型的接触比较

图34显示每一模型的接触矩阵(contact matrices)，以于对照组复合体(在2Z8V晶体中的V19同源物)的接触进行比较。考虑晶体中的V19及其受体之间的交互作用，我们可以说V19中的交互作用具有三个区域(Zone)：区域1，其是对应X-末端(X-terminal end)(残基1-2)；区域2，其是包含残基25-35之间，对应次级辨识循环；以及区域3，其是涉及位置89及103之间的残基，对应主要辨识循环。

在VEGF-V19复合体模型的交互作用地图(interaction maps)中(图35a-35e)，可确认参照对照组中的V19所预期的结合区域的重复。

所有获得的数据及波动模式显示，我们的分子的模型与模型1(图29)相符，其系因模型1在仿真过程中，提供了最佳的结构稳定性及交互作用能量，此外，其具有与对照组复合体(vNAR V19之同源物与AMA1)相似的交互作用模式。

vNAR V32R–VEGF的蛋白质-蛋白质嵌合

隔离涵盖主要方位的4个VEGF与vNAR V32R的结合模式。分析20奈秒的分子动力学模拟过程中的能量，借此确定其结构以及其交互作用地图。为此，我们以VEGF及vNAR V32R经精制(refining)后，所获得的结构作为开始。随后，使用蛋白质-蛋白质嵌合技术，产生交互作用模型。所获得的结果经筛选，借此寻找不同的结合区域及最佳方位，其是依循前述实施例中的程序。

相对于对照组模型的能量比较

为了试图选择出最能表达VEGF及V32R之间的结合模式的模型，对照对照组复合体(在2Z8V晶体中的V19同源物)，针对每一模型的交互作用能量，进行比较研究。基于交互作用表面校正所述能量值；由于能量是以总和的方式计算，所获得的数值与所涉及的表面之间，存在显著相关性。另一方面，总能量中包含库伦项(Coulomb term)；也包含其他与凡得瓦力相关的能量，以及氢桥的强度，以完成总能量的之计算。在AMA1-V19同源物复合体的情况中可观察到，当选择人为的实际交互作用时，不具库伦项的能量评价较具区别性。因此，在本例中此一型态的个别能量被强调。表4显示所选择的VEGF-V19复合体模型的交互作用能量(kcal/mol)。其是计算分子动力学模拟中最后500皮秒(ps)的最小平均结构的能量值及遮蔽表面(occluded surface)。(E_total：总能量；E_vdw：凡得瓦能量；E_HB：氢桥能量；SASA:溶剂可及的表面区域(solvent accessible surface area))。

表4：所选择的VEGF-V32R复合体模型的交互作用能量(kcal/mol)

鉴于上述数据，以及先前章节所研究的结构稳定性，舍弃模型4的VEGF与v32R的结合模式。

相对于对照组模型的接触比较

如同V19-VEGF嵌合之例，每一模型的接触矩阵(contact matrices)系与对照组复合体(在2Z8V晶体中的V19同源物，图34)的接触进行比较。在复合体模型VEGF-V32F的交互作用地图(图40a-40d)的例子中，可期待观察到对照组中的V19的结合区域的重复。

所有获得的数据及波动模式显示，我们的分子的模型与模型3(图38)相符，其系因模型3被认为具有最佳的结构稳定性及交互作用能量参数。此外，其是再现在对照组复合体中所观察到的交互作用模式。基于所有前述数据，可获得额外的信息，更为广泛地支持本发明的分子的特性：

双硫桥(Disulfide bridges)

研究中所处理的蛋白质中所呈现的双硫键(disulphide bridges,SS)揭示如下。特别地，形成双硫桥的半胱胺酸，在FASTA格式(文字为基础的格式，用于呈现核苷酸序列或多肽序列，其中使用单一字母的编码呈现核苷酸或氨基酸)的序列中，被以黄色X标记。下列是叙述各个形成双硫桥的半胱胺酸对。蛋白质是从残基编号1开始编号，且其是连续，即使有链的改变。

VEGF

二聚体在每一次单元中具有3个双硫桥，且具有2个介于次单元之间的双硫桥，共具有8个双硫桥，这意味着16个半胱胺酸(图41及表5)。

>VEGF:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE(SEQ.ID.NO.7):

1

VVKFMDVYQRSYXHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSXVPLMRXGGXXNDEGLEXVPTEE

61SNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKXEXRPK

>VEGF:B|PDBID|CHAIN|SEQUENCE(SEQ.ID.NO.7):

