本发明属于生物医药技术领域，本发明公开了一种交联淀粉生物合成重组基因yxi及其应用。
背景技术：
淀粉是仅次于纤维素、目前存在最为普遍、价格最为低廉的光能聚合载体之一；淀粉组成单一、易于储藏、用途广泛，是用于建材、纺织、造纸和石油开采的重要工业原料，尤其是其储藏的化学能易于再转化利用，为此，在战略高度重新认识淀粉方兴未艾。
淀粉来自植物种子(如水稻、小麦和玉米等)、块茎(如马铃薯等)等，因食物成分和淀粉特性等原因，马铃薯淀粉是广泛接受和使用的工业原料；我国马铃薯产区淀粉出粉率(生产每公斤淀粉所需块茎量)为1/(7-8),而发达国家为1/(3-4)，生产效率低下，其原因是我国产区淀粉含量仅为15％-18％。
育种是改良或获得品种的基本途径，其依据的原理是孟德尔和摩尔根的遗传原理，杂交是实现性状决定基因重组的基本途径，在欧美马铃薯杂交育种获得了目前80％以上广泛种植的品种，其中，用于淀粉加工目的的品种的淀粉含量均为20％以上。
在西欧，苏格兰农业科学咨询机构官方(爱丁堡)负责维护的欧洲马铃薯品种数据库，库中收集并详细记载了杂交育种获得品种的相关专利；hzpc、jalving、averis等是西欧主要的育种公司，其育种创制的马铃薯品种agria、desiree、bintje、ladyrosetta等被广泛栽培。
由北美联合培育的russet系列品种广泛应用，由此产生的专利包括pat.no.5,500,365,pat.no.5,387,756,pat.no.5,789,657,pat.no.5,503,999,pat.no.5,589,612,pat.no.5,510,253,pat.no.5,304,730,pat.no.5,382,429,pat.no.5,503,999,pat.no.5,648,249,pat.no.5,312,912,pat.no.5,498,533,pat.no.5,276,268,pat.no.4,900,676,pat.no.5,633,434,pat.no.4,970,168。
近年，在国际市场对淀粉巨大需求的驱动下，高出粉率、高粘度等高品质淀粉更是炙手可热，过去十多年，国际化工巨头、如荷兰avbe和德国basf等纷纷投资于淀粉品质改良的育种研究，在取得了许多育种成果，其中具有代表性的是获得了基因工程改良的马铃薯品种amflora。
amflora块茎淀粉中支链淀粉含量在95％以上，由amflora加工的淀粉，只需传统马铃薯淀粉用量的五分之一，即可达到同样的使用效果；迫于自然主义者的压力，欧盟多年来一直抵制在西欧种植转基因作物，但鉴于amflora淀粉的巨大诱惑，basf公司2010获欧盟授权，批准其在欧洲种植amflora。
淀粉不仅是人类生存所需食物的成分，由淀粉生产的燃料乙醇正在成为动力能源之一，因此，淀粉也是人类活动所需能源的组成部分，鉴于人们对淀粉含有的能量寄予的厚望，未来对淀粉的巨大需求显而易见，大幅增加植物淀粉积累，过去是、今天更是人类面临的重大课题。
淀粉由两类葡萄糖苷聚合物组成,一是葡萄糖-1,4线性连接占绝大部分的直链淀粉,二是在-1,4连接链有多处-1,6分支连接的支链淀粉；直接参与淀粉的生物合成的主要酶有：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(agpase.ec2.7.7.27))、可溶性淀粉合成酶(sss)、与淀粉粒结合的淀粉合成酶(gbss)、淀粉分支酶(be)、淀粉去分支酶(dbe)。
细菌agpase是由glgc基因编码的同源四聚体，高等植物的agpase是异源四聚体(异源四亚基复合体),两个相同的大亚基和两个相同的小亚基，小亚基(ss)行使agpase的代谢功能，大亚基(ls)主要调控agpase活性,变构因子诱导的异构调控是agpase主要的调控形式。
细菌agpase同源四聚体的单个亚基、植物agpase异源四聚体的小亚基在其以寡聚体状态存在时，其n端的代谢基团行使adp-葡萄糖合成的功能，即以磷酸葡萄糖和atp为底物，合成adp-葡萄糖，adp-葡萄糖是-1,4或-1,6糖苷链延伸的底物。
大肠杆菌k12突变菌株618中agpase亚基g336d突变使其agpase活力提高33％，在35s启动子驱动下，表达618菌株agpase编码基因glgc16马铃薯体内，agpase活力和块茎淀粉含量提高30％以上，表达g336d突变glgc木薯体内，使其agpase活力提高70％，块根淀粉含量提高2倍以上。
研究业已表明，植物agpase小亚基以寡聚体形式存在时表现活性，推动淀粉合成，当两小亚基第82位半胱氨酸间形成分子内二硫键(二聚体)时agpase失活，抑制淀粉合成；众多变构因子影响植物agpase小亚基第82位半胱氨酸的氧化还原状态，使其对调控敏感。
细菌agpase取代植物agpase，未见agpase代谢亚基二聚体形成，淀粉合成不受抑制，这也是glgc16马铃薯体内表达提高agpase活力的原因。植物体内agpase编码基因转录、agpase活力和淀粉合成三者中，agpase表达水平和其活力水平变化弹性强,提高植物agpase活力是增加淀粉生物合成的途径。
