一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法与流程

本发明属于干细胞技术领域，尤其是涉及一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法。

背景技术：

胚胎干细胞(embryostemcells,escs)可以从附植前的早期胚胎的内细胞团(innercellmass,icm)或者胎儿原始生殖细胞(primordialgermcells,pgcs)分离筛选获得，具有体外培养无限增殖、自我更新和分化为三胚层细胞的能力。小鼠和人的escs分别在1981年和1988年获得。随着干细胞技术的发展，其他物种包括猪、猴子、兔子、猫、大鼠以及山羊也都相继建立了escs。目前普遍被认同的具有权威性的escs也仅是人，猴子和几种啮齿类物种。而在大家畜物种方面，包括山羊目前还未获得公认权威性的escs，因此阻碍了转基因山羊方面的研究及应用。

2006年，山中伸弥团队首次提出诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,ipscs)技术。该研究显示出诱导多能干细胞与胚胎干细胞具有相似之处，如基因的表达模式、染色质的甲基化程度、拟胚体的形成、畸胎瘤和嵌合体的形成，因此ipscs和escs有着相似的潜能及体内外分化的能力。目前获得山羊ipscs的方法主要是采用病毒或者质粒载体转入外源多能因子，但是这种方法存在一定的致瘤性，而且可能引起病毒载体和外源转录因子序列整合到宿主细胞，因此严重阻碍ipscs的后续应用。

目前诱导多能干细胞(ipscs)诱导方法主要可以分为两大类，病毒介导法与非病毒介导法。病毒介导法主要包括利用逆转录病毒，慢病毒，仙台病毒和腺病毒等将转录因子导入体细胞进而获得ipscs的方法，病毒基因序列及外源转录因子序列永久地整合入细胞的基因组中，有可能引起插入突变，甚至导致肿瘤的发生，有潜在的安全问题，严重限制了ips细胞在基础研究和临床研究中的应用。另外非病毒介导法主要包括：质粒转染、蛋白质诱导、mrna诱导以及小分子化合物诱导法等。质粒转染法可以避免病毒的使用，但是没法完全排除外源基因整合并对宿主造成不良影响的可能。虽然使用蛋白质直接介导法能够完全避免这一问题的发生，但是这种方法的重编程效率非常低，重复性较差，没有太大的实际应用价值。目前的研究表明在人ipsc重编程的研究上，mrna诱导法已经可以获得无外源基因整合的人ipsc细胞系。但是以上的介导方法都无法避免使用外源的基因片段，因此都可能为后续的应用带来生物安全性的风险。山羊作为一种重要的动物乳腺生物反应器，通过对山羊干细胞系进行操作，在生物制药、重组蛋白生产、药物筛选以及医药临床试验方面的应用，人类疾病模型的建立以及物种改良等方面意义重大。因此，获得无病毒载体及无外源基因整合的山羊诱导多能干细胞迫在眉睫。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法，以获得无病毒无外源基因整合的山羊诱导多能干细胞，为后续研究提供了更好的细胞材料。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)山羊耳缘成纤维细胞及小鼠胎儿成纤维细胞的分离；

(2)饲养层的制备；

(3)细胞培养基配制；

(4)山羊诱导多能干细胞样克隆的生产；

(5)山羊诱导多能干细胞样克隆形态特征的识别以及生物学特性的鉴定。

进一步的，所述步骤(1)中山羊耳缘成纤维细胞培养方法如下：采集日龄30天以内的山羊耳缘组织块，用含有双抗的pbs缓冲液清洗三次之后用灭菌眼科剪刀将组织块剪碎，然后将小的组织块均匀置于培养皿中，倒置培养箱中并观察组织块是否贴壁牢固，贴壁后加入含10％fbs的高糖dmem培养基，放置于37℃、5％co2培养箱中培养，细胞汇合度达到90％时，进行细胞传代，培养3-5代用做诱导所用的体细胞。

进一步的，所述步骤(1)中小鼠胎儿成纤维的分离方法如下：从孕期为13.5天的昆明白鼠子宫内取出小鼠胎儿，pbs清洗干净，去除胎儿的头部、尾部、四肢以及内脏，余下组织使用含双抗的pbs冲洗干净并置于灭菌的1.5ml离心管中，用眼科剪剪碎之后进行组织块贴壁培养，贴壁后加入含10％fbs的高糖dmem培养基，放置于37℃、5％co2培养箱中培养，当细胞汇合度达到90％左右，进行细胞传代培养或者冻存。

