用于扩增HIV‑1B亚型病毒env基因的引物及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及用于扩增hiv-1b亚型病毒env基因的引物及其应用。

背景技术：

人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)可以分为两型：hiv-1与hiv-2。hiv-1具有较高的毒力，更容易传播并引起获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome，aids)，对全球的公共卫生来说是一个巨大的威胁。根据世界卫生组织(who)显示，截至2016年底，全球大约有3670万人感染了艾滋病毒，其中有1950万人接受了抗病毒治疗。随着高效抗逆转录病毒治疗的广泛应用，极大地减少了aids患者的死亡率并提高了生活质量；但也不可避免地导致hiv-1病毒发生突变，使耐药菌株感染的病例不断出现。目前我国已报道确定的流行毒株有a、b、b’、c、d、f6种亚型和3种重组毒株：a/e和2种不同的b/c。b亚型是欧美流行的优势毒株，在20世纪80年代传入我国云南静脉吸毒人群，随着时间的推移发生变异，并在我国广泛流行开来，在hiv-1感染者中占据一定的比例。

hiv-1病毒的env结构基因编码包膜糖蛋白具有高度的变异性，对于检测hiv-1病毒的耐药性具有重大的意义。目前主要采用巢式pcr对env基因进行扩增，在扩增env基因片段的过程中，可能被重组，小片段env序列的改变将影响膜蛋白的生物学功能。在已有的制备假病毒方法中，存在env区基因克隆耗时、过程繁琐、价格昂贵的缺点，使用已有序列进行合成并不一定能够做出可用于包装假病毒的克隆。针对能特异扩增env基因并解决env基因克隆缺点的研究非常有意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供用于扩增hiv-1b亚型病毒env基因的引物及其应用，该引物具有特异性高的特点，能准确高效地扩增获得env基因片段用于包装假病毒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

用于扩增hiv-1b亚型病毒env基因的引物，包括上游引物env-h3和下游引物env-b3，它们分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的碱基序列。

上述引物用于制备扩增hiv-1b亚型病毒env基因的试剂盒。

用于扩增hiv-1b亚型病毒env基因的试剂盒，含有上游引物env-h3和下游引物env-b3，它们分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的碱基序列。

上述用于扩增hiv-1b亚型病毒env基因的试剂盒，含有以下试剂：maxdnapolymerase(2×)、forwardprimer、reverseprimer、rnasefreeddh2o，forwardprimer、reverseprimer包括两对引物，分别是用于第一轮rt-pcr的上游引物env-1f和下游引物env-1r，以及用于第二轮pcr的上游引物env-h3和下游引物env-b3，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.4的碱基序列。

针对现有env基因扩增及包装假病毒的问题，发明人设计并合作了用于扩增hiv-1b亚型病毒env基因的引物，包括上游引物env-h3和下游引物env-b3，它们分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的碱基序列。本发明的引物可能够明确地扩增出带有hindiii、bamhi双酶切位点的hiv-1b亚型病毒env基因片段，且能够用于包装假病毒。据此，还可进一步组装成方便使用的pcr扩增试剂盒，以及建立相应的pcr扩增方法。应用本发明仅涉及巢式pcr、琼脂糖凝胶电泳等常用方法，操作简便，易于掌握。因此，本发明对hiv-1b亚型病毒的研究具有重大价值。

附图说明

图1是未加入hindiii酶切位点及kozak序列的引物序列的基本信息，即inhouse法的上游引物序列的基本信息。

图2是未加入bamhⅰ酶切位点及kozak序列的引物序列的基本信息，即inhouse法的下游引物序列的基本信息。

图3是hiv-1env基因扩增电泳图，图中：1-24为24个不同样本的pcr产物，mark为dl5000dnamark。

图4是pcdna3.1-env重组质粒鉴定电泳图，图中：8-1～8-5为8号样本的克隆产物，mark为dl5000dnamark。

图5是westernblot检测env基因重组质粒表达包膜蛋白，图中：1-4为阳性克隆转染组，5为骨架质粒单转染组。

图6是pcdna3.1-env与重组骨架质粒共转染组上清感染tzm-b1细胞荧光表达情况。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。

一、试验材料

人血浆：从hiv-1b亚型慢性感染者外周血中分离。

引物合成：上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

rna提取试剂盒：瑞士roche公司(rochehighpureviralrnakit)，catno：11858882001

逆转录试剂盒：大连宝生物工程有限公司(primescripttmrtmastermix)catno：rr036a

质粒：pcdna^tm3.1(+)购自invitrogen公司；重组骨架质粒pnl4-3.egfp.e-r-由发明人自行构建。

二、引物的设计与合成

(1)引物的设计：在中国疾病预防控制中心使用的inhouse法的引物序列基础上增加酶切位点及kozak序列进行设计。

上游引物env-h3(含hind3酶切位点)的序列为：

5’---cccaagcttgccaccatgagagtgatggagatcagg---3’：

下游引物env-b3(含bamh1酶切位点)的序列为：

5’---cgggatccttatagcaaagccctttccaag---3’。

(2)由上海吉凯基因化学技术有限公司按照设计好的引物序列合成引物。

三、hiv-1cdna的获得

(1)按照rochehighpureviralrnakit试剂盒说明书进行人血浆病毒rna的提取。

(2)采用takaraprimescript^tmrtmastermix逆转录试剂盒，对提取出的人血浆病毒rna进行逆转录，合成cdna模板。逆转录反应体系为20μl：4μlprimescripttmrtmastermix(5x)、6μlrna模板，rnasefreeddh2o补足20μl。逆转录反应条件：37℃15min，85℃5s，一个循环，4℃保温。