95

VVKFMDVYQRSYXHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSXVPLMRXGGXXNDEGLEXVPTEE

155SNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKXEXRPK

表5

vNAR V19

其为由二组β折板所组成的单体(monomer)，具有单一键结该二组折板的双硫桥，这意味着2个半胱胺酸(22-83)(图42)。

>v19|PDBID|CHAIN|SEQUENCE(SEQ.ID.NO.8):

1

AWVEQTPRTATKETGESLTINXVLRDASFELKDTGWYRTKLGSTNEQSISIGGRYVETVN

61

KGSKSFSLRISDLRVEDSGTYKXQAFYSLPLGDYNYSLLFRGEKGAGTVLTVK

在优化用于在大肠杆菌中生产的密码子(codons)的过程中，序列SEQ.ID.NO.4及SEQ:ID:NO:8中画底线的氨基酸序列有所不同。这并未改变其结构，后续试验所证实的序列为SEQ.ID.NO.4，因此，其为工业规模生产V19的较佳实施例。

vNAR V32R

其为由二组β折板所组成的单体(monomer)，具有单一键结该二组折板的双硫桥，这意味着2个半胱胺酸(24-85)(图43)。

>v32R|PDBID|CHAIN|SEQUENCE(SEQ.ID.NO.9):

1

MAASLDQTPRTATRETGESLTINXVFTDSSCGLCGTSWFRNNPGSTDWERITIGGRYVES

61

VNKGAKSFSLQIKDLTVEDSVTYYXKAQGHRYFSKVCELRCPSYYYDGAGTVLTVNGQAG

121Q

值得注意地，SEQ.ID.NO.9中最后5个画底线的氨基酸为前述的组胺酸标签，且在工业化生产中被移除，因此，V32R的较佳实施例对应SEQ.ID.NO.6。

互补性决定区域(Complementarity Determining Regions,CDRs)

使用局部BLAST服务器(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)的英文缩写)搜寻该抗体的序列，使用非冗余(non-redundant)数据库。这些序列和回收的抗体之间，至少具有70％的相同度(identity)。随后，将由BLAST所获得的序列与抗体序列进行多重比对(multiple alignment)。未达这一目的，使用MAFFT(使用快速傅立叶变换的多重比对(Multiple Alignmentusing Fast Fourier Transform)的英文缩写)软件。

在这一多重比对中，可观察到其是这一类型的抗体中的不可变及可变区域(与CDRs相关)。如图44所示，其明显具有保守区域(conserved regions)、其他半保留(semi-preserved)区域，以及最后的可变区域(variable regions)，其提供专一性。

可观察到2个明显不同的CDRs：

·CDR 1:介于位置45及51之间

·CDR 2:介于位置105及139之间

这些参照全局编号的位置是通过序列组的多重比较所提供。在图45及图47中，显示与V19及V32R有关的CDRs区域的概观。一些CDRs区域与VEGF之间最重要的交互作用的细节，显示于图46a、图46b及图48a、图48b。

体外(in vitro)模型中的抗-血管生成(Anti-angiogenic)活性

vNAR抗体的活性：V13(先前于美国专利8,496,933中被描述)、V19及V32R是通过使用血管生成试剂盒的体外抗-血管生成试验，来进行分析。这一研究的目的在于，确认V13、V19及V32R抗体是否具有抑制血管生成(angiogenesis)的能力以及各抗体之间的差异，如实施例10所述，其对照市售抗体(Genentech/Roche)，分析形成参数以及管的分支情形。

从这一研究中，我们可以断定vNAR V13(先前于美国专利8,496,933中被描述)、V19及V32R抗体对于通过VEGF细胞因子调节的血管形成进程具有抑制能力，其具有与市售抗体(Genentech/Roche)相似的动力学特性(kinetics behavior)(图50～图52)。在所有的例子中，可观察到抗体浓度依赖(antibody concentration-dependent)的血管生成抑制效果。考虑2个参数的抑制值(Inhibition values,(IC₅₀))(表6)显示，相较于V13抗体(先前于美国专利8,496,933中被描述)，V19及V32R皆仅需要少于12分之1的浓度即可对于血管生成产生抑制效果，其与市售对照抗体(Genentech/Roche)的浓度相近。

本发明的实施方式

本发明的目的为提供一种抗-VEGF分子，其可用于治疗或预防糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)或年龄相关的湿性黄斑变性(wet age-related macular degeneration)及涉及VEGF调节之新生血管形成的眼科症状，以及其活性成分系由vNAR蛋白质所构成，该蛋白质系被分离及纯化，其特性在于特定的氨基酸序列、三级结构及显著增加的对于VEGF的亲和力及中和与辨识能力。该vNAR重组蛋白质被称为V13、V19及V32R，以及其氨基酸序列被分别定义为SEQ.ID.NO:2、SEQ.ID.NO:4及SEQ.ID.NO:6，其个别皆为本发明的实施方式。

