本发明涉及一种制备血管内皮生长因子试剂的应用方法，用于检测胃癌病人血清中的VEGF-C蛋白的浓度。可用作检测脑梗死等脑损伤疾的辅助诊断。属于免疫学检测领域。
背景技术：
无论是在发达国家还是在欠发达国家，癌症是导致死亡的主要原因之一，随着全球范围内的人口增长和老龄化，以及日益增加的患病因素(包括吸烟，体重超重，缺乏体力活动，城市化和经济发展相关的生育模式的变化)，癌症的发生率和死亡人数一直在增加，癌症的治疗和预防研究刻不容缓。在我国，因肺和支气管、胃、肝、食道、结肠发生的癌症导致死亡的人数占所有癌症死亡总数的约四分之三。2015年相关数据分析显示，有新发浸润性癌病例数429.2万，相当于平均每天新发12000例癌症，有281.4万癌症死亡病例，相当于平均每天7500人死于癌症。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促进新生血管生成的一个非常重要的生长因子，在肿瘤以及炎症性疾病的血管生成中发挥着重要的作用。目前发现的VEGF家族成员有六个即为VEGFA，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF E，其分子量从35至44kDa不等，每个成员特异性地与三个“血管内皮生长因子受体”(VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3)的特定组合相结合。
VEGF-C由419个氨基酸构成，属分泌性多肽，经蛋白水解加工后，形成以二硫键链接的同源二聚体，与其对应的受体结合后而发生生物学效应。在正常人组织中，VEGF-C是一种特异性促淋巴管生成因子，VEGFR-3只限于淋巴内皮上，而它的另一受体VEGFR-2则在血管内皮和淋巴内皮均有表达。胃癌基质中常见新生和扩大的淋巴管，肿瘤细胞侵入的淋巴管多为癌周的毛细淋巴管，这些淋巴管缺乏完整的基膜，内皮细胞连接松散有利于癌细胞的进入，VEGF-C可介导淋巴管内皮细胞的增殖，因此在胃癌患者的血清中VEGF-C的含量明显升高。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种制备血管内皮生长因子试剂的应用方法。
为了解决上述问题，本发明所采取的技术方案是：
一种制备血管内皮生长因子试剂的应用方法，其特征在于：包括VEGF-C系列标准品溶液，VEGF-C系列质控品溶液，酶标VEGF-C抗体溶液，酶标抗体稀释液，样本稀释液，链酶亲和素-HRP，化学发光液A液，化学发光液B液，浓缩洗涤液，包被溶液，封闭溶液；
所述VEGF-C系列标准品溶液：以常规方法将VEGF-C纯品用标准品稀释液配制成浓度分别为0、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL的VEGF-C标准溶液；
所述VEGF-C系列质控品溶液：将VEGF-C纯品用标准品稀释液配制成浓度分别为：400±80ng/mL、200±40ng/mL；
所述酶标VEGF-C抗体溶液：用VEGF-C抗体与生物素偶联制备，将所得VEGF-C抗体用酶标VEGF-C稀释液稀释成1:4000的工作浓度；
所述酶标抗体稀释液：为含有BSA，蔗糖的0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，磷酸盐缓冲液是每升含有20g BSA，50g蔗糖，16g NaCl，0.4g KCl，0.4g KH2PO4，5.8g Na2HPO4的水溶液；
所述样本稀释液：为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，磷酸盐缓冲液是每升含有16g NaCl，0.4g KCl，0.4g KH2PO4，5.8g Na2HPO4的水溶液；
所述化学发光液：化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M，pH＝8.8的三羟甲基氨基甲烷溶液，化学发光液B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的水溶液；
所述浓缩洗涤液：按体积分数0.05％将吐温-20添加至pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液中；
所述包被溶液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH＝9.5；
所述封闭溶液：10g BSA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5‰的NaN3。
2、根据权利要求1所述的一种一种制备血管内皮生长因子试剂的应用方法，其特征在于：试剂具体操作方法是：
(1).化学发光板使用前每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，重复2次。
(2).VEGF-C系列标准品溶液，VEGF-C系列质控品溶液，酶标VEGF-C抗体溶液各20μl分别加入化学发光板微孔中，再加入样本稀释液80μl，震荡混匀后，用封板膜封板，37℃水浴20分钟。
(3).甩去化学发光板孔内液体，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，重复此操作5次。
(4).加入生物素标记抗体，每孔100μl，用封板膜封板，37℃水浴30分钟。
(5).甩去孔内液体，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，重复此操作5次。
(6).每孔加入100μl的链酶亲和素-HRP，用封板膜封板，37℃水浴30分钟。
(7).甩去孔内液体，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，重复此操作5次。
(8).每孔分别加入50μl化学发光液A液和50μl化学发光液B液，立刻置于化学发光仪器中读数。
前述的一种一种制备血管内皮生长因子试剂的应用方法，其特征在于：VEGF-C抗体置于设定的包被溶液中，以设定的浓度，在37℃恒温箱中反应包被。
前述的一种一种制备血管内皮生长因子试剂的应用方法，其特征在于：化学发光板的微孔包被好后用封闭溶液封闭。
本发明所达到的有益效果：本发明主要是利用抗体与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现的。化学发光免疫分析法是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中VEGF-C含量越高，反应体系中发光强度越强；反之，样品中VEGF-C含量越少，发光强度越弱。本发明的化学发光酶联免疫检测具有高灵敏度、简便快速、准确度高的特点，与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少。可用作检测胃癌的辅助诊断。