进一步的，所述步骤(2)饲养层的制备方法如下：

从液氮罐中取出冻存的小鼠胎儿成纤维细胞，室温下放置15s，于37℃恒温水浴锅快速解冻，然后用含10％fbs的高糖dmem培养基培养，待细胞汇合度达到90％时，用含10μg/ml丝裂霉素c的高糖dmem培养基处理1.5-2h，再使用0.25％胰酶消化细胞，血球计数板对细胞进行计数，按照5×10⁴/ml细胞密度接种于四孔板中，用含有10％fbs的高糖dmem培养基培养细胞。

进一步的，所述步骤(3)中细胞培养基配制包括山羊或者小鼠成纤维细胞培养基和山羊成纤维细胞诱导重编程及传代培养基，其中山羊或者小鼠成纤维细胞培养基的成分包括90％高糖dmem与10％胎牛血清；其中山羊成纤维细胞诱导重编程及小分子化合物诱导山羊多能干细胞样细胞(cipscs-like)传代培养基包括dmem-f12、神经基质培养基、20％血清替代物、n-2添加剂、b-27、glutamax-1，培养基中添加的小分子化合物包括丙戊酸、chir98014、alk5小分子抑制剂、单胺氧化酶抑制剂、毛喉素、ttnpb和3-dznep。

进一步的，所述步骤(4)山羊诱导多能干细胞样克隆的生产步骤如下：以1×10⁵～4×10⁵的细胞密度接种山羊成纤维细胞于60mm培养皿中，隔天更换培养基为诱导培养基，每两天进行换液，在诱导至10-12天时，使用酶消化和机械法进行类克隆传代，用自制捡卵针将类克隆接种于铺有mefs饲养层的四孔板中，继续培养观察细胞诱导过程形态变化。

进一步的，所述步骤(5)山羊诱导多能干细胞样克隆形态特征的识别以及生物学特性的鉴定。山羊诱导多能干细胞类克隆显示圆形或者岛屿状三维立体结构，克隆边界清晰，边缘折光性强。另外，rt-pcr结果显示小分子化合物诱导山羊多能干细胞样细胞(cipscs-like)表达多能相关基因oct4、sox2、nanog、cdh1、tdgf和dax1；免疫荧光结果显示获得的cipscs-like表达多能基因oct4、sox2以及黏连蛋白e-cadherin，表面特异性抗原ssea-1，但是未检测到ssea-4及tra-1-60的表达；体外分化实验结果显示cipscs-like可以自发分化形成拟胚体及三胚层细胞，rt-pcr结果显示拟胚体表达中胚层基因包括actc1,vimentin,sma和bmp4；外胚层基因包括nfh和tubb3；内胚层基因sox17；免疫荧光结果显示cipscs-like细胞自发分化后形成不同类型细胞表达sox17(内胚层)，cytokeratin9(内胚层)，sma(中胚层)，βiii-tubulin(外胚层)和gfap(外胚层)。

相对于现有技术，本发明所述的一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法具有以下优势：

(1)本发明所述的一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法，使用完全小分子化合物方法诱导山羊体细胞重编程可以获得无病毒载体无外源基因整合的诱导多能干细胞，为后续研究提供了更好的细胞材料，本制备方法操作简单，易于重复，诱导周期短，安全性极高，采用本制备方法获得山羊诱导多能干细胞样克隆与小鼠escs形态更加类似；

(2)本发明所述的一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法，采用化学成分明确，无血清的培养基，更有利于重编程相关分子机制的探讨；

(3)本发明所述的一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法，首次使用完全小分子化合物组合诱导山羊体细胞重编程，为偶蹄类动物获取诱导多能干细胞提供新的方法，为山羊诱导多能干细胞的体外培养系统的进一步研究提供了有利条件。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明的实验操作流程图；

图2为本发明实施例所述的细胞诱导过程形态变化及传代后图片

a-g分别为诱导山羊成纤维细胞0d，2d，4d，6d，8d，10d及12d的细胞形态，h和i分别为诱导细胞4d和12d后高倍镜下细胞形态，j显示阳性ap染色的原代类克隆，k-m显示传代后1，2，3代类克隆形态，n显示解冻类克隆后的形态；

图3为本发明实施例所述的rt-pcr及qrt-rcr鉴定多能性相关基因的表达鉴定结果图

其中图3-a为获得小分子化合物诱导山羊多能干细胞样细胞(cipscs-like)表达多能相关基因oct4、sox2、nanog、cdh1、tdgf和dax1，图3-b显示不同诱导细胞株获得的cipscs-like细胞株与成纤维细胞株相比，多能基因oct4、sox2、nanog、cdh1、tdgf和dax1的相对表达水平；

