专利名称：抑制血管生成相关基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学中的基因领域，是关于抑制血管生成活性相关的基因序列。
背景技术：
正常成年人血管内皮细胞的增殖处于静止状态，没有新的血管生成。但是，在某些病理情况下，血管内皮细胞的增殖处于静止的状态被打破则血管内皮细胞增殖、新的血管生成。至今尚没有有效的抑制血管新生的化学药物。血管生成抑制因子是一类特异性抑制血管内皮细胞增殖的药物，不产生抗药性和毒性。研究血管生成抑制因子治疗血管新生是当前的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制血管生成的新的基因序列。是通过DNA序列合成方法合成一段DNA序列，将这段DNA序列重组于毕赤酵母中表达，表达产物活性分析证明具有抑制血管内皮细胞增殖和抑制新的血管生成的活性。其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。本发明的目的通过以下技术措施实现1. DNA序列的合成。设计如下DNA序列，并用套叠PCR方法进行其序列合成。将其序列命名为sin。ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGGCATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGGCTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGC
ACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTATGCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA2. DNA序列编码蛋白功能的证明(I)DNA序列重组于酵母中表达通过DNA内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将以上合成的DNA片段插入毕赤酵母表达载体PGAP9K的多克隆位点，将其表达载体命名为pGAP9K-sin(附图1)。用电转法将pGAP9K-sin转化毕赤酵母GSl 15，获得工程菌GSl 15 (pGAP9K_sin)。用YPD培养基发酵 GS115(pGAP9K-sin)表达 Sin 蛋白(附图 2)。(2)表达产物活性分析发酵液上清过Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化(附图幻，收获的含目标蛋白的液体经过抽滤除盐后，进行人脐静脉血管内皮细胞和抑制鸡胚绒毛膜血管生成试验。结果表达Sin蛋白诱发人血管内皮细胞凋亡(附图3)，抑制鸡胚绒毛尿囊新生血管生成，其对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用强于Angiostatin (附图4)。.这些结果表明sin基因编码的蛋白具有抑制血管内皮细胞增殖和抑制新生血管生成的活性，sin是抑制血管生成相关基因序列。本发明的优点血管生成抑制因子在治疗血管增生性疾病中有着重要的用途。虽然已发现的血管生成抑制因子有多种，但是本发明的血管生成抑制因子基因序列小，分子量小的药物有利于在机体内的传输，并且Sin蛋白抑制血管生成的作用较强。
附图1.构建含sin基因的毕赤酵母表达载体附图2.发酵 GS115(pGAP9K_sin)表达 Sin 蛋白M.蛋白 Marker ；0. GS115 (pGAP9K)(负对照)；1. GS115 (pGAP9K_sin) ；2.纯化的 Sin蛋白。附图3. Sin蛋白诱发血管内皮细胞凋亡试验 a. PBS b. Sin
附图4. Sin蛋白抑制鸡胚绒毛尿囊膜新血管生成试验 a. PBS ；b. Sin ；c. Angiostatin
具体实施例方式1.DNA序列的合成。
(1)设计如下DNA序列。
ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGT
GCCCGGTGGGCATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCA
GGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGGCTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGC
ACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTATGCCAGCCGGAACGAC
AAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGC
CGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
(2)合成如下引物
Pl..5’ ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAG3'
p2..5’ TGTATCCACTCCAGAGTTTGTTCATGCCCACCGGGCACATGGGCTCCTGGTCCGTTTG3
p3.
5，TCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGAC3'
p4..5’ GCATGGTGCTGAACCGCGCCAGGCAGGAGCCCGCCAGCCCCAGGTCCTGGTTGTGCGC3
p5.
5，GGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTATGCCAGC3’
p6.
5，GGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCCAGTAGGACTTGTCGTTCCGGCTGGCATAGTAGCA6'
p7.
