一种表达重组人神经生长因子的表达载体、体系及方法与流程

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本发明涉及一种表达人神经生长因子(rhngf)蛋白的真核细胞表达体系；

本发明还涉及重组人神经生长因子的制备方法。

背景技术：

神经生长因子(ngf)是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，是神经系统最重要的生物活性分子之一，它对中枢的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用，对调节神经元的生长、发育、分化、存活及损伤神经的再生修复具有重要的理论和临床意义。目前的基础研究表明ngf可应用于神经中毒、周围神经损伤、糖尿病性周围神经病变、老年痴呆病、帕金森氏病、面神经炎，以及神经损伤(包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植、脑损伤等中枢及外围神经系统的损伤)等神经系统疾病，是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。

ngf基因转录后生成ngfmrna，mrna翻译后首先合成ngf的前体蛋白。前体蛋白有两种，一种是长的前体蛋白，一种是短的前体蛋白。编码短的前体蛋白的mrna位于单一的外显子内，所以ngf分为两种，即7sngf和2.5sngf，通常所指的ngf为2.5sngf。2.5sngf是由118个氨基酸组成的二聚体，整个ngf的生物活性全依赖β亚单位，其沉降系数为2.5s，又称2.5sngf。完整的hngf分子由1个β亚单位、2个α亚单位和2个γ亚单位以非共价键结合为α2βγ2的形式，分子中还包括2个锌指，以增加复合物的稳定性。β亚单位分子量为26518，其pi是9.3，通过非共价链结合而构成二聚体。其中，6个半胱氨基酸残基之间有二硫键相连，这些二硫键对维持ngf的生物活性十分重要，一旦破坏则活性全部丧失。

hngf在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能。因此，用基因工程的方法生产重组人神经生长因子(rhngf)是唯一的选择。目前神经生长因子的上市产品主要来源于小鼠的颌下腺提取，而雄性小鼠颌下腺是纯化ngf和分析其生物活性的主要供体。我国研制的注射用鼠神经生长因子是获得国家食品药品监督管理局(sfda)颁发的一类生物制品新药证书。中国药典2015版对鼠源ngf规定其蛋白质含量不低于0.1mg/ml,比活性不低于5*10⁵au/mg(国家药典委员会编，中华人民共和国药典2015版)。2001年厦门北大之路生物工程有限公司的ngf获批，成为全世界第一个ngf药品。截止目前，国内已经有多个厂家获批ngf，而且成为最畅销的药品之一，根据ims数据，2016年我国ngf销量达1100万支，销售总额达2.15亿美元(按出厂价)。

2017年7月6日，ema批准了意大利dompé公司的重组人神经生长因子(cenegermin)滴眼液用于中重度神经营养性角膜炎(nk)治疗，神经营养性角膜炎是一种罕见的眼科疾病，治疗方案缺乏，疗效差，因发病率不到万分之五，cenegermin被ema授予了孤儿药资格。其二期临床试验的结果显示，本品都表现出非常好的疗效，治疗组的完全治愈率显著高于安慰剂组。本品安全性良好，主要不良反应是眼痛、流泪等。oxervate通过重组dna技术生产，避免了动物源ngf病毒的感染风险，而且质量更加可控。oxervate以滴眼液(20μg/ml)的形式施用于神经营养性角膜炎患者，操作简单，辅助恢复眼的正常愈合过程，修复角膜损伤效果良好。该公司宣布oxervate将在2017年年内登录欧洲市场，并准备向fda和pmda申请nda。

迄今为止，雄性小鼠颌下腺是纯化ngf和分析其生物活性的主要供体，但是鼠源ngf有以下几个显著缺点：①需要使用大量小鼠分离颌下腺组织，有悖于动物福利原则；②产品质量难以保证，并且，ngf含量低且难以避免异源蛋白质的污染；③组织材料预处理以及纯化工艺都较为复杂；④更重要的是鼠ngf氨基酸组成与空间结构与人ngf相比仍然存在明显差异，长期使用具有潜在的危险性，亟需研制重组人ngf进行升级换代，替代现有产品。

