一种基于双面粒子稳定的皮克林乳液的制备方法及其固定化酶应用与流程

本发明涉及一种基于双面粒子稳定的皮克林乳液的制备方法及其固定化酶应用，属于乳化剂技术领域。

背景技术：

双面粒子，是指具有各向异性结构的粒子，其在化学组成和性能方面有一定的非对称性，能够将不同的物理、化学特性组合到单个微小粒子上，在乳化剂、界面催化、药物缓释、传感检测等领域具有十分广泛的应用前景。双面粒子有多种制备方法，包括界面保护法、控制成核生长法、分子自组装法以及微流控法等，其中石蜡保护修饰法制备双面粒子应用最为广泛关注。目前，双面粒子的研究主要集中在制备结构表面特征以及性能不对称的材料，以获得结构及表面形貌单一材料所不具备的特殊功能。皮克林乳液是由固体粒子在油水界面稳定的特殊乳液，有环境污染小、稳定性好及受外界环境的影响小等特点。皮克林乳液目前已经被广泛应用于活性物质释放、固定化酶等多项体系中。但是在皮克林乳液的制备上，由于粒子的多样性，经常会形成多层和组成结构复杂的乳滴，不利于内部包覆物质的释放，且稳定性不好。因此，需要构建新型单壁均匀的皮克林乳液体系。

近年来，很多研究团队尝试用不同类型的皮克林乳液固定化酶，例如：wu等^[1]首次用疏水改性的sio2纳米颗粒稳定皮克林乳液并固定化酶，其研究表明，这种酶固定化方法可以在一定程度上提高脂肪酶的酶活，但是固定化酶的重复利用性不够好。团队^[2]在此基础上以sio2稳定的油包水乳液为模板，用硅前驱体聚乙氧基硅烷将皮克林乳液界面中的sio2粒子在油-水界面交联起来，制备得到了新型的皮克林乳液，以保证其机械稳定性，但是这种方法获得的固定化酶的酶活却有所降低。因此，需要构建新型皮克林乳液体系以同时保证固定化酶的酶活及其稳定性。目前，双面粒子已在催化反应等方面有一定的应用，但是利用双亲性粒子稳定的皮克林乳液进行酶固定化的研究还未见尚未见报道。本发明参考hong等^[3]制备双面粒子的方法用石蜡保护修饰法制得了双亲性sio2粒子，之后用这种双亲性粒子稳定皮克林乳液，并将其用在酶固定化中。本发明解决了目前皮克林乳液中出现的组成结构复杂以及固定化酶中出现的稳定性差等诸多问题。

参考文献：

[1].wu,c.；bai,s.；ansorge-schumacher,m.b.；wang,d.nanoparticlecagesforenzymecatalysisinorganicmedia.adv.mater.2011,23,5694-5699.

[2].zhangc,huc,zhaoy,etal.encapsulationoflaccaseinsilicacolloidosomesforcatalysisinorganicmedia.langmuir,2013,29(49):15457-15462.

[3].hongl.,jiangs.,granicks.simplemethodtoproducejanuscolloidalparticlesinlargequantity.langmuir.2006,22,9495-9499.

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种基于双面粒子稳定的皮克林乳液的制备方法及其固定化酶应用，发明中包括双亲性sio2粒子自组装成单壁皮克林乳液的制备方法以及单壁皮克林乳液固定化酶的应用。

具体技术方案如下：

一种基于双面粒子稳定的皮克林乳液的制备方法，其特征是：以双亲性sio2纳米粒子作稳定剂，正庚烷作油相，pbs缓冲液作水相，利用高速均质机搅拌上述混合液，形成均匀的由双亲性sio2粒子组成的白色皮克林乳液。

其中，双亲性sio2纳米粒子的加入量为5-25mg，油水两相体积比为6:1-10:1，高速均质机搅拌速度为10000-20000rpm。

pbs缓冲液为10mm,ph7.4。

优选所述的皮克林乳液的油水比为6:1，双亲性sio2粒子加入量为25mg，高速均质机搅拌速度为15000rpm。

本发明制备的双亲性sio2粒子自组装单壁皮克林乳液在固定化酶上的应用：取自由酶溶液加入tris缓冲液稀释，以稀释后的酶溶液作水相，双亲性sio2纳米粒子作稳定剂，正庚烷作油相，利用均质机高速搅拌制备皮克林乳液，在制备过程中将酶包覆于水相中。其中，脂肪酶原酶溶液为10-50μl，双亲性sio2纳米粒子的加入量为5-25mg，油水两相体积比为6:1-10:1，高速均质机搅拌速度为10000-20000rpm。