四、env全长基因片段的获得

(1)采用巢式pcr的方法扩增hiv-1b亚型病毒env基因，所用扩增引物如表1所示：

表1env基因扩增引物

(2)两轮pcr反应体系均为50μl：25μlmaxdnapolymerase(2×)、1.5μlforwardprimer(20um)、1.5μlreverseprimer(20um)、5μldna模板，rnasefreeddh2o补足50μl。两轮pcr反应程序均为：98℃10s；55℃5s，72℃2min30s，35cycles；72℃10min，4℃保温。

(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，部分验证结果如图3所示，在指示带3000bp附近为扩增阳性样本，图中显示24份样本中有7份阳性扩增样本，其中，17、20、23号样本条带单一且清晰，可直接用于克隆；8、16号条带较弱，并出现非特异性扩增，需进行凝胶回收后方可进行克隆；2、9号条带很弱，需稀释后重新扩增以增加目的基因量。五、将env基因克隆到载体pcdnatm3.1(+)中

(1)用hindiii、bamhi分别双酶切env基因片段和载体pcdna^tm3.1(+)，反应体系如下：

表2双酶切体系

反应程序为：37℃3h，65℃20min，4℃暂停。

(2)所得反应液进行dna纯化，向酶切反应液中加入3倍的bufferdc，混匀后移入试剂盒spincolumn中，12000rpm离心1min；倒掉滤液，加入700μlbufferwb，12000rpm离心30s，倒去滤液，重复操作一次；12000rpm离心1min后，将spincolumn安装于1.5mlep管上，加入25μldepch2o，静置1min后12000rpm离心1min。

(3)测定纯化后dna浓度，按下表3配制连接体系连接前将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和连接酶，16℃孵育过夜。

表3env基因与载体连接体系

(4)重组载体的转化及扩增：取两管感受态细胞冰上放置解冻，开启水浴锅42℃。管①空白对照，不加连接产物；管②加入5μl的连接产物，混匀，冰上放置30min。42℃水浴90s，取出置冰上2min，加入lb液体培养基500μl，37℃，200r/min振荡培养1小时，复苏细胞。取转化菌液150μl涂布在含amp的培养板上，正面培养1h后，倒置培养过夜。12-16h后观察菌落生长情况，挑取培养板上单个生长的菌落，加入到含amp的20mllb液体培养基中，37℃培养12h。

(5)收集1-5ml菌体，加入250μlbufferp1，漩涡重悬细菌。加入250μlbufferp2，轻轻颠倒离心管8-10次。加入350μlbuffernp3，立即颠倒10-15次充分混合均匀后12000g离心1min。将上清液加入到column中，8000g离心30-60s。弃掉滤液，加入650μlbufferpw2，8000g离心30-60s，重复操作。弃掉滤液，12000g离心2min干燥柱子。加入50μldepch2o，静置1min，12000g离心1min，pcdna3.1-env重组质粒即在洗脱液中，用nanodrop2000测定所得质粒浓度。

(6)获得的重组pcdna3.1-env质粒，经双酶切、凝胶电泳鉴定阳性克隆。结果如图4所示。以8号样本为例，图中5.5kb左右条带为载体pcdna3.1条带，3kb左右条带为克隆到载体中的env全长基因，共获得4个阳性克隆，8-5为假阳性克隆。

六、westernblot检测env基因重组质粒表达包膜蛋白

通过westernblot验证重组载体中env基因表达的正确性。结果如图5，前4个泳道为阳性克隆转染组，均表达env蛋白；5号泳道为骨架质粒单转染组(阴性对照)，未见env蛋白表达。从hiv-1b亚型慢性感染者血浆样本中提取病毒rna，通过扩增并经电泳鉴定共获得8份阳性扩增产物。分别将扩增产物克隆到pcdnatm3.1(+)中，每个样本挑取5-10个克隆进行双酶切验证，共获得10个阳性克隆。

七、假病毒的获得及感染实验

(1)将重组骨架质粒pnl4-3.egfp.e-r-与重组包膜质粒pcdna3.1-env共同转染至293t细胞中，以24孔板为例：转染前一天以2.0-3.0×105/孔种板；正式转染前1h给细胞换液，在两个灭菌1.5ep管中分别加入38μl无血清无抗生素的dmem培养基，其中一个加入750ng质粒dna(骨架质粒与包膜质粒质量比为1∶2)，另一个加入2.25μlgenjet转染试剂，分别混匀；混合上述液体，室温孵育15-30min，之后加入24孔板中，摇匀；转染5-8h后换液，继续培养48h后收集上清，假病毒即存在上清液中；用0.45um过滤器过滤后-80℃保存或进行感染实验。

(2)正式感染前一天将tzm-b1细胞以8.0-10.0×104/孔种于24孔板；正式感染前换液，每孔加入dmem完全培养基300μl，200μl假病毒液，5μl的polybrene(lug/μl)，置于37℃、5％c02培养；48h后通过荧光显微镜观察egfp表达情况，结果如图6所示可以观察到荧光。

综上，本发明的引物可能够明确地扩增出带有hindiii、bamhi双酶切位点的hiv-1b亚型病毒env基因片段，此基因片段可用于重组质粒pcdna3.1-env，与携带egfp基因的重组骨架质粒共转染至293t细胞来制备具有单轮感染能力的假病毒。

序列表

<110>广西医科大学

<120>用于扩增hiv-1b亚型病毒env基因的引物及其应用

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<170>siposequencelisting1.0

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<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cccaagcttgccaccatgagagtgatggagatcagg36

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<212>dna

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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