基因重组ngf的生产较传统小鼠颌下腺提取工艺有明显优势。利用体外重组技术合成β-ngf，在原核细胞中虽然可获得表达,但因合成的多肽不能折叠使得活性较低(刘东海等.人神经生长因子β亚基cdna的克隆及在大肠杆菌中的表达,中国病理生理杂志，2002,5:39-42)。在真核细胞中表达,更有利于得到活性较高和更接近自然合成的β-ngf蛋白,且因其分子小(分子量小于40kd)易于透过血脑屏障(韩晓枫等，人β-神经生长因子基因的体外扩增、克隆及其序列的分析，苏州医学院学报,1999，19(12):1271-1273.)。在真核细胞表达相对于原核细胞表达有较多优点:一、可使表达的蛋白质获得加工,如空间构型的折叠、糖基化和磷酸化等；二、可识别和除去外源基因中的内含子,剪切加工为成熟的mrna；三、转染目的基因的真核细胞可冻存,复苏后能稳定表达活性目的蛋白(粟谋等，pcdna3-hngf真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达，中国骨质疏松杂志，2016，22(1)，41-44)。

国外用真核系统大规模表达、纯化ngf已有成熟工艺，而用原核系统(e.coli)表达的rhngf2β多因不能正确折叠而使生物学活性比鼠源的ngf低50倍，所以多建议用真核表达系统来克服蛋白错误折叠问题。近年来,研究人员通过构建具有前导序列的ngf来帮助其体外复性，虽然复性率有所提高，但产物需经限制酶切后才能获得成熟ngf，增加后续处理难度(栗炳南等，pires2-ngf-nt-3真核表达载体的构建与鉴定，生命科学研究，2014,18(4),315-322)。普遍认为，综合两种表达体系，哺乳动物表达系统具有分泌正确装配、折叠与糖基化等特点，更适合表达ngf。

韩晓枫(韩晓枫等.人b-ngf基因在cos-7细胞中的表达及其生物学活性的研究.细胞与分子免疫学杂志,2001,4:310-313.)在cos-7细胞中对ngf进行了一过性表达,表达产物具有生物活性,但是无法实现ngf的稳定、长期表达，通常只作为瞬时表达宿主细胞。因此，在基因工程制药中,往往选择cho细胞作为宿主细胞。利用cho细胞表达外源基因有利于二硫键形成的细胞环境。该表达系统拥有完备的转录后加工过程,包括糖基化、羧基化,使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性,并且哺乳动物细胞能够使其表达产物分泌到胞外的培养基中,有利于外源蛋白的分离纯化(陈勇，人β-ngf真核表达载体的构建及其表达产物的生物活性，中国生物制品学杂志，2005，6(18),457-461.)。专利201210206171.0基于cho细胞表达系统制备的人重组神经细胞生长因子纯化后比活大于5×10⁵u/mg。

因此国内外许多研究机构都采用cho细胞表达系统表达了重组人ngf，活性测定结果表明，与鼠源性ngf相比，重组人ngf具有良好的生物活性。但是表达产物的生物学活性和表达水平是制约重组ngf产业化开发的关键因素和难点，且文献报道的cho细胞的表达水平较低，较难筛选到高表达细胞株,最高才达到10mg/l左右，难以实现产业化开发(countsse,mufsonej.theroleofnervegrowthfactorreceptorsincholinergicbasalforebraindegenerationinprodromalalzheimerdisease.jneuropatholexpneurol；2005,64(4),263-272)。

为了筛选高效表达的载体,有人运用基因工程技术，构建了人神经生长因子的三种真核表达载体质粒，分别为pmd902-β-ngf、pcdna3.1-his-β-ngf、pcdna3.1-4.0-his-β-ngf去转染cho细胞，筛选表达人神经生长因子，经检测pcdna3.1-4.0-his-β-ngf表达量最高约为28.3ng/ml(戚菁，不同真核载体表达人神经生长因子，南京医科大学，2009)。有研究使用了经过无血清驯化悬浮培养的cho细胞作为转染载体，经筛选后其细胞株表达量可达25.5mg/l，(刘荷中乐伟等，高效表达重组人神经生长因子的cho细胞株及其构建方法，中国专利，cn102586190a).还有使用了双基因共扩增的表达载体构建方式，使两个基因扩增系统之间达到了协同的效果，从而使ngf目的基因拷贝数增多，ngf蛋白得到较高的产量,经半固体培养基克隆化筛选和扩大培养后，最优单克隆细胞株在收获时重组人ngf表达水平达到50mg/l(乐伟等，重组人神经生长因子的高效表达和生物活性评价研究，中国药事，2014,28(6)，601-606)。

