专利名称：一种kdr高表达的重组hek293细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及血管内皮生长因子高表达细胞的构建，特别涉及 一种基于外源重组质粒的KDR高表达的重组HEK293细胞及其应用。
背景技术：
血管生成(angiogenesis)是指在原有血管床的基础上再生成新的血管，是一个 复杂的受多因素调控的过程。正常生理情况下的血管内皮生长因子(VEGF)对血管生成起 着关键的作用，是目前发现的最强的剌激血管生成的因子之一。VEGF是通过与其受体结合 从而发挥剌激血管生成的生物学效应的。 VEGF受体分子由7个免疫球蛋白样结构形成的胞外部分、含有酪氨酸激酶的胞内 部分及跨膜区域三部分构成。其中胞内部分含有的一段酪氨酸插入序列，是磷酸化下游信 号分子的结合位点。VEGF的受体包括fms样酪氨酸激酶受体VEGFR-1，即FLT-1 (Fms-like tyrosine)，月台儿月fl敛醇插人区受体VEGFR—2，艮卩FU(—l (Kinase insert domain—containing receptor) 、 KDR (Kinase insertdomain-containing receptor, KDR) 、 VEGFR-3禾口 Neuropilin_l(NRP_l)。 VEGF和VEGFR结合后最主要的生物学效应是促使内皮细胞有丝分裂，从而诱导血
管内皮细胞的分裂、增殖，进一步促使内皮细胞发生迁移，同时增强毛细血管通透性，使血
浆外渗，有利于新生血管以出芽的方式生成，最终致大量新生血管形成。 血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2， KDR)是介导肿瘤新生血管形成的主要受体。
有研究提示KDR与内皮细胞对VEGF的增生反应有关。还有研究表明阻断VEGF与KDR的相
互作用能够抑制动物体内实体瘤的生长，从而达到治疗肿瘤的目的(Curr Top Microbiol
Immunol, 1999 ;237 :1-30 ;Cell， 1998,92 :735-745。)。以KDR为耙点进行肿瘤的相关研
究逐渐成为当今肿瘤研究的一个新热点。因此，能够高丰度表达KDR蛋白的细胞系将有着
广泛的应用前景，可以作为细胞模型研究不同微环境对KDR发挥作用及相关信号转导的影
响，还能用其筛选有效的抗肿瘤血管生成的药物等。 之前的研究者往往利用相对高表达KDR的血管内皮细胞作为研究对象，但其具有 以下缺陷1、细胞生长慢；2、细胞培养要求高；3、细胞培养成本高；4、细胞表面KDR表达丰
度达不到要求。而且，目前已有的稳定高表达KDR的细胞株所携带的KDR基因均不是全长 KDR基因，影响了 KDR发挥完整的功能。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种KDR高表达的重组HEK293细胞，在构建KDR全长 基因的真核表达载体pcDNA3. 1 (+) -KDR的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达KDR 分子的重组HEK293细胞株。
本发明是通过以下技术方案来实现 —种KDR高表达的重组HEK293细胞，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含KDR全长基因的表达载体。
所述的KDR全长基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。所述的包含KDR全长基因的表达载体是pcDNA3. 1(+)-KDR，该表达载体是通过
Kpnl和Xbal酶切位点将KDR全长基因克隆入真核质粒pcDNA3. 1 (+)。所述的KDR高表达的HEK293-KDR重组细胞应用于以血管内皮生长因子受体为耙
点的药物筛选。 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果 1、本发明构建了包含血管内皮生长因子受体2(KDR)基因全长的真核表达载体 pcDNA3. 1 (+) -KDR，基因测序结果与基因库人KDR —致；pcDNA3. 1 (+) -KDR载体脂质体法转 染HEK293细胞，经过筛选获得了获得稳定、高表达KDR分子的重组HEK293-KDR细胞株；