所述的自由酶溶液为液体脂肪酶。

本发明涉及一种基于双面粒子稳定的皮克林乳液的制备方法及其固定化酶应用。主要利用石蜡保护修饰法制备双亲性的sio2纳米粒子，之后在油水界面组装成单壁稳定的皮克林乳液，并将酶固定在乳液水相中以测定皮克林乳液的稳定性及应用性能。本发明制得的皮克林乳液由单层双亲性sio2粒子组装而成，具有规整的单层囊壁结构，并且单层壁很薄且有许多纳米孔，可以使得反应物容易进出微囊。这种皮克林乳液可实现多种酶的包覆，使酶分子与反应底物充分接触，提高了固定化酶的稳定性和重复利用性。本发明制备的新型皮克林乳液的原料成本低，有很好的经济可行性和实用性。

本发明的有益效果

1)本发明提供了一种双亲性sio2粒子在油水界面组装成的单壁稳定的皮克林乳液，与以往皮克林乳液相比，单层壁很薄且有许多纳米孔，这种多孔结构可以使得反应物很容易地扩散进出乳液油水界面，使其无需额外的化学修饰即具有高稳定性(见附图2)。

2)本发明制备的皮克林乳液与传统两相体系相比具有更大的相界面，并且在组装过程中将酶分子包裹在其内部，使酶可以与底物分子充分接触，皮克林乳液固定化酶的酶活与游离酶相比有显著的提高(见附图4)。

3)本发明制备的双亲性sio2粒子组装的单壁皮克林乳液与以往皮克林乳液相比，仍然具有比较好的稳定性，皮克林乳液固定化酶的重复利用性能良好，能够进一步作为有机反应体系中的微反应器和酶固定化载体(见附图5)。

附图说明

图1用金纳米颗粒标记修饰氨基的双亲性sio2粒子的扫描电镜图和透射电镜图。

图2双亲性sio2粒子在正庚烷-水界面组装的单壁微囊的扫描电镜图和微囊表面结构图。

图3双亲性sio2粒子负载量对皮克林乳液固定化酶酶活的影响。

图4游离酶和双亲性sio2粒子组装的单壁微囊固定化酶的特异性酶活。

图5循环利用过程中固定化酶的相对酶活保留率。

具体实施方式

结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的详细说明：

双亲性sio2粒子自组装成单壁皮克林乳液

以参考文献中获得的双亲性sio2纳米粒子^[3]作稳定剂，正庚烷作油相，pbs缓冲液(10mm,ph7.4)作水相，利用高速均质机搅拌上述混合液，形成均匀的由双亲性sio2粒子组成的白色皮克林乳液。其中，双亲性sio2纳米粒子的加入量为5-25mg，油水两相体积比为6:1-10:1，高速均质机搅拌速度为10000-20000rpm。

双亲性sio2粒子自组装单壁皮克林乳液在固定化酶上的应用

取自由酶溶液加入tris缓冲液稀释，以稀释后的酶溶液作水相，双亲性sio2纳米粒子作稳定剂，正庚烷作油相，利用均质机高速搅拌制备皮克林乳液，在制备过程中将酶包覆于水相中。其中，脂肪酶原酶溶液为10-50μl，双亲性sio2纳米粒子的加入量为5-25mg，油水两相体积比为6:1-10:1，高速均质机搅拌速度为10000-20000rpm。