然而，在进一步实验中发现，用patatin启动子驱动glgc16在马铃薯体内表达，虽然转化株系体内的agpase活力显著增强，但块茎淀粉含量和对照无显著差异,即glgc16植物体内表达结果无法再现。其中可能原因包括glgc16自身和启动子等方面。
研究同时显示，glgc16在马铃薯体内表达，其产物agpase的表达量与其活力呈线性相关，但以往patatin启动子或35s启动子驱动glgc16植物体内表达自身基因拷贝数的限制，无法实现agpase表达量的提高。
块茎代谢流测定数据显示，agpase活力对淀粉合成的控制系数为0.55；反义mrna抑制agpase活力的马铃薯转化株系块茎鲜重和干物质积累减少。减少agpase活力致使储藏组织直链淀粉明显下降，短链支链淀粉积累增加，结果不仅证实了限速酶，揭示的对淀粉合成的中的作用。除了光周期触发agpase的氧化还原调控外，干旱等通过agpase对淀粉合成产生影响，干旱下植物体内积累更多蔗糖，淀粉合成显著减低。
已知水稻agpase两小亚基和四个大亚基isoform转录子的分化表达分析表明，内源大小亚基的isoform转录子随器官及细胞器分化表达，大亚基osagpl2表达于细胞溶质，小亚基osagps2a表达于叶片，小亚基osagps2b表达于种子，osagpl2和osagps2b突变导致淀粉合成减少而使胚乳皱缩；小亚基osagps1，大亚基osagpl1,osagpl3和osagpl4在细胞质体内表达。小扁豆短日照条件下agpase大亚基转录子ls1and小亚基转录子ss2转录表达减少，转录子ss1表达增加。
agpase不仅受到干旱等因素的调控，光周期不同通过氧化还原调控agpase亚基的结合状态，而且大小亚基转录子的分化表达；目前，就通过agpase自身调控其活性和淀粉积累尚处于大小亚基的识别和功能研究阶段，但其对环境和代谢水平的敏感性决定了其目前尚不能成为淀粉积累目的的目标基因，用非敏感基因替代内源agpase是目前阶段可行的选择。
内源agpase组成中大小亚基的isoform由多个基因编码，目前尚处于对其识别和功能研究阶段，不适于用大小亚基的isoform对淀粉积累进行调控。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，本发明提供一种交联淀粉生物合成重组基因yxi及其应用。
通过农杆菌介导的转基因方法，将重组基因转化马铃薯体内，经过基因组和转录组、agpase酶活力和表型检测和筛选，结果显示本发明具备以下特征，1)重组基因含有双拷贝glgc55，分别由35s和gbssi启动子驱动表达；2)yxi中具有35s启动子驱动的ssumrna结构，该结构可使植物对调控敏感的内源agpase酶失活；3)yx1植物体内表达，块茎内agpase活力可比对照提高80％，4)yx1植物体内表达，可使马铃薯块茎淀粉含量高于对照30％以上、淀粉粘度高于对照50％以上。其具体技术方案为：
一种交联淀粉生物合成重组基因yxi，其核苷酸序列如seqidno:1所示。
一种交联淀粉生物合成重组基因yxi在淀粉生物合成过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
尽管glgc在马铃薯体内表达产生agpase的表达量与其活力呈线性相关，但以往研究受到表达glgc基因拷贝数的限制，妨碍了agpase表达量和活性的进一步提高；另外，内源agpase组成中大小亚基由多个基因编码，尤其是代谢亚基的氧化还原状态对环境及代谢调控敏感；本发明构建了由双拷贝glgc和内源agpase小亚基基因反义mrna组成的重组基因，重组基因体内表达结果分析显示，双拷贝glgc和小亚基反义mrna表达可有效抑制对调控敏感小亚基基因的表达,显著提高agpase的表达量与其活力。
附图说明
图1是交联淀粉生物合成重组基因yxi示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明从大肠杆菌jm109-3突变株中分离获得了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码基因的glgc55(genbank:ay943834)，从马铃薯分别分离获得了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶agpase小亚基编码基因ssucdna(genbank:dq297414)和与淀粉粒结合的淀粉合成酶编码基因gbssi启动子。其中，glgc55编码431个氨基酸组成的agpase亚基(aay18580)，其中有4处特异突变，它们分别是k39e,v71a,i248v和k304e，前两者出现在寡聚亚基n端代谢基团的rossmann折叠区域内，后两者出现在寡聚亚基c端异构调控和寡聚化的lbh基团内。