本发明的实施方式包含但不限于将vNAR V32R及V19蛋白质使用于眼部给药，为涉及新生血管形成现象的病理学过程的治疗及预防提出贡献，该病理学过程可为下列的任一种：视网膜新生血管形成(Retinal Neovascularization)、脉络膜新生血管形成(Choroidal Neovascularization)、角膜新生血管形成(Corneal Neovascularization)、黄斑变性(Macular Degeneration)、年龄相关的黄斑变性(Age-Related Macular Degeneration)、视网膜疾病(Retinal Diseases)、糖尿病性视网膜病变(Diabetic Retinopathy)、玻璃体出血(Vitreous Hemorrhage)、视网膜出血(Retinal Hemorrhage)、脉络膜炎(Choroiditis)、视网膜脱离(Retinal Detachment)、视网膜玻璃膜疣(Retinal Drusen)、新生血管性青光眼(Neovascular Glaucoma)、脉络膜疾病(Choroid Diseases)、葡萄膜炎(Uveitis)、近视(Myopia)、眼部疾病(Eye Diseases)、真菌性眼部感染(Fungal Eye Infections)、微血管扩张(Telangiectasia)、视网膜动脉阻塞(Retinal Artery Occlusion)、退化性近视(Degenerative Myopia)、视网膜静脉阻塞(Retinal Vein Occlusion)、脉络膜视网膜炎(Chorioretinitis)、组织胞浆菌病(Histoplasmosis)、葡萄膜疾病(Uveal Diseases)、德国麻疹(Rubella(German Measles))、眼部弓形虫病(Ocular Toxoplasmosis)、视网膜上膜(Epiretinal Membrane)、缺损(Coloboma)、脉络膜肿瘤(Choroid Neoplasms)、视网膜变性(Retinal Degeneration)、视网膜炎(Retinitis)、视网膜穿孔(Retinal Perforations)、疱疹性角膜炎(Herpetic Keratitis)、早产儿的视网膜病变(Retinopathy of Prematurity)、黄斑囊样水肿(Cystoid Macular Edema)、视乳头水肿(Papilledema)、葡萄膜脑膜脑炎综合症(Uveomeningoencephalitic Syndrome)、视盘玻璃膜疣(Optic Disk Drusen)、血管样纹(Angioid Streaks)、视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa)、视力异常(Vision Disorders)、交感性眼炎(Sympathetic Ophthalmia)、疤痕(Scar)、眼部烧伤(Ocular Burns)、复发性缺血(Recurrent Ischemia)、眼部外伤(Eye Injuries)、青光眼(Glaucoma)、眼部出血(Eye Hemorrhage)、盲点(Scotoma)、后葡萄膜炎(Posterior Uveitis)、真菌血症(Fungemia)、视网膜肿瘤(Retinal Neoplasms)、角膜疾病(Corneal Diseases)、色素失禁(Pigmentary Incontinence)、血红蛋白C疾病(Hemoglobin C Disease)、纤维化(Fibrosis)、角膜浑浊(Opacity of the Cornea)、前葡萄膜炎(Anterior Uveitis)、前房出血(Hyphema)、节结病(Sarcoidosis)、晶状体缺失症(Aphakia)、医源病(Iatrogenic Disease)、全葡萄膜炎(Panuveitis)、眼部白内障(Eye Cataract)、手术后并发症(Postoperative Complications)、镰状细胞贫血(Sickle Cell Anemia)、视网膜血管炎(Retinal Vasculitis)、骨肿瘤(Osteoma)、巨细胞病毒性视网膜炎(Cytomegalovirus Retinitis)、萎缩症(Atrophy)、静脉炎(Phlebitis)、圆锥角膜(Keratoconus)、史德格-韦伯症候群(Sturge-Weber Syndrome)、病毒性眼部感染(Viral Eye Infections)、眼部畸形(Eye Abnormalities)、物质滥用疾患(Substance-Related Disorders)、眼球穿通外伤(Penetrating Eye Injuries)、第二型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 2)、辐射损伤(Radiation Injuries)、镰状细胞特征(Sickle Cell Trait)、假晶状体(Pseudophakia)、色素痣(Pigmented Nevus)、增殖性玻璃体视网膜病变(Proliferative Vitreoretinopathy)、出血(Bleeding)、第一型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 1)、痣(Nevus)、视神经疾病(Optic Nerve Diseases)、血管疾病(Vascular Diseases)、念珠菌感染(Candidiasis)、化学烧伤(Chemical Burns)、小眼症(Microphthalmia)。