5，CACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACC3，
p8..TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGA3’
(3)用如下套叠PCR法进行以上序列的合成，其步骤是①应用Pl和p2引物进行PCR，获得产物1。②以①获得的产物1为底物，用P3和p4引物进行PCR扩增，获得产物2。③以②获得的产物2为底物，用P5和p6引物进行PCR扩增，获得产物3。④以③获得的产物3为底物，用P7和p8引物进行PCR扩增，获得产物4。⑤以上获得的底物1、2、3、4的混合物为底物，用引物Pl和p8进行扩增，获得产物 5.(4)将以上PCR产物5进行DNA序列分析证明所获的DNA序列与设计的一致ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGGCATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGGCTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTATGCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA2.序列编码蛋白功能的证明(I)DNA序列重组于酵母中表达及其表达产物的纯化通过DNA内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将以上合成的DNA片段插入毕赤酵母表达载体PGAP9K的多克隆位点，将其表达载体命名为pGAP9K-sin(附图1)。用电转法将pGAP9K-sin转化毕赤酵母GSl 15，获得工程菌GSl 15 (pGAP9K_sin)。用YPD培养基发酵 GS115(pGAP9K-sin)表达Sin蛋白(附图2)。将发酵液上清过Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒，获得符合标准分子量的目标蛋白(附图2)。(2)表达产物活性分析将以上收获的含目标蛋白的液体经过抽滤除盐后，抑制人脐带静脉细胞增殖试验和抑制鸡胚绒毛血管生成试验。结果表达Sin蛋白诱发人血管内皮凋亡(附图幻，抑制鸡胚绒毛尿囊新生血管生成，其对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用强于Angiostatin(附图4)。这些结果表明sin基因编码的蛋白具有抑制血管内皮细胞增殖和抑制新生血管生成的活性，sin是抑制血管生成相关基因序列。序列表<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所<120>抑制血管生成相关基因序列<160>2<210>1<211>324<212>DNA<213>人工序列<400>1atggtcagca tcggctacct cctggtgaag cacagccaaa cggaccaggaccggtgggcB tgaacaaact ctggagtgga tacagcctgc tgtacttcgaaaggcgcaca accaggacct ggggctggcg ggctcctgcc tggcgcggtt
gcccatgtgc 60 gggccaggag 120 cagcaccatg 180
cccttcctgt actgcaaccc tggtgatgtc tgctactatg ccagccggaa cgacaagtcc 240tactggctct ctaccactgc gccgctgccc cttaaggtcg acaagcttgc ggccgcactc 300gagcaccacc accaccacca ctga324<210>2<211>107<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Val Ser lie GlyTyr Leu Leu Val Lys His SerGln Thr Asp151015Gln Glu Pro Met CysPro Val Gly Met Asn Lys LeuTrp Ser Gly202530Tyr Ser Leu Leu TyrPhe Glu Gly Gln Glu Lys AlaHis Asn Gln354045Asp Leu Gly Leu AlaGly Ser Cys Leu Ala Arg PheSer Thr Met505560Pro Phe Leu Tyr CysAsn Pro Gly Asp Val Cys TyrTyr Ala Ser657075Arg Asn Asp Lys SerTyr Trp Leu Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro808590Leu Lys Val Asp LysLeu Ala Ala Ala Leu Glu HisHis His His95100105His His
权利要求
1.一种抑制血管生成相关蛋白的基因序列，其特征在于其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO. 1 所述。
2.一种抑制血管生成相关蛋白的基因序列，其特征在于其氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO. 2 所述。
全文摘要
本发明公开了一种抑制血管生成活性相关蛋白的基因序列。是人工合成时DNA序列。本发明可以通过将这一基因进行重组表达生产蛋白，将纯化的蛋白作为治疗血管异常增生的药物。
文档编号C12N15/12GK102352361SQ20111021334
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月16日 优先权日2011年7月16日
发明者尹慧祥, 张泽华, 张添元, 张爱联, 沈锦城, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南金宝正诚矿业有限公司