本发明构建的重组细胞生长速度快，包含KDR基因全长的重组HEK293-KDR细胞在 相同条件下生长速度显著超过HEK293 ; 与现有只含KDR胞外区或部分基因序列构建的重组细胞相比，本发明构建的包含 KDR基因全长的重组HEK293-KDR细胞株表面能够稳定的表达KDR分子，而且具有完整的分 子活性。 2、作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永 生化细胞，该细胞本身含有的各种受体表达量相对较低；而重组后的HEK293-KDR细胞表达 的KDR受体的相对表达量比HEK293增高17. 90倍。相对于其他细胞表面分子占据表达优 势地位，在结合其配体方面处于有利地位；这样就大大提高了筛选以KDR为靶点药物的灵 敏性及特异性； 细胞膜色谱法检测HEK293-KDR细胞对塔斯品碱有一定的保留，可以应用以VEGFR 为靶点的药物筛选； 同时能够为进一步研究KDR生物学特性及其通路蛋白的差异性以及发现功能蛋 白的有效性提供较好的细胞模型。
图1是pcDNA3. 1 (+)载体的质粒图谱；
图2是纯化的KDR基因电泳检测图谱； 图3是pcDNA3. 1 (+) -KDR载体转染大肠杆菌DH5 a经质粒提取后用Kpnl和Xbal 双酶切鉴定结果图； 图4是HEK293-KDR细胞的KDR表达水平的RT-PCR检测图； 图5是流式细胞术检测KDR在各种细胞膜上的表达量，横坐标代表所测KDR分子
的荧光强度(即"荧光道数")，纵坐标代表细胞的相对数； 图6是免疫荧光染色定性鉴定KDR在HEK293-KDR细胞中的表达图； 图7是Westernblot检测HEK293-KDR细胞和HEK293细胞信号转导通路关键蛋白
KDR和Akt的表达量； 图8是采用细胞膜色谱HEK293-KDR细胞对塔斯品碱的保留图。
具体实施例方式
本发明在构建KDR全长基因的真核表达载pcDNA3. 1 (+) _KDR的基础上，转染 HEK293细胞，获得稳定、高表达KDR分子的重组HEK293-KDR细胞株。下面对本方面做详细 的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 本发明是以pcDNA3. 1 (+)为基础载体，(来源于西安交通大学第一附属医院所赠)， 其质粒图谱如图1所示，本发明选择KpnI和XbaI酶切位点作为连接外源基因的多克隆位点。
1)构建真核表达载体pcDNA3. 1 (+) -KDR a、设计包含酶切位点的引物对，以MHS4426-99626176质粒(含有KDR基因cDNA 全长序列，购自NCBI公司，美国，产品目录号BCj31822)为模板，PCR扩增KDR基因全长， 所述的引物对为 上游弓l物:cggggtacca atgcagagca aggtgct 27bp ; 下游弓l物:tgctctagac ttaaacagga ggagagctc 24bp 其中，上游引物中ggtacc为Kpnl酶切位点，下游引物中ctaga为Xbal酶切位点；
PCR反应体系为HS PCR多聚酶0. 5ii L ;10XBuffer 5 ii L ;dNTP4 ii L ;上游引物 (sense， 10 ii mol/L) 1 ii L ;下游弓l物(antisense， 10 ii mol/L) 1 ii L ;模板(cDNA) 2 ii L ;ddH20 36. 5ii L ;Total :50ii L。 PCR的反应条件为95t:预变性5min ;98"C变性15s，68"C退火延伸4min，循环35 次；72t:延伸10min ; PCR产物经0. 7%琼脂糖电泳后，凝胶回收得到纯化的PCR产物； PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，其中，泳道M为Marker,泳道1、2、3
为扩增的4071bp的KDR基因全长片段。 b、将纯化的KDR、 pcDNA3. 1 (+)载体在M缓冲液(M Buffer, Takara生物公司i式 剂)作用下，分别Kpn 1、Xba I双酶切过夜；酶切体系如下Kpn I 1 y L ;Xba I lyL，10XM Buffer 2iiL，0.1%BSA 2 ii L，目的基因KDR片段或载体pcDNA3. 1 (+) 3 ii L ;ddH20 1 ii L ; Total 20iiL。 分别纯化回收带黏性末端的407 lbp的KDR片段和5428bp的pcDNA3. 1 (+) 载体片段，然后通过TV)NA连接酶连接，16t:条件下反应16小时，构建真核表达载体 pcDNA3. 1(+)-KDR。 将所得载体常规转化大肠菌DH5a，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板中37t:培养，挑 取阳性克隆提取质粒，并进行电泳检测和测序。 质粒酶切鉴定KpnI和Xbal双酶切鉴定，然后琼脂糖凝胶电泳检测；结果如图3 所示，其中泳道M为maker ;泳道1、2、3为3个阳性克隆的质粒提取，每个泳道均显示分别 被酶切的KDR和载体片段； 将酶切和PCR检测鉴定正确的质粒进行测序，KDR全长基因片段的测序结果如 SEQ. ID. NO. 1所示，测序结果与基因库NCBI中的KDR序列(Transcript variant 2)进行对 比完全一致，至此真核表达载体pcDNA3. 1 (+) -KDR构建成功。