本发明的另一实施例关于表达这些vNAR的各个细菌克隆，其用于工业规模生产，包含名为VEGFvNAR v32R及VEGFvNAR v19的大肠杆菌克隆，其表达vNAR V32R及V19。

本发明的其他实施方式关于编码vNAR V32R及V19的质粒载体(plasmid vectors)，其特性在于所述的载体中包含vNAR V32R及V19的编码序列。

本发明的实施方式包含vNAR V32R及V19蛋白质用于制备预防或治疗疾病的药物的用途，该疾病需要中和VEGF的活性，以及该药物可用于眼科用途。

本发明的实施方式为眼科药物组合物，其特性在于包含药学上正确剂量的本发明的vNAR蛋白质，其作为活性成分，以及其特性在于基础组成或载体提供必要的稳定性及对于蛋白质的保护。

下列所提供的实施例用于左证在此提及的生物制药的功效；这些实施例是示例性的，且并未限制本发明的范围。

实施例

实施例1：免疫库的生产及对于VEGF具有专一性的vNAR克隆的选择

第一步为鲨鱼样本的免疫接种，使用在磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline,PBS)中的1μg蛋白质，通过静脉注射人类重组细胞因子VEGF₁₆₅，持续20周的免疫接种程序。最初的二个免疫接种也包含完全形式的弗氏佐剂(Freund's adjuvant)；在同一期间中，免疫学上的激发(challenges)每隔15天进行。在每一次免疫强化后，我们从尾静脉(caudal vein)进行1mL的静脉抽血(phlebotomies)；这一血浆储存于-20℃。

下一步骤为自样本的脾脏提取总体RNA，其于最后一次免疫接种的7天后进行解剖，遵循苯酚-氯仿RNA提取(phenol-chloroform RNA extraction)的标准程序，以及自异丙醇中沉淀，结果获得1.2μg/mL的总体RNA；通过分光光度法(spectrophotometry)测试其纯度。

随后，使用传统方法进行逆转录(retrotranscription)(RT-PCR)，使用初始浓度20μM的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide)GTTCACAGTCAGCACGGTGCCAGCTC(SEQ.ID.NO.10)，以及1μg的总RNA。形成大约620碱基对(bp)的片段，透过2％琼脂凝胶可视化(visualized)，使用溴化乙锭(ethidium bromide)染色，进行PCR反应来得到双链DNA。

为了得到双链DNA，我们也使用下列7个有义寡核苷酸(sense oligonucleotide)的混合物：GCACGGCTTGAACAAACACC(SEQ.ID.NO.11)、CAACGGGTTGAACAAACACC(SEQ.ID.NO.12)、ACAAGGGTAGACCAAACACC(SEQ.ID.NO.13)、GCAAGGGTGGACCAAACACC(SEQ.ID.NO.14)、GCATGGGTAGACCAAACACC(SEQ.ID.NO.15)、GCAAGCCTGGACCAAACACC(SEQ.ID.NO.16)、GCATTGACGGACCAAACACC(SEQ.ID.NO.17)。

有义及反义寡核苷酸皆具有一额外的序列，赋予其对于限制酶SfiI的识别位(recognition site)。放大的片段是通过电泳方法分析，以50ng/μL的最终浓度，使用2％琼脂凝胶及溴化乙锭，(100伏特下，30分钟)。根据所使用的寡核苷酸组(oligonucleotide set)，片段的大小与预期大小相符，(从大约320-350bp切下凝胶)。随后使用一特定的试剂盒，自凝胶中提取DNA。重复此一程序，直到获得足够份量的DNA。

随后，酶切(digested)纯化的DNA片段，其通过PCR方法获得，对应vNAR基因，每一微克(μg)的DNA使用5U的限制酶SfiI进行酶切，于50℃培养5小时。该混合物被去活性并储存于-80℃。

后续步骤为制备克隆载体，质粒表达载体pCOMb3X，其具有2个限制酶SfiI的切割位(cut sites)，借此克隆的vNAR表达于噬菌体(phages)(噬菌体呈现)。酶切产物于1％琼脂凝胶上纯化，回收受切割的载体，并得到二个片段，其一约为3500bp，以及另一约为1500bp。