本发明运用glgc55、ssucdna和gbssi启动子，构建了重组基因yxi，yxi定义为植物内源腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基编码基因ssu反义mrna结构由35s启动子驱动，在其两端的glgc55分别由35s和gbssi启动子驱动；yxi重组基因组成如图1所示。
glgc获得
按照lee等的方法提取大肠杆菌jm109基因组dna，以其为模板，按照《分子克隆实验指南》p672-683的方法，以glgc-f：5’-gagttagccatggttagtttagag-3’，glgc-r：5’-aaagatctctgaacatacatg-3’.为引物，在95℃预变性4min、95℃变性30sec、53℃退火45sec、72℃延伸1min、反应30个循环、最后72℃延伸10min、4℃保存的反应条件下进行pcr，pcr产物纯化回收(promega；wizardsvgelandpcrclean-upsystem)后，用回收产物和pgem-t载体(promega，pgem-tvectorsystems,a1360)建立连接反应，按照pgem-t载体说明书的方法，将连接产物转化dh5α(takara公司)感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体琼脂平板上，37培养12小时后挑选白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养12小时。按照《分子克隆实验指南》p19-23的方法，提取菌液质粒dna，充分洗涤后，用ncoi和bglii双酶切鉴定，鉴定正确的单克隆所含质粒为pc-glgc，扩大培养含pc-glgc重组菌，并对pc-glgc中目的glgc测序，测序结果在genbank注册，其注册号为ay943834。
gbssi启动子的获得
按照《分子克隆实验指南》p672-683的方法，ctab方法提取马铃薯基因组dna，并其为模板，以ph-f:5’-tccttccttttagcagtgtatcaat-3’，ph-r:5’-gaacttgatctttgtgggt-3’为引物，设置95℃预变性4min、95℃变性30sec、53℃退火45sec、72℃延伸1min、反应30个循环、最后72℃延伸10min、4℃保存的反应条件进行pcr，pcr产物纯化回收(promega；wizardsvgelandpcrclean-upsystem)后，用回收产物和pgem-t载体(promega，pgem-tvectorsystems,a1360)建立连接反应，按照pgem-t载体说明书的方法，将连接产物转化dh5α(takara公司)感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体琼脂平板上，37培养12小时后挑选白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养12小时。按照《分子克隆实验指南》p19-23的方法，提取菌液质粒dna，充分洗涤后，《分子克隆实验指南》p237-259的方法，用ncoi和bglii(takara公司)双没切鉴定，鉴定正确的单克隆所含质粒为pg-gbssip，扩大培养含pg-gbssip重组菌，并对pg-gbssip中目的gbssip测序，正确gbssip序列在genbank注册号为ay948720。
重组gbssip:glgc获得
lb液体培养基分别培养含有pg-gbssip和pc-0380的大肠杆菌，分别提取pg-gbssip和pc-0380质粒，ncoi/psti分别酶切将质粒，纯化回收gbssip和pc-0380；按照t4dna连接酶(takara公司d2011a)说明书的方法，建立连接反应，将gbssip连接于pc-0380多克隆位点ncoi和psti间；按照《分子克隆实验指南》p237-259的方法，hindiii和bamhi酶切鉴定连接是否正确，获得pc-gbssip。ncoi和bglii(takara公司)酶切pg-glgc和pc-gbssip，纯化回收glgcdna片段和pc-gbssip；按照t4dna连接酶(takara公司d2011a)说明书的方法，建立连接反应，将glgc连接于pc-gbssip中的gbssip多下游。hindiii和bamhi分别酶切，得到约1kb和约1.2kb的片段，鉴定连接是否正确；其次扩大培养含pc-gpg重组菌，并对pc-gpg中目的gbssip:glgc测序，获得序列正确pc-gpg，其中包含重组基因gbssip:glgc。
内源agpase小亚基编码基因ssu获得
