专利名称：重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种突变体，具体的说是一种在真核表达系统中高效表达并保持相似的生物学活性的重组人神经生长因子缺失突变体。
背景技术：
神经生长因子(NerveGrowth Factor, NGF)是 Levi-Montlcini 于 1953 年在小鼠肉瘤细胞内发现的第一个神经营养因子，NGF能够维持和促进交感神经及来自神经嵴的感觉神经细胞的存活、分化和成熟以及执行功能，是参与损伤神经再生和功能修复的重要因素。NGF存在于多种物种中，在雄性小鼠颌下腺、牛精浆、蛇毒、豚鼠前列腺和人胎盘中 组织中含量丰富。其中小鼠NGF与人NGF氨基酸序列同源性达到90%。利用生物技术提取自小鼠颌下腺的鼠NGF及提取自人胎盘组织的人NGF注射液目前已在中国上市，临床上主要用于治疗视神经损伤等，例如中毒性周围神经损伤、外伤性周围神经损伤、面神经炎等疾病。考虑到鼠NGF应用于人体的种属差异性及小鼠作为原材料所具有的潜在的致病因子风险及人胎盘组织原材料的限制，发展基因工程技术制备重组人NGF(rhNGF，reComb inanthuman NGF)来取代提取的鼠NGF和人NGF具有很好的应用前景。人体内成熟的NGF以同源二聚体的形式存在，每条肽链包含120个氨基酸。人NGF基因位于I号染色体短臂上，完整的NGF外显子由241个氨基酸组成，通常称为prepix) NGF前体，在内质网中prepro NGF前体的信号肽被切割下来，形成pro NGF前体(223个氨基酸)，pro NGF前体在内质网中以同源二聚体形式存在，然后转移至高尔基体中，前体部分经Furin酶切，形成成熟的NGF 二聚体(单体含有120个氨基酸)，被转运至细胞外，同时也有部分未经切割的pro NGF前体分泌至细胞外。提取自小鼠颌下腺的鼠NGF通常在N端、C端有一些氨基酸缺失，例如N端缺失8个氨基酸、C端缺失2个或3个氨基酸，这几种缺失突变体同时存在于鼠NGF中，有研究表明N端或C端缺失的NGF并不影响其生物学活性。在利用真核细胞制备rhNGF时，同样发现经常存在C端缺失2到3个氨基酸的情况，会形成同源或者异源二聚体，例如120/120、118/118、117/117、120/118、117/118等，这就给rhNGF的质量控制造成了一定的困扰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在真核细胞中高效表达的重组人神经生长因子缺失突变体。本发明的具体技术方案如下一种重组人神经生长因子缺失突变体，所述突变体是完整人神经生长因子肽链C端缺失3个氨基酸；所述突变体氨基酸序列为(I)如序列表SEQ ID No. I所示。或(2)所述突变体的氨基酸序列为与SEQ ID No. I中所示的氨基酸序列具有95%以上同源性且具有神经生长因子生物学活性的氨基酸序列。编码上述重组人神经生长因子缺失突变体的基因。所述基因如SEQ ID No. 2所示。一种制备重组人神经生长因子缺失突变体基因的方法，所述步骤如下根据人NGFDNA序列(Genbank :NM_002506)设计引物，分离人外周血白蛋白，提取其总RNA，反转录为cDNA，以此cDNA为模板，扩增人NGF基因及缺失突变体基因。一种表达载体，所述载体含有上述方法制备得到的基因。所述表达载体为真核表达载体。真核细胞可以使用酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞等，基因导入细胞的方法可以使用稳定转染或瞬时转染。 一种含有上述表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾293细胞、COS细胞或Hela细胞。一种表达上述载体的方法，是将含有重组人神经生长因子缺失突变体基因的表达载体转化至宿主细胞，培养所得重组细胞表达得到重组人神经生长因子缺失突变体。本发明的有益效果本发明所述的突变体采取表达C末端缺失3个氨基酸rhNGF (rhNGF_D3)的策略来保持rhNGF的C末端完整性，并且通过此改造，相比较于rhNGF，在真核细胞中rhNGF_D3蛋白表达水平提高5 10倍，生物活性保持不变，蛋白C端均一。本发明的可实施性和突出实质性特点以及积极效果可通过以下实例得以体现，但不限制其范围。
图I为编码人NGF及其突变体的DNA序列；rhNGF_D3突变体序列与人NGF序列相比缺乏3'端的9bp (下划线标记的序列);图2为rhNGF_D3氨基酸序列；图3为表达rhNGF或rhNGF_D3的载体结构图；图4为1F1G8和2F5重组细胞系在IOL WAVE生物反应器中的细胞生长曲线；1F1G8表达rhNCF，2F5细胞表达rhNCF_D3 ;细胞培养采取流加培养模式，共培养12天；图5为rhNCF和rhNCF_D3蛋白表达水平；图6为rhNCF蛋白纯化结果；图7为rhNCF_D3蛋白纯化结果；图8为rhNCF_D3蛋白N端氨基酸序列测定结果；图9为rhNCF_D3蛋白分子量测定结果；图10为瞬时转染情况下rhNCF和rhNCF_D3蛋白表达水平分析。
