专利名称：一种从大豆粕中提取可溶性大豆多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种从大豆粕中提取可溶性大豆多糖的方法。
背景技术：
天然植物抗氧化剂成为当今研究热点，抗氧化活性的植物成分具有多种生物功能，如抗衰老、抗辐射、清除人体自由基、降低血糖血脂等。自由基的平衡对机体十分重要， 一定量的自由基有助于细胞的分化及生长，过多的自由基则会引起机体的一系列问题，如蛋白质变性、酶失活、DNA链断裂、生物膜结构损伤等，甚至导致细胞解体乃至机体病变和死亡，自由基和活性氧是细胞癌变的原始引发机制。自由基清除能力是评价抗氧化活性的重要指标。随着年龄的增长生物体内产生抗氧化剂和抗氧化酶的能力逐渐下降，体内自由基代谢紊乱，过多的自由基会通过各种作用使机体受损而导致疾病或加速衰老。多糖类化合物具有抗氧化、抗衰老、清除体内自由基及增加机体免疫力的作用。在近年来的研究工作中，对多糖的抗氧化生物活性功能的研究越来越多，多种疾病及生理现象均是由氧化产生的，如肿瘤发生、人体衰老等过程都涉及到自由基和活性，即均涉及到抗氧化。豆粕是大豆经提取油脂后的副产物(约占大豆质量的40% )，一般都作为饲料或废弃物处理，而只有少部分被加工利用，经济效益较低，资源浪费极大，同时也容易造成环境污染。纤维类经降解可产生不同分子量范围的大豆纤维降解多糖(以下简称大豆多糖)、 寡糖以及葡萄糖等单糖类物质。可见，合理利用豆渣这一资源，提高大豆的加工利用率，获得高附加值产品，可带来更高的经济效益和环境效益。
发明内容
本发明主要是解决现有技术所存在上述技术问题；提供了一种采用酶法降解豆粕中不溶性纤维，制备得到不同酶解时间段的可溶性大豆多糖。所得大豆多糖对ABTS自由基、· OH—自由基有一定的清除能力，对制止过氧有一定的抑制作用的一种从大豆粕中提取可溶性大豆多糖的方法。本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的一种从大豆粕中提取可溶性大豆多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1，将大豆粕用旋风磨进行粉粹然后过80目筛得到豆粕粉；步骤2，将完成步骤1的豆粕粉采用碱法去除蛋白后进行酶解；步骤3，将完成步骤2已经酶解的豆粕粉进行加热灭酶，然后对加热灭酶后的豆粕粉进行抽滤，得到抽滤后的滤液；步骤4，将完成步骤3的滤液中加入无水乙醇，所述无水乙醇与滤液的质量比为 4:1;步骤5，将完成上述步骤4的无水乙醇与滤液混合液进行沉淀，沉淀时间为 10h-12h ；步骤6，将完成步骤5所得进行旋转蒸发，得到蒸发后浓缩液。其中，上清液旋转蒸发的条件是保持旋转转速为70rpm，温度为50-60°C，真空度为0. 095mpa，蒸发时间为2h ；步骤7，将步骤6所得放入离心机内进行离心，保持离心机转速5000rpm，离心时间为10min-15min，得到离心后的大豆多糖；步骤8，将完成步骤7所得的大豆多糖放入真空冻干机中进行冷冻干燥，保持温度在_40°C，干燥时间为8h-12h，最终得到冷冻干燥后的可溶性大豆多糖。在上述的一种从大豆粕中提取可溶性大豆多糖的方法，所述的步骤2中，进行酶解的具体方法是保持温度50°C，酶底比1 124朋.8，然后进行水解，水解时间分别21!， 4h，6h，8h，10h, 12h，取水解时间分别为2h，4h，6h，8h，IOh, 12h得到的六种大豆多糖水解物，然后对6种大豆多糖水解物分别进行步骤3至步骤8的步骤，得到六种对应的可溶性大豆多糖。因此，本发明具有如下优点用酶法降解豆粕中不溶性纤维，制备得到不同酶解时间段的可溶性大豆多糖。所得大豆多糖对ABTS自由基、·0!Γ自由基有一定的清除能力，对制止过氧有一定的抑制作用。
附图1是本发明的ABTS自由基清除率关系曲线；附图2是本发明的0Η_自由基清除关系曲线；附图3是本发明的抑制脂质过氧化能力关系曲线。