具体实施方式
以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明制备血管内皮生长因子试剂的应用方法，
1.包被有抗VEGF-C抗体的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化学发光板，抗体包被浓度为5.0μg/mL。
2.VEGF-C系列标准品溶液。浓度分别为：0、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL。
3.VEGF-C系列质控品溶液浓度分别为：400±80ng/mL、200±40ng/mL。
4.样本稀释液。为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
5.酶标VEGF-C抗体。由VEGF-C抗体与生物素偶联制备得到。
6.链亲和素-HRP。
7.化学发光液。化学发光液分为A、B液。A液为化学发光底物-鲁米诺和发光增强剂-对甲苯酚溶液，B液为过氧化氢脲溶液。
8.浓缩洗涤液。浓缩洗涤液具体为含有吐温-20(Tween-20)缓冲液的20倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光板
本发明试剂盒中涉及的VEGF-C标准品溶液、样本稀释液、化学发光溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：
1.VEGF-C系列标准品溶液：以常规方法将VEGF-C纯品用标准品稀释液配制成浓度分别为0、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL的VEGF-C标准溶液。
2.VEGF-C系列质控品溶液：以常规方法将VEGF-C纯品用标准品稀释液配制成浓度分别为：400±80ng/mL、200±40ng/mL。
3.酶标VEGF-C抗体溶液：用VEGF-C抗体与生物素偶联制备，将所得VEGF-C抗体用酶标VEGF-C稀释液稀释成1:4000的工作浓度。
4.标准品稀释液：为含有BSA，蔗糖的0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，是每升含有20g BSA，50g蔗糖，16g NaCl，0.4g KCl，0.4g KH2PO4，5.8g Na2HPO4的水溶液。
5.酶标抗体稀释液：为含有BSA的0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，是每升含有20gBSA，16gNaCl，0.4gKCl，0.4gKH2PO4，5.8gNa2HPO4的水溶液。
6.样本稀释液：为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，是每升含有16g NaCl，0.4g KCl，0.4gKH2PO4，5.8gNa2HPO4的水溶液。
7.化学发光液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M，pH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的水溶液。
8.浓缩洗涤液：按体积分数0.05％将吐温-20添加至pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。
9.包被溶液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH＝9.5。
10.封闭溶液10g BSA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5‰的NaN3。
本发明中包被化学发光板采用将抗VEGF-C抗体置于设定的包被溶液中，以设定的浓度，在37℃恒温箱中反应包被。
本发明采用的是pH＝9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所包被的抗VEGF-C抗体在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的抗体包被浓度为5.0μg/mL。包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选BSA，需加入NaN3防止变质。
本发明实验操作方法：
1.化学发光板使用前每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，重复2次。
2.将VEGF-C系列标准品溶液，VEGF-C系列质控品溶液，酶标VEGF-C抗体各20μl分别加入化学发光板微孔中，再加入样本稀释液80μl，震荡混匀后，用封板膜封板，37℃水浴20分钟。
3.甩去化学发光板孔内液体，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，重复此操作5次。
4.加入生物素标记抗体，每孔100μl，用封板膜封板，37℃水浴30分钟。
5.甩去孔内液体，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，重复此操作5次。
6.每孔加入100μl的链酶亲和素-HRP，用封板膜封板，37℃水浴30分钟。
7.甩去孔内液体，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，重复此操作5次。
8.每孔分别加入50μl化学发光液A液和50μl化学发光液B液，立刻置于化学发光仪器中读数。
本发明理化实验数据
1.最低检测线
用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的发光值(RLU值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对应的RLU值，根据试剂盒所用校准品的定标曲线方程，将M+2SD所对应的RLU值带入标准曲线中，求出对应的浓度值，即为检测限。
2.准确度
取准确度参考品作为样本进行检测。重复测量3次后，其平均结果记为M，根据公式(1)计算测量浓度的相对偏差。
B＝(M-T)/T×100％·公式(1)
式中：
B—相对偏差；
M—测量浓度3次结果的平均值；
T—准确度参考品的浓度。
3.重复性
用两个浓度水平的样本各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，根据公式(2)得出变异系数CV。
CV＝SD/M×100％·公式(2)
式中：
CV—变异系数；
SD—10次测量结果的标准差；
M—10次测量结果的平均值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。