寻找更好的人神经生长因子表达系统，获取更高产量、更高纯度一直是大家的研究方向。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供表达重组人神经细胞生长因子的慢病毒表达载体；

本发明的另一个目的是提供含有上述慢病毒表达载体的真核细胞表达体系；

本发明的再一个目的是提供一种重组人神经生长因子的制备方法。

将所述重组人神经生长因子的基因插入慢病毒表达载体-plx-puromycin构建重组表达载体，使用cho细胞培养进行重组人神经生长因子的分泌表达。

具体包括如下步骤：

ⅰ将重组人神经生长因子基因可操作地连接于plx-puromycin慢病毒载体，构建重组表达载体(如图3所示)；

ⅱ将步骤ⅰ构建的重组表达载体进行病毒包装；

ⅲ将步骤ⅱ所述的病毒转染宿主细胞，培养收集病毒颗粒；

ⅳ将步骤ⅲ所述病毒颗粒转染表达细胞，获得能表达重组人神经生长因子的重组细胞；

ⅴ收集重组细胞表达的重组人神经生长因子的粗提液；

ⅵ对步骤ⅴ的重组人神经生长因子的粗提液依次进行疏水作用柱层析、金属螯合柱层析、离子交换柱层析，最终得到纯度到达99％的重组人人神经生长因子.

益效果：该方法制备的的重组人神经生长因子的表达率达到30.4％；细胞上清液中的蛋白达到0.17mg/ml。另外经过和上市的小鼠颌下腺的样品，意大利(近期在欧盟上市的产品)的原液进行比较发现，用本专利表达和纯化的rhngf的纯度可达到99％以上，比活达到2.5*10⁶iu/mg,高于对照样品和文献报道结果。

附图说明

图1.beta-hngf和组氨酸标签的扩增基因电泳；

图2.载体的酶切片段电泳；

图3.构建完成的重组载体图谱；

图4.wb检测his-hngf表达；

图5.pcr验证阳性克隆his-hngf表达；

图6.电泳验证阳性克隆his-hngf表达；

图7.hic图谱；

图8.ac图谱；

图9.iec图谱；

图10.rhngf蛋白产品纯度检测；

图11.mtt法检测蛋白产品活性。

具体实施方式

以下通过实施例进一步详细说明本发明的优点和特点，不应理解为是对本发明的限制，所使用的实验设备和材料如无特殊说明，均为普通市售。

【实施例1】hngf基因的选取和载体构建

基因名称：beta-hngf，genbank编号：nm_002506。其dna序列如seqno.1所示，其编码的氨基酸序列如seqno.2所示。

以慢病毒载体为模板，用常规pcr方法扩增beta-hngf基因，通过分子克隆方法将目的基因插入到慢病毒载体中，构建表达载体(同时插入标签)，从而能表达n端带有6×his标签的目的蛋白，便于纯化。

1.1基因扩增

慢病毒载体名称：plx-puromycin(购自thermo,货号ohs4735)，标签：ha-his，插入片段：nm_002506；

表1：引物设计

表2：pcr反应体系:

表3：pcr反应程序

pcr反应结束后，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测pcr产物，如图1所示。扩增得到hngf产物序列如seqno.3所示和his产物序列如seqno.4所示。

1.2.对载体的酶切

表4：酶切体系

37℃酶切30分钟，琼脂糖凝胶电泳分离回收，电泳结果见图2。

1.3.对琼脂糖凝胶进行酶切片段的收集和重组

(1)在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的dna条带切下，尽量切除不含dna的凝胶，得到凝胶体积越小越好。

(2)将切下的含有dna条带凝胶放入1.5ml离心管(原则上应称重，也可以估算)，加入3倍体积溶胶液dd(大约400μl)。

(3)56℃水浴放置10min(或直至胶完全溶解)。每2～3min颠倒混匀一次加速溶解。

(4)将上一步所得溶液加入吸附柱ec中(吸附柱放入收集管中)，室温放置1min，12000rpm离心60sec，倒掉收集管中的废液。

(5)加入500μl漂洗液wb，12000rpm离心30sec，弃掉废液。

(6)将吸附柱ec放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(7)室温放置5min。

(8)取出吸附柱ec，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入30μl超纯水(超纯水事先在65～70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2min，12000rpm离心1min。