图4为本发明实施例所述的多能性相关基因间接免疫荧光图；

图5为本发明实施例所述的拟胚收集后进行贴壁培养，自发分化为不同类型细胞图

其中a为简单拟胚体，b为复杂拟胚体，c为上皮样细胞，d为肌纤维样细胞，e为神经元样细胞，f为成纤维样细胞；

图6为本发明实施例所述的三胚层特异性基因的表达图；

图7为本发明实施例所述的自发分化为不同类型细胞的免疫荧光结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

实施例1

一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1、山羊耳缘成纤维细胞及小鼠胎儿成纤维细胞的分离

从山羊养殖场采集日龄30天以内的山羊耳缘组织块，用含有双抗的pbs缓冲液清洗三次之后用灭菌眼科剪刀将组织块剪碎，然后将小的组织块均匀置于培养皿中，倒置并及时观察组织块是否贴壁牢固，加入适量含10％fbs的高糖培养基培养，尽量避免组织块漂浮起来，然后置于37℃、5％co2培养箱中培养。次日可适量补加培养液，之后每两天换液一次。。待细胞达到90％汇合度时可进行传代。小鼠胎儿成纤维的分离方法：从孕期为13.5d的昆明白鼠子宫内取出小鼠胎儿，pbs清洗干净，去除胎儿的头部、尾部、四肢以及内脏，余下组织使用含双抗的pbs冲洗干净并置于灭菌的1.5mlep管中，用眼科剪剪碎之后进行组织块贴壁培养，方法同上述山羊成纤维细胞的培养方法。山羊成纤维细胞培养3-5代后，用作诱导所用的体细胞。

2、饲养层的制备

从液氮罐中取出冻存的mefs，空气中放置15s，于37℃恒温水浴锅快速解冻。之后用含10％fbs的高糖dmem培养基培养。待细胞汇合度达到90％时，用含10μg/ml丝裂霉素c的高糖dmem培养基处理1.5-2h。随后使用0.25％胰酶消化细胞，使用血球计数板对细胞进行计数，按照5×10⁴/ml细胞密度接种于四孔板中，用含有10％fbs的高糖dmem培养基培养细胞，在接种山羊cipsc-like前更换为配制的细胞培养基。

3、细胞培养基配制

其中山羊或者小鼠成纤维细胞培养基的成分包括90％高糖dmem与10％胎牛血清；其中山羊成纤维细胞诱导重编程及传代培养基包括dmem-f12、神经基质培养基、20％血清替代物、n-2添加剂、b-27、glutamax-1，培养基中添加的小分子化合物包括丙戊酸(vpa)、chir98014、alk5小分子抑制剂(alk5inhibitorⅱ)、单胺氧化酶抑制剂(tranylcypromine)、毛喉素(forskolin)、ttnpb和3-dznep。

4、山羊诱导多能干细胞样克隆(cipscs-like)的生产

以2×10⁵的细胞密度接种山羊成纤维细胞于60mm培养皿中，隔天更换培养基为诱导培养基，之后每两天进行换液，实验示意图如图1所示。诱导过程中，第四天就可以观察到细胞形态发生明显变化，经历met过程，第六天出现类克隆的形成，随着诱导时间的延长类克隆数目增多，克隆直径增大。在诱导后10-12天，使用酶消化和机械法进行类克隆传代，用自制捡卵针将类克隆接种于铺有mefs饲养层的四孔板中，继续培养，细胞诱导过程形态变化及传代后图片如图2所示。图2中结果显示山羊cipscs-like的形成，a-g分别为诱导山羊成纤维细胞0d，2d，4d，6d，8d，10d及12d的细胞形态；h和i显示诱导细胞4d和12d后高倍镜下细胞形态；j显示阳性碱性磷酸酶染色(ap染色)的原代类克隆；k－m显示传代后1,2,3代类克隆形态，n显示解冻类克隆后的形态。在培养过程中，部分类克隆出现漂浮死亡或者失去立体结构逐渐摊开分化为成纤维细胞或其他细胞。目前获得的山羊cipscs-like克隆可培养30天左右。

5、山羊cipscs-like形态特征的识别

在显微镜下观察类克隆形态，cipscs-like类克隆显示圆形或者岛屿状三维立体结构，克隆边界清晰，边缘折光性强。

6、山羊诱导类多能干细胞cipscs-like相关生物学鉴定

本发明中相关生物学鉴定主要包括碱性磷酸酶染色，rt-pcr及qrt-pcr鉴定相关基因的表达，间接免疫荧光鉴定多能相关基因及特异性表面抗原的表达，体外自发分化拟胚体及形成三胚层细胞的实验等。