具体实施例方式实施例I重组人神经生长因子缺失突变体(rhNCF_D3)基因克隆及载体构建根据已公布的人NGF DNA序列(Genbank :NM_002506)设计引物，分离人外周血白蛋白，利用TriZol (购自Invitrogen),提取其总RNA,反转录为cDNA,反转录体系为模板RNA 2μ g，5X 反应液 4 μ l，dNTP 混合液(10mM，each) I μ I，RNase inhibitor (20U/μ I)，随机引物2μ 1，M-MLV反转录酶(200υ/μ I) I μ I，加水补足总体积至20 μ I。室温放置IOmin后，42°C反应lh。以此cDNA为模板，扩增人NGF基因及缺失突变体基因，扩增上游引物为“5’_atgaa ttcca ccatg tccat gttgt tctac actc t ga_3’”,下游引物分别为“5，-atcccgggtt atcag gctct tctca cagcc ttcct gct_3’(用于全长 NGF 基因扩增)”和“5，-atcccgggtt atcac acagc cttcc tgctg agca cac_3’(用于 NGF 缺失突变体基因扩增)”。起始密码子处设有 Kozak 序列(CCACCATG)，PCR 扩增条件为 94°C -3min ；94°C -30s, 58°C -30s,72°C -lmin，30 个循环；72°C _7min。得到人NGF基因全长726bp，包括人NGF的prepro序列部分，NGF缺失突变体基因全长717bp，序列如SEQ ID No. 2所示。如图I所示，在人NGF全长基因的3 '端缺失AGAAGAGCCT(代表C末端的3个氨基酸)。以此基因表达的人神经生长因子突变体蛋白氨基酸序列(117个氨基酸SEQ ID No. I所示)如图2所示，编码pr印roNGF_D3的基因插入到表达载体中，信号肽(图中下划线标记的序列)被切割后，形成pro NGF-D3前体，再经furin酶酶切后，酶切位点如图中箭头所示，形成成熟的rhNGF-D3。成熟的rhNGF_D3蛋白 含有117个氨基酸，缺乏完整人NGF蛋白C端的R、R、A三个氨基酸。重组人神经生长因子缺失突变体(rhNGF_D3)载体构建将上述获得的PCR产物人NGF DNA序列及SEQ ID No. 2所示的NGF缺失突变体基因序列经EcoRI和Sma I (购自NEB)双酶切后，与插入到经同样双酶切的pCI-neo载体(Invitrogen公司)连接，连接条件为16°C，过夜。将连接产物转化感受态细菌DH 5 α，感受态菌铺于带有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，利用PCR鉴定挑选出阳性克隆，pCI-neo NGF及pCI-neo NGF-D3质粒经DNA测序鉴定正确,质粒结构如图3所示。实施例2将制备好的pCI-neo NGF及pCI-neo NGF-D3质粒经电转化至CHO S细胞(购自Invitrogen公司)，电转仪为Gene pulser Xcell (BIO-RAD公司)，电转条件为 160V, 150ms。培养基为DMEM加入10%胎牛血清，电转后，用培养基将电转杯内的细胞洗出，铺于35mm细胞培养皿内。第三天，培养基内加入eOOyg/mieUSGigma公司)加压筛选抗性细胞，经抗性筛选存活的单克隆细胞团，转移至96孔板内，利用dot-blot检测细胞上清中重组蛋白表达水平，挑选高表达的细胞克隆进入到悬浮培养。宿主细胞优选为哺乳动物细胞，本实施例中使用的是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚肾293细胞、COS细胞、Hela细胞等也可应用。实施例3选择有较好表达水平的细胞株转移至40ml摇瓶(Corning公司)中，挑选适应无血清悬浮培养的细胞株，所用培养基为SFM4 (Hyclone公司)，培养条件为37°C，比较细胞生长曲线、重组蛋白表达水平(定量ELISA检测，BD公司，dy265)，最终确定重组细胞系1F1G8(表达全长重组人神经生长因子(rhNGF))和细胞系2F5 (表达重组人神经生长因子C末端缺失3个氨基酸的突变体(rhNGF-D3))作为下一步研究的重组细胞系。对细胞系1F1G8和2F5在IOL WAVE生物反应器(Satorious公司)中进行了小规模的批式流加细胞培养工艺摸索，两株细胞系保持相似的生长曲线，如图4所示，但rhNGF-D3蛋白的表达水平比rhNGF高大约10倍以上，如图5所示。