具体实施例方式下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。实施例一种从大豆粕中提取可溶性大豆多糖的方法，包括以下步骤步骤1，将大豆粕用旋风磨进行粉粹然后过80目筛得到豆粕粉；步骤2，将完成步骤1的豆粕粉采用碱法去除蛋白后进行酶解；进行酶解的具体方法是保持温度50°C，酶底比1 12，ρΗ4· 8，然后进行水解，水解时间分别2h，4h，6h，8h， 10h，12h，取水解时间分别为2h，4h，6h，8h，IOh, 12h得到的六种大豆多糖水解物，然后对6 种大豆多糖水解物分别进行步骤3至步骤8的步骤，得到六种对应的可溶性大豆多糖；步骤3，将完成步骤2已经酶解的豆粕粉进行加热灭酶，然后对加热灭酶后的豆粕粉进行抽滤，得到抽滤后的滤液；步骤4，将完成步骤3的滤液中加入无水乙醇，所述无水乙醇与滤液的质量比为 4:1;步骤5，将完成上述步骤4的无水乙醇与滤液混合液进行沉淀，沉淀时间为 10h-12h ；步骤6，将完成步骤5所得进行旋转蒸发，得到蒸发后浓缩液。其中，上清液旋转蒸发的条件是保持旋转转速为70rpm，温度为50-60°C，真空度为0. 095mpa，蒸发时间为2h ；步骤7，将步骤6所得放入离心机内进行离心，保持离心机转速5000rpm，离心时间为10min-15min，得到离心后的大豆多糖；步骤8，将完成步骤7所得的大豆多糖放入真空冻干机中进行冷冻干燥，保持温度在_40°C，干燥时间为8h-12h，最终得到冷冻干燥后的可溶性大豆多糖。下面进行上述6种大豆多糖水解物的相关试验1. ABTS自由基清除试验以双蒸水配制ABTS自由基储备液，于4°C条件下保存，临用时稀释至一定浓度作为工作液。工作液吸光度值0. 700士0. 002。准确量取0. Iml不同浓度的大豆多糖溶液，加入IOml具塞试管中，分别加入1. 9ml ABTS自由基工作液，准确反应6min后于734nm波长出测定溶液混合物的吸光度值A1 ；同法操作，用等体积双蒸水代替大豆多糖，测定溶液吸光度值Atl ；不加ABTS溶液，用等体积双蒸水代替，加入不同浓度大豆多糖溶液，同法操作测定 A2，用以扣除样品本身对吸光度值测定的干扰。采用抗坏血酸作为本实验的阳性对照品，用以评价受试物的抗氧化能力。通过下式计算大豆多糖及抗坏血酸(Vc)对ABTS自由基的清除活性，以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标，制作样品浓度与ABTS自由基清除率关系曲线，如图1所示。清除率(％)= [I-(A1-A2)ZAJXIOO^ (1)如图1，其中，EC50 Vc (0. 04mg/ml) > 12h (37. 40mg/ml) > IOh (49. 32mg/ml) > 8h (69. llmg/ml) > 6h (80. 95mg/ml) > 2h(123. 22mg/ml) > 4h(206. 98mg/ml)。2 · 0H_自由基清除试验通过残留的羟自由基与水杨酸盐之间的相互作用来测定大豆多糖对羟基自由基的清除作用。实验方法参照Wang Hua等采用的水杨酸钠络合法进行测定。通过FeSO4和 H2O2混合的反应体系，羟自由基由Fenton反应产生。反应混合物体系由以下试剂组成浓度为 8mmol/L 的 FeSO4 溶液 0. 5ml，浓度为 6mmol/L 的 H2O2 溶液 0. 8ml, 0. 5ml 蒸馏水，1. Oml 不同浓度的大豆多糖溶液，浓度为20mmol/l水杨酸钠溶液0. 2ml。反应混合物共3. 0ml，将反应物混合均勻后于37°C水浴中温育lh，温育后于562nm波长下测定混合物吸光度值A1 ；将上述体系中的1. Oml大豆多糖样品用蒸馏水代替，其余同法操作，测定吸光度值Atl ；将上述体系中的0. 2ml水杨酸钠溶液用相同体积的蒸馏水代替，其余同法操作，测定吸光度值A2。 以抗坏血酸为阳性对照，同等方法操作进行测定。记录各项吸光度值，按照公式(1)计算大豆多糖及抗坏血酸对羟自由基的清除率(％ )，以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标，回归得受试物样品浓度与羟自由基清除率关系曲线，如图2所示。如图2，其中，EC50 Vc (0. 12mg/ml) > 6h(3. 91mg/ml) > 12h (5. 19mg/ml) > 8h(5. 18mg/ml) > IOh (7. 97mg/ml) > 4h(16. 65mg/ml) > 2h(29. 74mg/ml)，3抑制脂质过氧化能力试验取新鲜卵黄，称重后置于小烧杯中，按照1 1比例(g/ml)加入PBS缓冲液 (0.01mol/l, pH7. 