2) pcDNA3. 1 (+) -KDR表达载体转染HEK293细胞 c、采用脂质体2000将质粒转入HEK293细胞(脂质体2000购自美国GIBCO， Invitrogen公司，按照脂质体2000试剂盒说明书操作)，DMEM培养基(Dulbecco ' s4/7页
Modified Eagle Media)加G418浓度600mg/L筛选14天，挑取G418抗性单克隆传代培养， 4周后调整G418浓度为300mg/L的DMEM培养基培养，得到含pcDNA3. 1 (+) -KDR阳性转染的 克隆细胞株。 d、对转染细胞株的RT-PCR检测 采用TRIZOL试剂盒分别提取未转染和转染的细胞总RNA，并以总RNA为模板采用 Fermentas公司的cDNA合成试剂盒进行反转录，得到cDNA ; 分别以所得cDNA为模板，PCR扩增能够代表KDR基因表达丰度的575bp长度的片 段，PCR扩增条件与上述KDR基因的PCR扩增方法相同，PCR扩增引物为
上坊,弓l物aagcggtcaa caaagtcg 18bp ;
下坊,弓l物gaggttccgg ttcccatc 18bp ;RT-PCR检测KDR在HEK293-KDR细胞中基因水平的表达，同时以HEK293细胞的 18SrRNA、 HEK293-KDR细胞的18SrRNA作为对照，检测结果如图4所示
其中，泳道M为Marker,泳道1为未转染的HEK293细胞，泳道2为未转染的HEK293 细胞的18SrRNA对照，泳道3为转染后的HEK293-KDR细胞；泳道4为转染后的HEK293-KDR 细胞的18SrRNA对照。 泳道2与4相比均显示了 253bp的18SrRNA片段；泳道1在575bp的目标条带处 没有显示，与之相比，泳道3在575bp的目标条带处具有清晰的条带显示；RT-PCR检测结果 表明重组HEK293-KDR细胞的KDR得到表达。
e、流式细胞术检测HEK293-KDR细胞株中KDR的表达 用胰酶消化贴壁培养的HEK293-KDR细胞，离心收集，计数。用冰预冷的PBS以 1000rpm离心5min洗涤三次。用冰预冷的含10% FBS、 1 % NaN3的PBS重悬细胞，使其浓度 为1Xl(f个/mL;取100iiL细胞悬液到EP管中，离心弃上清。 以含3X牛血清白蛋白的PBS以1 : 1000稀释一抗(一抗小鼠抗人KDR)，取 100ii L加入到细胞中，室温孵育45min ;对照组加入不含抗体的等量抗体稀释液。离心弃上 清，用冰预冷的PBS以1000rpm离心5min，重复洗涤三次。用含3% BSA的PBS以1 : 100 稀释的异硫氰酸荧光素标记山羊抗小鼠IgG作为二抗，加入细胞中室温避光孵育45min。离 心弃上清，冰预冷的PBS离心洗涤三次。用lmL含3% BSA、 1 % NaN3的PBS重悬细胞，使细 胞终浓度为1X106个/mL，用于流式细胞仪检领"结果如图5所示 其中，图A为HEK293细胞的阴性对照，图B为HEK293-KDR的KDR表达量的检测图， 图中横坐标标注的M1是以阴性细胞为准标出的，落在M1右侧的细胞越多，说明细胞表达的 KDR含量越高，对比图A、图B可见HEK293-KDR细胞受体的表达量明显高于HEK293细胞， 说明KDR基因转染成功，且获得高效表达。 f 、免疫荧光染色定性鉴定KDR在HEK293-KDR细胞中的表达
取对数生长期的重组HEK293-KDR细胞，0. 25%胰蛋白酶消化，按1 X 105个/孔接 种于放有多聚赖氨酸预处理的无菌盖玻片的6孔板中，培养24h细胞贴壁后，弃去培养基， 用PBS轻轻洗涤爬有细胞的盖玻片三次。 其中一抗、二抗同流式细胞检测的试剂，染色方法也同流式细胞检测的染色方法， 检测使用的是共聚焦显微镜(Leica TCS-SP2，德国)。结果如图7所示，其中，荧光分布于 细胞膜，一抗为鼠源性单克隆KDR，二抗为有绿色荧光标记的、抗鼠源性的IgG。 KDR与一抗、
6二抗结合形成免疫复合物并发出荧光，KDR表达越高，与之结合的一抗、二抗就越多，所发出 的荧光就越显著；与图6a所表示的HEK293细胞相比，图6b所代表的HEK293-KDR细胞的荧 光显著增强。 g、 Westernblot检测KDR和Akt的表达量 用裂解液RIPA裂解细胞后提取总蛋白，用BCA法测定蛋白含量。经电泳、转膜、 免疫染色(一抗兔抗人KDR和Akt多克隆抗体，购于abeam公司；二抗山羊抗兔，购于 pierce公司)和显影，实验结果如图7所示 泳道1所示的HEK293细胞的KDR和AKT表达量明显低于泳道2所示的重组 HEK293-KDR细胞；从Westernblot的结果得出，HEK293-KDR细胞中重组表达的KDR表达量 显著提高，而且KDR分子能够激活并开启下游Akt信号通路，具有信号转导的生物活性。