(9)片段重组：将上述片段通过重组连接完成质粒构建，37℃重组30分钟，得到重组产物；

表5：重组体系

1.4.用重组产物的转化大肠杆菌top10

①使用北京全式金公司的trans1-t1phageresistant化学感受态细胞，按照说明书进行。

②把连接产物加到解冻后的感受态细胞里；

③冰浴30min；

④42℃热激30sec，热激完再冰浴2min；

⑤复壮：取500ul无抗生素的lb培养基加入其中，37℃恒温摇床复壮45min；

⑥涂平板：离心后去除上清，留少量培养基重悬细胞后用涂布棒均匀涂至含有抗性的

⑦lb固体平板上。37℃培养过夜。

⑧如果是蓝白斑筛选，那么需要在固体培养基平板上预涂x-gal和iptg，两者按照10:1比例混合。

⑨挑取阳性克隆。

1.5.提取阳性扩增克隆中的质粒

①取1～2ml过夜的菌液，12000g离心2min，弃上清。

②加250μlbufferp1，振荡混匀细菌沉淀，勿残留细小菌块(bufferp1加之前确认已加入rnase)。

③加250μlbufferp2，轻轻上下颠倒混匀4～6次，使菌体充分裂解(此步骤不宜超过5min)。

④加350μlbufferp3，轻轻上下颠倒混匀6～8次，12000g离心10min。

⑤将制备管置于2mlep管(废液收集管)中，吸取步骤4中的上清到制备管中，12000g离心1min，弃废液。

⑥将制备管置回ep管，加700μlbufferpw，12000g离心1min，弃废液。

重复步骤。

⑧将制备管置回ep管，12000g离心2min。

⑨将制备管放入新的1.5mlep管中，自然风干(约5min)，在制备管膜中央加30μl超纯水，室温静置2～3min，12000g离心1min。

构建完成的载体图谱见图3，经测序验证，测序结果显示没有突变。

【实施例2】重组慢病毒载体的包装

2.1.293t细胞(购自atcc,crl3216)的冻存、复苏和培养

2.1.1293t细胞的冻存(293t细胞的培养液为dmem+10％fbs+1％双抗)随着传代的次数增加，293t细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

①在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

②倒去细胞上清液，加入pbs缓冲液洗去残留的培养基。

③加入0.05％胰酶1ml，消化1-2分钟。

④镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基3ml吹打混匀。

⑤将细胞离心，1000rpm，2min。

⑥加入细胞冻存液(70％完全培养基+20％fbs+10％dmso)重悬细胞，调整密度约为3×10⁶个/ml。

⑦分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低温冰箱。

⑧第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

⑨复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。

2.1.2.293t细胞的传代

1)当细胞生长至汇合率达到80～90％需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2)加入0.05％胰酶1ml，消化细胞1-2分钟。

3)细胞离心弃去上清后，加入完全培养基重悬细胞。

4)分到10cm培养皿中，10ml/皿。

5)放回37℃、5％co2和95％相对湿度的培养箱中培养。

2.1.3293t细胞的复苏

あ当细胞传代次数过多(超过30代)，细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

ぃ打开水浴锅，设置温度为37℃。

い查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞(需戴上棉手套，防止被冻伤)，迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1～2min内使细胞溶液完全溶解。

ぅ将1ml细胞溶液加入9ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

う放回37℃、5％co2和95％相对湿度的培养箱中培养。

ぇ第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。

2.2.慢病毒的包装

磷酸钙转染溶液准备：2mcacl2溶液，2xhbs溶液(50mmhepes，280mmnacl，10mmkcl，ph7.05)