按照rna提取试剂盒(amresco公司，k312-50rxn)说明书，提取马铃薯叶片总rna，以其为模板，以引物apf：5’gcaatcacactctaccaca3’，apr：5’tttttttttgagtaatttattt3’用cdnasynthesis试剂盒(takara公司，6130)说明书完成rt-pcr，pcr产物纯化回收(promega；wizardsvgelandpcrclean-upsystem)后，用回收产物和pgem-t载体(promega，pgem-tvectorsystems,a1360)建立连接反应，按照pgem-t载体说明书的方法，将连接产物转化dh5α(takara公司)感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体琼脂平板上，37培养12小时后挑选白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养12小时。按照《分子克隆实验指南》p19-23的方法，提取菌液质粒dna，充分洗涤后，用psti和ncoi双酶切鉴定，鉴定正确的单克隆所含质粒为pg-ssu，扩大培养含pg-ssu重组菌，并对pg-ssu中目的gbssi测序，测序结果在genbank注册，其注册号为dq297414。
重组35s:anti-ssu获得
lb液体培养基分别培养含有pg-ssu和pc-1305的菌株，分别提取质粒pg-ssu和pc-1305，按照《分子克隆实验指南》p237-259的方法，分别建立酶切反应，ncoi和spei分别双酶切pg-ssu和pc-1305,回收纯化ssu和pc-1305载体目的片段，按照t4dna连接酶(takara公司d2011a)说明书的方法，建立连接反应，连接两片段得到pc-sas，分别用ecori和hindiii酶切证实连接正确；将含正确连接的pc-sas扩大培养，并对pc-sas中目的anti-ssu测序。
重组gbssi:glgc::35s:anti-ssu获得
lb液体培养基分别培养含有pc-gpg和pc-sas的菌株，分别提取pc-gpg和pc-sas质粒dna，按照《分子克隆实验指南》p237-259的方法，用psti/bamhi，psti/bglii分别酶切pc-sas和pc-gpg，纯化回收dna片段，按照t4dna连接酶(takara公司d2011a)说明书的方法，建立连接反应，将glgc连接于35s启动子下游；按照《分子克隆实验指南》p976-982的方法，bamhi和psti酶切鉴定，获得亚克隆重组菌株pc-sas-gpg，其中包含重组基因gbssi:glgc::35s:anti-ssu。
重组目的基因获得
以pc-glgc载体质粒dna为模板，用引物yxf:5’cacaggaaactagttatga3′，yxr:5’agacacgcgtaataaagtaatc3’进行pcr,pcr产物及载体pc-sas-gpg经spei和mlui双酶切，回收纯化pcr产物和载体骨架片段，按照t4dna连接酶(takara公司d2011a)说明书的方法，建立连接反应，将回收纯化pcr产物(35s:glgc)连接于pc-sas-gpgspei和mlui间，按照《分子克隆实验指南》p976-982的方法，bamhi和psti酶切鉴定，获得亚克隆重组菌株pyxi，其中包含重组基因gbssi:glgc::35s:glgc::35s:anti-ssu。
重组目的基因功能检测
按照visser等的方法，以马铃薯无菌苗直径2-4mm茎段为外植体，用农杆菌介导途径转化目的基因35s:glgc和gbssip:glgc于马铃薯体内；pcr阳性转化株系，经过southern杂交(北京美莱博医学科技有限公司,法地高辛标记试剂盒，地高辛杂交检测试剂盒)获得单拷贝插入株系，rt-pcr和northern杂交(北京美莱博医学科技有限公司,法地高辛标记试剂盒，地高辛杂交检测试剂盒)鉴定目的基因是否转录，用yao等的方法测定agpase活力，用淀粉测试盒(bioassay公司，enzychromstarchassaykit)测定块茎淀粉含量，块茎直链淀粉含量按照hovenkamp-hermelink等的方法进行；充分洗净且干燥的淀粉，制成4％(w/v)悬浮液,依据3mm(上海申谊玻璃制品有限公司)毛细管粘度计法测定淀粉粘度。
通过pcr等方法，在体外条件下通过点突变实现本发明所用glgc55编码蛋白质中的4个突变，获得glgc55同样的dna序列；另外，本发明用技术方案中描述的酶切连接获得35s:glgc::gbssi:anti-gbssi重组基因，通过与此不同的其它酶切连接，也可获得重组基因35s:glgc和gbssi:glgc。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110>南京固山生物技术有限公司
<120>一种交联淀粉生物合成重组基因yxi及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>7102
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ggatctctgaacatacatgtaaaacctgcattatcgctcctgtttatgccctaacttccg60
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