实施例4将实施例3获得的细胞液进行离心，超滤浓缩换液后，首先上样于S^haroseFastflow柱(GE公司)，利用加入lmol/1 NaCl的缓冲液洗脱后，陆续上样于PhenylFastflow (low sub, GE 公司)、Phenyl HP (GE 公司)和 Superdex 75 分子筛凝胶柱(GE 公司)，纯化仪为AKTA Purifier，得到纯度大于90%的重组蛋白，如图6和图7所示。实施例5NGF测活的方法使用TF-I细胞，TF-I细胞表面具体有NGF高亲和力受体TrkA，NGF能够通过剂量依赖关系促进TF-I细胞的增殖，通过MTT法来检测NGF刺激细胞增殖的能力。rhNGF活性标准品是来自于英国NIBSC的重组人NGF活性国际标准品，其比活性为I X 106AU/mg,所测的 rhNGF 和 rhNGF_D3 比活性分别为 9. 6 X IO5 和 9. 8 X 105AU/mg。可以看出，两种蛋白生物比活性相当。实施例6 对rhNGF_D3蛋白进行N端测定和分子量质谱测定，委托军事医学科学院仪器测定分析中心测定。N端5个氨基酸为SSSHP，与理论计算相同，如图8所示。rhNGF-D3蛋白理论分子量为13110Da，实际测定分子量为13102Da，如图9所示，相差8Da，在误差范围之内。由于该蛋白测定C端氨基酸序列较为困难，未能检测出来。但根据质谱测定分子量的结果分析，蛋白中只有单一的分子量存在，说明形成了 C端均一的蛋白。实施例7为了进一步明确人NGF C端缺失3个氨基酸对重组蛋白表达水平的影响，说明我们以上获得的rhNGF和rhNGF-D3的表达水平差异不是由于不同细胞克隆的表达水平差异造成的，我们进行了两种蛋白的瞬时表达水平的检测。表达系统为Freestyle MAX 293Expression System(Invitrogen 公司)，将 pCI-neo NGF 及 pCI-neo NGF-D3 质粒转染至293F细胞，蛋白表达在40ml摇瓶中进行，使用无血清悬浮培养，每种蛋白进行三个重复，利用ELISA检测上清中的NGF表达量，计算平均值及标准差。重组蛋白表达水平见图10。从图中可以看出，rhNGF-D3的表达水平明显高于rhNGF，相对于rhNGF，rhNGF_D3的表达水平提高了 5 10倍。说明基因的变化对重组蛋白表达水平起着决定性的作用。
权利要求
1.一种重组人神经生长因子缺失突变体，其特征在于，所述突变体是完整人神经生长因子肽链C端缺失3个氨基酸；所述突变体氨基酸序列为 (1)如序列表SEQID No. I所示。或 (2)所述突变体的氨基酸序列为与SEQID No. I中所示的氨基酸序列具有95%以上同源性且具有神经生长因子生物学活性的氨基酸序列。
2.编码权利要求I或2所述重组人神经生长因子缺失突变体的基因。
3.根据权利要求3所述的编码重组人神经生长因子缺失突变体的基因，其特征在于，所述基因如SEQ ID No. 2所示。
4.一种制备权利要求2或3所述重组人神经生长因子缺失突变体基因的方法，其特征在于，所述步骤如下根据人NGF DNA序列(Genbank NM_002506)设计引物,分离人外周血白蛋白，提取其总RNA，反转录为cDNA，以此cDNA为模板，扩增人NGF基因及缺失突变体基因。
5.一种表达载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4制备得到的基因。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体。
7.—种表达权利要求5或6所述载体的方法，其特征在于，将含有重组人神经生长因子缺失突变体基因的表达载体转化至宿主细胞，培养所得重组细胞表达得到重组人神经生长因子缺失突变体。
8.含有权利要求5或6所述表达载体的宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾293细胞、COS细胞或Hela细胞。
全文摘要
本发明公开了一种重组人神经生长因子缺失突变体，所述突变体是完整人神经生长因子肽链C端缺失3个氨基酸；所述突变体氨基酸序列为如序列表SEQ ID No.1所示。或所述突变体的氨基酸序列为与SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列具有95％以上同源性且具有神经生长因子生物学活性的氨基酸序列。本发明所述的突变体采取表达C末端缺失3个氨基酸rhNGF(rhNGF-D3)的策略来保持rhNGF的C末端完整性，并且通过此改造，相比较于rhNGF，在真核细胞中rhNGF-D3蛋白表达水平提高5～10倍，生物活性保持不变，蛋白C端均一。
文档编号C12N5/10GK102898514SQ201110213670
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者陈薇, 侯利华, 宋小红, 于婷, 付玲, 于蕊, 房婷 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所