步骤

①预先准备10cm皿293t细胞，培养基为dmem+10％fbs，1％青霉素-链霉素。

②将细胞分到新的10cm皿中，每皿的细胞密度约3e6-4e6/个。

③第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为40-50％，分布均匀。

④转染前2小时，取出皿，去除原有细胞培养基，加入8ml新鲜dmem完全培养基，将细胞送回培养箱。

⑤以包装1个10cm皿为例，准备溶液a和溶液b(材料购自biovectorsciencelab)：

溶液a：重组慢病毒载体10μg，包装质粒1(pax2：10ug)，包装质粒2(vsvg：5ug)，2mcacl250μl，用纯水定容到400μl；(注：实际加入管中的顺序为：水，质粒，和cacl2)混匀。

溶液b：400μl2×hbs溶液；

⑥将溶液a逐滴加入到溶液b中，混匀；室温静置15分钟。

⑦将上述a和b混合液800ul逐滴加入步骤④的293t细胞中，轻轻混匀，放置37度co2培养箱培养5-6h。

⑧取出转染后的皿，吸尽弃去上清液体，更换预热到37℃的完全培养液，继续培养过夜。

⑨换液后24h第一次收集上清液，入50ml离心管，并向原皿中添加10ml新鲜培养液，继续培养。

⑩24h后再收集一次上清液，可以和第一次收集的上清液合并。

上清液3000g离心10分钟，收集上清部分，过0.45微米滤膜。

【实施例3】重组慢病毒颗粒的转染和筛选

慢病毒侵染cho细胞(购自atcc,crl-9096)

1)细胞计数：cho细胞按照六孔板，每孔2×10⁵数量计数，培养箱中培养过夜。

2)侵染细胞：将包装好的慢病毒颗粒的悬液，加到六孔板中(1ml病毒+1ml新鲜培养基)。加入辅助试剂polybrene至终浓度为8μm。侵染过夜后，次日更换为新鲜培养基。

3)筛选：病毒侵染过的细胞加入嘌呤霉素(puromycin)至终浓度为3μg/ml，48小时后没有被侵染的细胞会大量死亡。

4)把侵染成功的细胞分单克隆并扩增培养。

5)待细胞扩增后收取细胞提取总蛋白，westernblot，pcr验证。

【实施例4】westernblot验证细胞系的his-hngf表达

依据实验需要，我们采用mini胶和amersham的梯度胶系统。

表6：amersham(ge)梯度胶的配方：

具体流程如下：

a.洗板、组装：玻璃板尽量洗干净，待干燥后组装。

b.分离胶的灌入：mini胶直接将配置好的分离胶加好temed后灌入玻璃板中，最后用无水乙醇压平；梯度胶的制备是将4％和18％分离胶各取15ml汇入梯度混合仪，配合磁力搅拌装置灌入玻璃板之间，最后形成4-18％的梯度范围，灌完用无水乙醇压平。

c.浓缩胶的灌入：将浓缩胶加好temed后加入玻璃板间，按照需要选择好梳子插入其中，避免气泡。室温聚合20-30min。

d.上样：准备好的蛋白样品100℃加热5min，之后13000rpm离心2分钟。用蛋白上样专用枪头上样，每孔20-60ul样品。

e.电泳：加好1×tgsbuffer，电泳方向由负极向正极。

f.蛋白免疫印迹杂交(westernblot，wb)

g.sds-page电泳。

h.转膜：待溴酚蓝指示剂跑至凝胶底部终止电泳，开始转膜。配置好含有终浓度为20％的甲醇1×tg转膜缓冲液，pvdf膜提前用甲醇通透活化至透明状。按照滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸的顺序装入转膜夹中，注意把各层气泡尽量驱除干净。转膜方向为从负极到正极，条件为恒流400ma，4℃层析柜中转膜4.5-5h。