3)细胞膜色谱检测HEK293-KDR细胞对吉非替尼的保留 高表达KDR的HEK293-KDR细胞膜色谱柱经平衡后进行样品检测，结果发现塔斯品
碱在该细胞膜上有很好的保留，同时以未转染的HEK293细胞作为阴性对照。 HEK293-KDR细胞膜对塔斯品碱的保留如图8所示，横坐标为时间(分钟)，纵坐标
为保留量(洗脱量)；HEK293-KDR细胞膜对塔斯品碱具有一定的保留，水洗脱在3.2分钟的
时候达到峰值，HEK293-KDR细胞株在细胞膜色谱分析筛选针对VEGFR靶点或者能与VEGFR
结合的药物，具有一定的亲和力、高灵敏度，说明HEK293-KDR细胞可用于以VEGFR为靶点的
药物筛选。 核苷酸序列表
〈110〉西安交通大学 〈120〉 一种KDR高表达的重组HEK293细胞及其应用 〈160>1 〈210>1 〈211>4071 〈212>DNA 〈213〉人KDR全长基因 〈400〉 1aggtgctgctggccgtcgccctgtggctctgcgtgg卿cccgggccgcc60tctgtgggtttgcctegtgtttctcttgatctgcccaggctcagcateca120cttecaatteaggcteatecaactcttcaaattecttgcaggggac卿ggg3Cttgg3C180tggctttggcgagtggragtgagc腿gggtgg郷tgactgagtgragc240gatggcctcttctgteagacactcacaatttcgga皿tg3cactggagcc300tecaagtgcttcteccgggaaactgacttggcctcggtcatttetgtctetgttcaagat360tecagatctccatttettgcttctgttegtg3CC皿C3tggagtcgtgtecattectgag420a皿ctgtggtgattccatgtctcgggtccatttcaaatctcaacgtgtca■ctttgtgcaagatecccag3gttcctgatgttcctgggac5403gC皿g皿gggctttectettcccagctecatgatcagctatgctggcatggtcttctgt600tteatgatga皿gtteccagtctettetgtacategttgtcgttgteggg660teteggattt3tg3tgtggttctgagtccgtctcatggaattgaactetctgttgg卿a720
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一种KDR高表达的重组HEK293细胞，其特征在于，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含KDR全长基因的表达载体。
2. 如权利要求1所述的KDR高表达的重组HEK293细胞，其特征在于，所述的KDR全长 基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3. 如权利要求1所述的KDR高表达的重组HEK293细胞，其特征在于，所述的包含KDR 全长基因的表达载体是pcDNA3. 1 (+) -KDR，该表达载体是通过Kpnl和Xbal酶切位点将KDR 全长基因克隆入真核质粒pcDNA3. 1 (+)。
4. 权利要求3所述的KDR高表达的HEK293-KDR重组细胞应用于以血管内皮生长因子 受体为靶点的药物筛选。
全文摘要
本发明公开了一种KDR高表达的重组HEK293细胞及其应用，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含KDR全长基因的表达载体。与现有只含KDR胞外区或部分基因序列构建的重组细胞相比，本发明构建的包含KDR基因全长的重组HEK293-KDR细胞株表面能够稳定的表达KDR分子，而且具有完整的分子活性。细胞膜色谱法检测HEK293-KDR细胞对塔斯品碱有一定的保留，可以应用以VEGFR为靶点的药物筛选。
文档编号C12N5/10GK101701209SQ20091024657
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者张彦民, 李旭, 杜晖, 王嗣岑, 葛晓雯, 贺浪冲 申请人:西安交通大学