6.1、碱性磷酸酶染色：使用alkalinephosphatasedetectionkit(millipore,2617338)试剂盒染色，具体操作如下：pbs缓冲液冲洗三次，使用4％多聚甲醛(pfa)室温固定10min，pbs清洗一遍后，按照试剂说明书配制ap染色液进行避光染色15-30min，之后pbs冲洗三遍显微镜下观察，结果如图2-j所示。结果显示细胞染上蓝色，表明细胞具有碱性磷酸酶活性。

6.2、rt-pcr及qrt-rcr鉴定多能性相关基因的表达

主要操作如下：本发明中，山羊诱导多能干细胞(cipscs-like)总rna提取使用trizolreagent裂解法；使用反转录试剂盒primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara,ak4102)将提取的总rna样品反转录合成cdna，反转录获得的cdna样品用rt-pcr(2×taqpcrmastermix(tiangen,kt201))和qrt-pcr(sybrpremixextaqtmii(takara,ak9402))试剂盒进行检测。检测所用引物用oligo7软件设计并在ncbi上对其特异性进行分析，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用引物序列如表1所示，此部分鉴定结果如图3，图3-a该结果显示获得cipscs-like表达多能相关基因oct4、sox2、nanog、cdh1、tdgf和dax1；图3-b显示不同诱导细胞株获得cipscs-like与成纤维细胞株相比，多能基因oct4、sox2、nanog、cdh1、tdgf和dax1的相对表达水平。

6.3、间接免疫荧光多能性相关基因和表面特异性抗原的鉴定

使用pbs清洗cipscs-like细胞三次，4％pfa室温固定30min，pbs清洗三次，在用阻断液(含100mmol/l甘氨酸和0.3％bsa的pbs液体)清洗三次，然后加入1％tritonx-100室温透化15min，pbs清洗三次之后加入5％牛血清白蛋白(bsa)室温封闭2h，用tbp(tritonx-100-bsa-pbs)清洗三次，然后加一抗，4℃冰箱孵育过夜。其中一抗稀释信息如下：oct4(1:300,abcam,ab18976),sox2(1:300,abcam,ab97959),ssea1(1:200,abcam,ab16285),ssea4(1:200,millipore,ab16287),tra-1-60(1:200,abcam,ab16288),e-cadherin(1:200,cst,3195s)。第二天进行室温复温20min，用tbp清洗三次，加入带有荧光标记的二抗(anti-rabbitiggh&l(alexa488)(1:200,abcam,ab150073)；anti-mouseiggh&l(alexa488)(1:200,abcam,ab150105))室温避光孵育1h，pbs清洗三次后加入hoechst(2μg/ml，sigma)室温复染核酸10min，然后置于荧光显微镜下观察拍照，免疫荧光结果如图4所示，结果显示获得的cipscs-like表达多能基因oct4、sox2以及黏连蛋白e-cadherin，表面特异性抗原ssea-1，但是未检测到ssea-4及tra-1-60的表达。

6.4、体外自发分化拟胚体及形成三胚层细胞的鉴定：使用胰酶消化cipscs-like克隆，制成细胞悬液，然后在60mm的培养皿中制成微滴，20微升/滴，然后将培养皿倒置悬浮培养，注意观察悬滴中液体量，2-3天进行补液，培养12天左右可见拟胚体的形成。然后将一部分拟胚体收集提取rna，检测是否有三胚层特异性基因的表达，结果如图6所示，显示有三胚层特异性基因的表达。包括中胚层基因actc1,vimentin,sma和bmp4，外胚层基因nfh和tubb3；内胚层基因sox17。同时将另一部分拟胚收集后进行贴壁培养，自发分化为不同类型细胞，结果如图5所示，其中a，b分别为简单及复杂拟胚体；c-f分别为分化后形成的不同细胞类型：上皮样细胞，肌纤维样细胞，神经元样细胞以及成纤维样细胞。另外，对于自发分化为不同类型细胞进行免疫荧光检测，检测中使用的一抗分别为βiii-tubulin(1:100,santacruz,sc-80005),gfap(1:100,santacruz,sc-56395),cytokeratin(1:100,santacruz,sc-81714),sma(1:100,santacruz,sc-53142),sox17(1:100,santacruz,sc-130295)，操作步骤同6.3，免疫荧光结果如图7所示，结果显示cipscs-like自发分化后形成不同细胞类型蛋白水平检测的基因表达sox17(内胚层)，cytokeratin9(内胚层)，sma(中胚层)，βiii-tubulin(外胚层)和gfap(外胚层)。

表1(q)rt-pcr引物序列

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广西大学

<120>一种完全小分子化合物诱导山羊多能干细胞的制备方法

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