优选的，本发明所述的皮克林乳液的油水比为6:1，双亲性sio2粒子加入量为25mg，高速均质机搅拌速度为15000rpm。

优选的，本发明所述的皮克林乳液中自由酶溶液加入量为50μl。

本发明所述的自由酶溶液为液体脂肪酶。

实施例1

量取20μl脂肪酶原酶溶液，加入到180μl磷酸缓冲溶液(pbs，10mm磷酸二氢钾，ph＝7.4)，振荡摇晃3min。然后将上述稀释后的200μl脂肪酶溶液加入到含有5mg双亲性sio2粒子的2ml正庚烷溶液中，用高速均质机搅拌上述混合溶液(10000rpm，60s)。将2ml含有400mmoll^-1正己酸和正己醇的正庚烷溶液加入到固载脂肪酶的皮克林乳液中。酶催化反应在水浴摇床(80rpm，37℃)中进行，每隔一定的时间取50μl样品并离心(13000rpm，3min)用于气相色谱分析，如图3所示。结果显示：固定化酶在水-正庚烷双相体系中的酶活提高至16.2uml^-1，是游离酶酶活的3倍。

实施例2

量取20μl脂肪酶原酶溶液，加入到180μl磷酸缓冲溶液(pbs，10mm磷酸二氢钾，ph＝7.4)，振荡摇晃3min。然后将上述稀释后的200μl脂肪酶溶液加入到含有20mg双亲性sio2粒子的2ml正庚烷溶液中，用高速均质机搅拌上述混合溶液(15000rpm，60s)。将2ml含有400mmoll^-1正己酸和正己醇的正庚烷溶液加入到固载脂肪酶的皮克林乳液中。酶催化反应在水浴摇床(80rpm，37℃)中进行，每隔一定的时间取50μl样品并离心(13000rpm，3min)用于气相色谱分析，如图3所示。结果显示：固定化酶在水-正庚烷双相体系中的酶活提高至28.7uml^-1，是游离酶酶活的5倍。

实施例3

量取20μl脂肪酶原酶溶液，加入到180μl磷酸缓冲溶液(pbs，10mm磷酸二氢钾，ph＝7.4)，振荡摇晃3min。然后将上述稀释后的200μl脂肪酶溶液加入到含有25mg双亲性sio2粒子的2ml正庚烷溶液中，用高速均质机搅拌上述混合溶液(20000rpm，60s)。将2ml含有400mmoll^-1正己酸和正己醇的正庚烷溶液加入到固载脂肪酶的皮克林乳液中。酶催化反应在水浴摇床(80rpm，37℃)中进行，每隔一定的时间取50μl样品并离心(13000rpm，3min)用于气相色谱分析，如图3所示。结果显示：固定化酶在水-正庚烷双相体系中的酶活提高至29.9uml^-1，是游离酶酶活的6倍。

实施例4

量取20μl脂肪酶原酶溶液，加入到280μl磷酸缓冲溶液(pbs，10mm磷酸二氢钾，ph＝7.4)，振荡摇晃3min。然后将上述稀释后的300μl脂肪酶溶液加入到含有20mg双亲性sio2粒子的2ml正庚烷溶液中，用高速均质机搅拌上述混合溶液(15000rpm，60s)。将2ml含有400mmoll^-1正己酸和正己醇的正庚烷溶液加入到固载脂肪酶的皮克林乳液中。酶催化反应在水浴摇床(80rpm，37℃)中进行，每隔一定的时间取50μl样品并离心(13000rpm，3min)用于气相色谱分析，如图4所示。结果显示：固定化酶在水-正庚烷双相体系中的酶活提高至36.6uml^-1，是游离酶酶活的7倍。

实施例5

量取20μl脂肪酶原酶溶液，在脂肪酶稀释溶液中加入7.5mg琼脂糖，加入到180μl磷酸缓冲溶液(pbs，10mm磷酸二氢钾，ph＝7.4)，振荡摇晃3min。然后将上述稀释后的200μl脂肪酶溶液加入到含有20mg双亲性sio2粒子的2ml正庚烷溶液中，用高速均质机搅拌上述混合溶液(15000rpm，60s)。将2ml含有400mmoll^-1正己酸和正己醇的正庚烷溶液加入到固载脂肪酶的皮克林乳液中。酶催化反应在水浴摇床(80rpm，37℃)中进行，每隔一定的时间取50μl样品并离心(13000rpm，3min)用于气相色谱分析，如图4所示。结果显示：固定化酶在水-正庚烷双相体系中的酶活提高至18.5uml^-1，是游离酶酶活的3倍。