第一个片段对应于二个酶切位点(digestion sites)皆被酶切的载体，以及第二个片段对应于所得的填充片段(staffer fragment)。其于1％琼脂凝胶上可视化，并切下凝胶上的二条带(bands)，随后透过提取DNA研磨-冷冻(trituration-freezing)。其被纯化，并通过在260nm下的分光光度法定量。

随后，我们接着以小规模进行V_HNAR片段及pCOMb3X载体的连接(ligation)，以确认酶切片段的所有条件，以及后续以大规模进行上述程序。使用T4DNA连接酶，以1:1的摩尔比完成vNAR插入片段(insert)与pCOMb3X载体之间的连接。不具填充片段的经酶切的载体，使用及不使用T4连接酶，被用来作为阴性对照组，以确认载体并非与自身连接。此外，使用经酶切的载体且不使用T4连接酶制作一对照组，以确认载体被良好的酶切。

遵循标准方法，通过电穿孔(electroporation)电感受态细胞(electrocompetent cells)大肠杆菌ER2537(200Ohms，2.5kV，4ms)确认连接的效果，其包含在最后连续3次稀释，接种电感受态大肠杆菌于LB琼脂的培养皿之上，并获得菌落形成单位(colony-forming units,CFU)。考虑CFU的数量以及连接、培养及接种量，计算免疫库的大小。

所获得的VEGF₁₆₅免疫库大小为6.36×10⁸CFU/mL，(大规模)，这可以被认为在免疫接种程序后，通过鲨鱼产生了变异性。阴性对照组中，在具有氨芐霉素(ampicilin)(最终浓度20μg/mL)的LB琼脂培养基上没有菌落生长。

通过培养经电穿孔的细胞进行初步的免疫库放大，遵循传统的方法，使用助手噬菌体(helper phage)VCSM13，在包含氨芐霉素与卡那霉素(kanamycin)的SB培养基中培养隔夜，随后通过离心取得，以及上清液的储存预先通过过滤灭菌。在初步的免疫库放大之后，进行4轮选择，以获得噬菌体-抗体，在ELISA盘上使用VEGF(于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中1μg)(预先培养以及使用PBS中BSA 3％阻断)，从而5g/mL的细胞因子VEGF及50μL的3％BSA被放入每一盘孔中进行接触(每一稀释)，在阴性对照组中作为抗原。因此，在盘孔中的细胞因子保持固定。50μL的噬菌体于37℃培养1小时，针对4轮中的每一者(分别地)，对于每一盘孔使用Tween 0.05％-PBS 1X，进行5、10、15及20收敛剂洗涤(astringent washes)；通过使用这一程序，我们预期所选择的噬菌体将对于VEGF抗原更具有专一性。随后，自第3轮及第4轮中所获得的噬菌体被使用，此时于大肠杆菌TOP10F′的菌落中；通PCR确认插入序列(insert)的存在，以及接着进行vNAR蛋白质的诱导表达，随后，使用渗透压冲击(osmotic shock)的方法，自大肠杆菌的周质部分(periplasmic fractions)提取vNAR蛋白质，以及其通过镍离子亲和力层析法(affinity chromatography to nickel)纯化；进行ELISA，以确定所预期的其对于VEGF的亲和力。整体程序的产率并非最佳的，这可能归因于内含体(Inclusion bodies)的组成包含了不可溶或非活性蛋白质的聚集；这些蛋白质无法通过进行周质部分提取而得到提取，或归因于ELISA无法检测这些产量层级。

实施例2：抗-VEGF的表达细胞vNAR BL21(DE3)的制备，后续处理以及通过ELISA确认vNAR的辨识能力

为了确认所选择的克隆的产物的表达以及其对于目标分子VEGF的专一性辨识能力，50mL的BL21(DE3)细胞培养物被诱导，通过质粒pET-20b(+)(不具有信号肽)及pET-28a(+)(具有信号肽)修饰(modified)，其分别地具有V13、V19及V32R。个体化(individualized)所获得的克隆，并通过菌落PCR(colony-PCR)的方法及通过琼脂凝胶上的电泳分析，以确认阳性克隆。于包含氨芐霉素(ampicilin)(pET20b+克隆)或卡那霉素(kanamycin)(pET28a+克隆)选择性LB液态培养基中，制备阳性克隆的标准培养，并将我们所得的培养克隆保存于15％甘油中，以将其于-80℃中保存。

我们通过SDS-PAGE及透过免疫印迹法(immunoblotting)(免疫印迹法)来研究目标蛋白质的过度表达，其使用抗-His或抗-HA抗体及共轭过氧化物酶的二级抗体，以及使用特定的基质TMB显影。