4)，磁力搅拌配制成50%的卵黄悬液，存放于4°C备用。临用时加入适量 PBS缓冲液(0. Olmol/Ι,ρΗ 7. 4)稀释为4%的卵黄悬液。分别吸取0. 2ml质量分数为4% 的卵黄悬液加入IOml试管中，分别加入不同浓度的大豆多糖溶液，25mmol/L的FeS04溶液 0. 2ml，用0. 01mol/l的pH7. 4的PBS缓冲液补齐至2. 0ml，混合均勻后置于37°C恒温振荡器振荡15min。振荡结束后加入质量分数为10%的三氯乙酸1. 0ml，充分混合后静置lOmin，离心(3500rpm，lOmin)，吸取离心后的上清液2. Oml并加入0. 8%的硫代巴比妥酸溶液1. Oml, 用保鲜膜封紧试管口，并用注射器针头刺一小孔。将反应混合物置于沸水浴中保持15min， 流水冷却至室温后于532nm波长处测定吸光度值A1 ；以等体积蒸馏水代替不同浓度大豆多糖，其他反应条件相同，测定吸光度值Atl，以PBS溶液作为空白调零；以相同体积蒸馏水代替卵黄液，其他反应条件相同，测定溶液的吸光度值A2,用以扣除样品本身的干扰。同等条件下以不同浓度抗坏血酸进行试验，作为阳性对照品。大豆多糖对卵黄脂蛋白过氧化的抑制率按公式(1)计算，以大豆多糖品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标回归得受试物浓度与其脂质过氧化抑制率的关系曲线，如图3所示。如图3，其中，EC50 6h(5. 06mg/ml) > IOh(12. 76mg/ml) > 2h(34. 03mg/ml) > 8h(30. 97mg/ml)。本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
权利要求
1.一种从大豆粕中提取可溶性大豆多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤1，将大豆粕用旋风磨进行粉粹然后过80目筛得到豆粕粉；步骤2，将完成步骤1的豆粕粉采用碱法去除蛋白后进行酶解； 步骤3，将完成步骤2已经酶解的豆粕粉进行加热灭酶，然后对加热灭酶后的豆粕粉进行抽滤，得到抽滤后的滤液；步骤4，将完成步骤3的滤液中加入无水乙醇，所述无水乙醇与滤液的质量比为4 1 ； 步骤5，将完成上述步骤4的无水乙醇与滤液混合液进行沉淀，沉淀时间为10h-12h ； 步骤6，将完成步骤5所得进行旋转蒸发，得到蒸发后浓缩液。其中，上清液旋转蒸发的条件是保持旋转转速为70rpm，温度为50-60°C，真空度为0. 095mpa，蒸发时间为2h ； 步骤7，将步骤6所得放入离心机内进行离心，保持离心机转速5000rpm，离心时间为 10min-15min，得到离心后的大豆多糖；步骤8，将完成步骤7所得的大豆多糖放入真空冻干机中进行冷冻干燥，保持温度在_40°C，干燥时间为8h-12h，最终得到冷冻干燥后的可溶性大豆多糖。
2.根据权利要求1所述的一种从大豆粕中提取可溶性大豆多糖的方法，其特征在于， 所述的步骤2中，进行酶解的具体方法是保持温度50°C，酶底比1 12，pH4.8，然后进行水解，水解时间分别:2h, 4h，6h，8h，IOh, 12h，取水解时间分别为2h，4h，6h，8h，IOh, 12h得到的六种大豆多糖水解物，然后对6种大豆多糖水解物分别进行步骤3至步骤8的步骤，得到六种对应的可溶性大豆多糖。
全文摘要
本发明涉及一种从大豆粕中提取可溶性大豆多糖的方法。本发明采用酶法降解豆粕中不溶性纤维，制备得到不同酶解时间段的可溶性大豆多糖。即原料豆粕粉→去除蛋白→酶解→加热灭酶(100℃，10min)→抽滤→滤液加四倍无水乙醇，沉淀过夜→离心(5000rpm，15min)→沉淀水溶→离心(8000rpm，20min)→上清液旋转蒸发→冷冻干燥。因此，本发明具有如下优点用酶法降解豆粕中不溶性纤维，制备得到不同酶解时间段的可溶性大豆多糖。所得大豆多糖对ABTS自由基、·OH-自由基有一定的清除能力，对制止过氧有一定的抑制作用。
文档编号A23L1/20GK102232500SQ201110213490
公开日2011年11月9日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者姚磊, 张华 , 王振宇, 程翠林, 赵海田 申请人:哈尔滨工业大学