i.封闭：转膜完毕取出，按照目的蛋白的大小位置切取相应的条带放入杂交盒。加入2％脱脂牛奶或5％bsa封闭1h。磷酸化抗体的条带用5％bsa封闭。

j.一抗：按照一定比率用牛奶加一抗(anti-hisantibody：1：5000，mouse，abmart)。4℃层析柜孵育过夜。

k.洗膜：次日，取出膜放入杂交盒。用0.05％的pbst洗膜3次，频率为5min/次。

l.二抗：依据一抗的属性，按照一定比率加入二抗(偶联辣根过氧化物酶)，室温孵育1h。

m.洗膜：二抗时间到了之后，用0.05％的pbst洗膜3次，频率为5min/次。

n.显影：加入supersignal^tmwestfemtosubstrate(ecl),放入las-4000中检测化学发光信号。

o.wb检测结果见图4。

【实施例5】pcr验证阳性克隆his-hngf表达和电泳检测蛋白的表达率

5.1.检测引物设计。

引物设计原则：上游引物在his基因上，下游引物在hngf上。

引物序列：

a.det.s：tgctggttattgtgctgtc

b.det.a：ttgctctctgagtgtggtt

5.2.细胞rna提取

选择wb检测阳性克隆，扩增细胞提取细胞总rna，具体步骤如下：

①移除6孔板内培养基，pbs洗一次，每孔加1mltrizol^tmreagent裂解细胞，反复吹打使细胞完全裂解，然后将裂解液移入1.5ml离心管，室温静置5min。

②每管加入0.2ml氯仿，用手剧烈震荡离心管15sec，室温静置2-3min，然后12,000×g，4℃离心15min。

③离心后溶液分为三层，取0.2ml上清至新离心管中。

④每管加入0.5ml异丙醇，并轻轻吸打几下混匀，室温孵育10min，然后12,000×g，4℃离心10min。

⑤移去上清液，每管用1ml75％的乙醇溶液洗涤沉淀，然后7,400×g，4℃离心5min。

⑥移去乙醇溶液，自然晾干沉淀5-10min。

⑦加入适量depc处理的水，溶解rna沉淀。

5.3.合成cdna

以实施例5.2得到的rna为模板合成cdna，如表7所示进行合成。

表7：cdna合成体系

5.4.pcr扩增

表8：pcr扩增条件:

表9：pcr反应程序

琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物结果见图5，电泳检测蛋白表达率见图6。

【实施例6】蛋白纯化工艺

6.1.疏水作用柱层析(hic)

xk50层析柱(5x12.5cm)(geco.)用于填装两种hic介质进行比较试验，分别为：propylssepharose6b和butylssepharose6b(geco.).柱子用20mmol/lna2hpo4/nah2po4,ph7.0平衡,其中含有8％(nh4)2so4.含有8％(nh4)2so4的上述表达rhngf的细胞培养上清收集液进样，样品完成上样，用20mmol/lna2hpo4/nah2po4,ph7.0的液体进行洗脱，蛋白峰出现收集rhngf。层析图谱见附图7。

6.2.ac层析

6.2.1.用5倍柱体积的lysisbuffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

6.2.2.将样品加到平衡好的nintabeads中，保证目的蛋白与ni2+充分接触，提高目的蛋白的回收率)。

6.2.3.用10-15倍柱体积的washbuffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

6.2.4.使用5-10倍柱体积的elutionbuffer(150mm咪唑)，蛋白峰出现收集rhngf.层析图谱见附图8。

6.2.5.依次使用3倍柱体积的lysisbuffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20％的乙醇平衡。将填料保存在等体积的20％乙醇的1xpbs中。

7.3.iec

从金属螯合柱层析收集的蛋白峰首先经过tsephadexg-25柱换盐，然后上样到deaesepharosef.f.(5x16.5cm)柱，上样前该柱用20mmol/ltris-hcl,ph8.0的缓冲液平衡.上样后再用平衡液洗一个柱床体积，再用含0.12mnacl的20mmol/ltris-hcl液进行洗脱，当蛋白峰出现进行收集rhngf，层析图谱见图9。

【实施例7】rhngf蛋白纯度和活性的检测

7.1.纯度检测

用sds-page法(分离胶浓度：12％；浓缩胶浓度：5％)检测纯化的蛋白纯度(图10)，结果如下表所示。

表10：蛋白纯度

7.2.活性检测

用mtt法，tf-i(购自atcc,crl-2003)为细胞依赖株进行rhngf活性检测，并和已经上市的产品和已经报道(药典三册)的结果进行对比，动物颌下腺样品来源于中国药品生物制品检定所；上市的cho表达的ngf样品来源于英国nibsc，比较的结果如下表所示。

表11：

sequencelisting

<110>深圳职业技术学院

<120>一种表达重组人神经生长因子的表达载体、体系及方法

<130>sz370-17p121742

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>726

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>beta-hngf的dna序列

<400>1

atgtccatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaacca60

cactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaactt120

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<220>

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<213>artificial

<220>

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