另一方面，我们接着评量小规模(先导测试(pilot trials))的蛋白质表达，以及随后自所得的阳性克隆进行大规模评价，首先培养转型(阳性)的BL21(DE3)细菌，其于包含抗体的LB培养基于37℃下进行，直到达到最适合的密度(0.6-0.8)，该密度为我们在先前测试中认为最适合的。添加表达诱导物IPTG 0.8mM，以及于最适条件的温度(30℃)进行表达，并维持20-22小时的时间。我们接着自这些培养物中所获得的细胞颗粒(pallets)中进行纯化，其通过缓冲液及超声波，以及随后我们自不可溶部分中分离内含体；纯化包含通过固定化的金属进行亲和力层析法，相对应的树脂对于融合6个His的蛋白质具有亲和力。一旦蛋白质被增溶，我们接着通过先前所提及的柱上(On-column)方法进行蛋白质的折叠。

为了验证透过此依程序所获得的vNAR蛋白质的功能性，进行间接ELISA检测、免疫印迹法及流式细胞仪检测。

为了进行ELISA测试，我们于盘上装载(upholster)实验室所生产的50μL,300ng/well的rhVEGF抗原(重组的人类血管内皮生长因子，版本165)，我们也使用市售等效的抗原(的重组人类VEGF165)。装载系使用相同的结果进行，2小时/37℃或于4℃12-16小时。使用牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)做为检测的阴性对照组，即便于不具有抗原的盘孔中也被使用。在吸收之后，使用150μl PBS-5％脱脂牛奶来阻断盘孔(于4℃16小时或于室温2小时)，并使用PBS-Tween 0.05％将盘洗涤；随后将于150μl PBS-5％脱脂牛奶中制备的稀释的vNAR 150-50μl加入盘孔(每一盘孔所添加的vNAR的介于0.1至15μg之间)，并于室温中培养2小时。使用PBS-Tween洗涤4次之后，使用二级抗体侦测融合至该vNAR的标签：6His或HA，借此检测保留于孔盘中的vNAR抗体。其使用抗组胺酸标签(抗6His)的单株抗体或为抗-HA多克隆抗血清(polyclonal antiserum)，于PBS-5％脱脂牛奶中稀释，稀释比例介于1:3000至1:1000(每一盘孔50μl)。所述盘被培养及洗涤，以及添加共轭过氧化物酶的抗体用于显影：在具有抗-HA多克隆的盘孔中，其为山羊抗-兔子IgG抗血清，或者在具有抗6His的单株抗体，期为抗-老鼠IgG抗血清。所述盘于室温中培养30-45分钟，使用PBS-Tween广泛地洗涤，添加100μl的TMB至盘孔中，作为过氧化酶的基质。在短暂的培养后，通过添加50μl的3N硫酸(H₂SO₄)至盘孔中，来停止反应。于Multiscan Plus(Flow)分光光度计中，测量氧化邻苯二胺(oxidized o-phenylenediamine,OPD)的光学密度(λ＝450nm)。

市售可辨识人类同功型(isoform)VEGF165的抗-VEGF单株抗体(自Abcam的老鼠的抗-VEGF单株抗体)以1:1000稀释，以及一共轭过氧化物酶兔子抗-老鼠IgG抗血清，被用来作为阳性对照组。

图13显示ELISA检测的结果，其中克隆V32R及V13蛋白质所增加的表达，明显地超越了克隆V19。

实施例3：次细胞部分的分离

这一测试的标准程序，首先通过使用IPTG(0.8mM最终浓度)诱导，于30℃或37℃培养细菌16-20小时。该培养物随后通过离心处理，以分离细胞及培养基质。这些细胞被使用温和的渗透压冲击处里，其通过蔗糖作为介质，以获得细胞外基质，周质部分的蛋白质；或者使用溶菌酶溶解、清洁剂及超声波，以自其中提取通过离心分离的可溶及不可溶细胞内成分。藉由在SDS-PAGE中研究目标蛋白质的过度表达，实际对于每一部分进行评估，其通过考马斯蓝(Coomassie blue)染色，以及通过血清学方法进行特定的侦测，具体而言，其通过使用抗“标签”的单株抗体(抗-His或抗-HA)及共轭过氧化物酶之二级抗体的免疫印迹法。

实施例4：抗-VEGF vNAR的氨基酸序列的定序

纯化具有反应能力的克隆的蛋白质，以于实验室中得到序列(Seqxcel Laboratory,San Diego,CA,EEUU)，混合物根据建议条件使用引子Ompseq制备，由于载体pCOMb3X具有对于此一寡核苷酸具有互补序列，使用Mac Vector7.2.软件获得对于VEGF的特定序列；这包含了序列表中的序列，其为：SEQ.ID NO:3,SEQ.ID NO:4(克隆V19)以及SEQ.ID NO:5及SEQ.ID NO:6(克隆V32R)。

实施例5：原位(in situ)重新折叠：柱上重新折叠

目标蛋白质的胞质部分被发现大部分形成内含体，易于在细菌溶解后，通过离心提取物加以分离。通过GE Healthcare^MR原创，称为柱上重新折叠的方法，回收目标蛋白质，其需要增溶的蛋白质。因此，必须在蛋白质形成内含体的部分中应用氯化胍(guanidine chloride)。

为进行柱上重新折叠程序，我们首先进行缓冲液的制备，其pH值皆为8.0。于添加100mM L-Arg之后：结合缓冲液(A1埠)：以6M氯化胍为基础，增溶缓冲液(A2埠)：以6M尿素为基础，以及洗脱缓冲液(A3埠)及重新折叠缓冲液(B埠)：其皆包含三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、氯化钠(NaCl)、咪唑(imidazole)以及2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)。所有的缓冲液都包含咪唑，其在结合缓冲液中的作用为减少蛋白质的非特定结合，这是那些缺少组胺酸尾端及参与其洗脱的蛋白质。

我们接着制备样本(先前使用氯化胍增溶的蛋白质)，其通过调整结合结合缓冲液的组成成分，隔夜漩涡震荡，稀释或重新悬浮结合缓冲液中的内含体。

我们继续系统及层析法的制备：在设置AKTA-prime装置及选择的管柱(His Trap 1ml FF crude,GE Healthcare)之后，Application Template柱上重新折叠His陷阱方法在该系统中被选用。进行缓冲液的交互置换或留置缓冲液于馆柱中。该样本在进行层析法之前，透过0.45微米的筛选。

图49显示通过使用重新折叠缓冲液的选用方法的梯度图，显示不同的程序阶段以及运行时间。包含洗脱蛋白质的部分通过于280nm的吸亮度侦测。

实施例6：流式细胞仪分析

U937细胞株被用来作为模型细胞，以分析vNAR抗体与VEGF的活性。预先被固定及渗透化的1,000,000个细胞，被用来在室温下与选择的vNAR抗体培养30分钟，其根据制备方法及vNAR的特定活性，以不同的比例稀释。在使用pH值7.4的PBS洗涤多次之后，将所述细胞与抗-6xHis单株抗体培养，随后适当的洗涤，以及与共轭至Alexa Fluor 488的抗体培养。再经标签化(labeling)后，使用PBS洗涤所述细胞，以及最后将其重新悬浮于体积250μl的PBS。使用流式细胞仪，计量经荧光标签的细胞。使用市售抗-VEGF单株抗体及同样的共轭二级抗体，作为阳性对照组。所述细胞根据其尺寸(前向散射(forward scatter)或FSC：“前向角度光散射(forward-angle light scatter)”)以及根据其复杂度(侧向散射(side scatter)或FSC：“侧向角度光散射(side-angle light scatter)”)于“位图”中被识别。通过FL1侦测器收集荧光物质Alexa Fluor 488的辐射。荧光强度的放大检测器系根据未经初级vNAR抗体处理的U937细胞调整为介于10⁰-10¹之间(阴性对照组)。

实施例7：热稳定性

制备不同等分式样(aliquots)的vNAR，并将其在不同温度向培养数天(介于3至7天)，以评估其短期热稳定性。典型地，研究温度系为37℃(1小时)、室温、4℃、0℃、-20℃及-80℃。于-20℃及-80℃的冷冻是快速的，且于乙醇-干冰浴中进行。在培养期间之后，所述样本被离心，以去除于该期间中所产生的集合体。于-20℃及-80℃的冷冻样本，在离心前于冰上解冻。针对这先样本的上清液，使用15％SDS-PAGE进行变性。在使用考马斯蓝(Coomasie blue)染色之后，分析不同培养情况下可溶性蛋白质的损失，其因集合体的形成所致。

实施例8：质谱仪分析

为了通过质谱仪进行身分分析，vNAR的准备工作是使用15％SDS-PAGE进行变性。在使用考马斯蓝(Coomasie blue)染色之后，自凝胶切割vNAR条带，并通过基质辅助雷射解析电离-飞行时间-飞行时间(MALDI-TOF-TOF)质谱仪进行分析。这一系统可通过测定酵素酶切所形成的多肽的确切质量，来分析蛋白质的身分。此外，该系统可通过串连飞行时间(time-of-flight)(TOF/TOF)，更为精确的测定蛋白质的身分及特性，该技术使分离及片段化目标分子离子，以及获得蛋白质片段的离子质量的测量值。使用50％乙腈(acetonitrile)洗涤凝胶片断。随后，该凝胶片断于黑暗中置于10mM DTT，55mM碘代乙酰胺(iodoacetamide)于25mM碳酸氢铵(ammonium bicarbonate)中，于56℃放置45分钟。碳酸氢铵被添加至凝胶片断胰蛋白酶，以及其于37℃培养隔夜。随后其被转移至50％乙腈(acetonitrile)、0.1％三氟乙酸(trifluoroacetic acid)中，以及通过5分钟的超声波，提取该凝胶片断的多肽。该多肽重新悬浮于10μL的33％乙腈、0.1％三氟乙酸中。使用ABi 4800MALDI TOF/TOF^TM，以阳离子反射器模式(positive ion reflector mode)，进行MALDI-TOF-TOF质谱仪分析。离子加速电压系为20kV。为了鉴定多肽中的质量指纹(mass fingerprinting)，经胰蛋白酶分解的多肽的质量地图通过BioToolsTM MS(Bruker Daltonics)程序传输，以使用Mascot(Matrix Science)软件搜寻Swiss-Prot蛋白质序列数据库。

实施例9：内毒素的移除

为了移除vNAR的制备过程中的内毒素，使用2种工具：Detoxi-Gel内毒素去除管柱(Detoxi-Gel Endotoxin Removing Columns)：该管柱使用固定于基体(matrix)上的多黏菌素B(polymyxin B)来结合及去除存在于溶液中的致热源(pyrogens)。此一层析方法使用简单，且为小量的样本提供快速的致热源移除。不同的vNAR样本，使用这一管柱得到了良好的结果。通过变性SDS-PAGE，于管柱中填充及洗脱vNAR样本后，分析所收集的部分。该蛋白质所存在的部分，被合并以及再次通过电泳定量。总体而言，vNAR的制备系容许这一处理，以及回收蛋白质中所获得的产量大部分介于75-90％。

实施例10：体外(in vitro)的抑制血管生成的比较研究

该分析包含于96-孔盘中培养取自人类脐静脉(human umbilical vein,HUVEC)的内皮细胞，其使用绿荧光蛋白质转染(transfected)，并与人类纤维母细胞(human fibroblasts,NHDF)共同培养14天。使用4ng/mL VEGF作为阳性对照组，其在所有的盘中，产生全面的管状结构形成及网络，管状结构的长度达到约13-14mm/mm²的层级。

作为第一阴性对照组，培养是保持在不存在VEGF的状态，其不利于管状结构的形成，仅达到2-3mm/mm²的层级。另一应用的阴性对照组是添加100μM苏拉明(suramin)；这一处理完全抑制VEGF调控的血管生成。

于实验的第4、5、7、10及12天，在4ng/ml VEGF的存在下，添加不同浓度的vNAR抗体至盘孔中：V13(先前于美国专利8,496,933中被描述)、V19及V32R，以及参考抗体(Genentech/Roche)(见图50)。每一盘被用于分析二种化合物。因此，可获得依浓度的四重复(quadruplicates)。每一处理结束时，针对每一盘孔拍摄6个影像。

在暴露至化合物14天后，测量血管形成过程中的2个参数：管状结构的长度(图51)及分支点(图52)。将这些参数的测量结果与仅接受4ng/mL VEGF(阳性对照组)及接受20μM苏拉明(suramin)+VEGF的细胞进行比较。

这一分析显示，相较于对照组，VEGF刺激管状结构与分支点的形成，以及参考抗体(Genentech/Roche)(A)，V13(B)、V32R(C)及V19(D)，浓度依赖性地抑制管状结构形成，且也抑制分支点的形成。

使用非线性回归模型建构剂量-反应曲线，通过分析每一抗体在体外测试中，抑制血管生成达50％的所需浓度(IC₅₀)。所获得的数据显示于表6；以中和50％的血管生成活性的2个参数所需的浓度(mg/mL)代表抗体的效力，该2参数为体外测试中所测量的：管状结构长度与分支点。

表6

图53、54、55及56显示呈现V32R、V19及V13抗体以及参考抗体血管形成抑制效果的影像。

这一研究的主要结论为，通过测量血管的数量及分支点显示，所有的抗体对于血管形成过程具有浓度依赖性的抑制效果。达到50％抑制效果的V32R及V19抗体的浓度是介于20-40mg/mL的范围。

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