本发明属于去势疫苗
技术领域：
，具体涉及一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法。
背景技术：
：促黄体素释放激素(luteinizinghormorereleasinghormore，lhrh)是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素，其主要生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素(lh)及促卵泡激素(fsh)，这些激素能促进性腺及性器官的正常发育，维持动物的生殖功能。去势疫苗可免疫调控动物内分泌系统的性相关激素水平，抑制动物性器官发育，使动物丧失性行为和性功能，从而防止混乱交配(引起畜群退化)和争斗，促进动物生长，改善胴体组成和肉质，使肉质鲜嫩并防止膻味，提高饲料报酬。其机理是通过lhrh合成抗原或重组抗原作疫苗免疫动物后，在体内形成lhrh抗体，中和内源性lhrh，从而显著降低睾酮及雌激素等性激素水平，达到温和去势的目的。与传统手术去势相比，疫苗去势不仅简便易行，给管理者带来极大的方便，尤其适合于规模化养殖和放牧畜群，而且可防止手术去势导致的出血、感染及应激造成的减食和体重下降，另外疫苗去势可适用于大动物或小动物、雌性或雄性动物、幼龄和成年动物、畜禽和其他动物，再者疫苗去势可通过配套技术实现可逆性控制。但现在并未见有效果较佳的鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的报道。技术实现要素：针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法，该制备方法简便，成本低，制得的疫苗去势效果较佳，使用方便。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗，其制备方法包括以下步骤：(1)设计clhrh基因，序列如下：p1:5’-ggccatggctgaacactggtcctacggtctgcgtccgaacggcggtgagcactggtcttacggcctgcagccgggtggcggtgaacattggtcttacggtctgcgcccgaactaatgaactcgagca-3’(seqidno:1)；p2:5’-tgctcgagttcattagttcgggcgcagaccgtaagaccaatgttcaccgccacccggctgcaggccgtaagaccagagctcaccgccgttcggacgcagaccgtaggaccagtgttcagccatggcc-3’(seqidno:2)；(2)对设计的基因序列进行合成、退火、酶切、连接，然后再转入大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；(3)将重组质粒接种于含amp的lb培养基中，于36-37℃，160-250r/min条件下培养，获得原始菌液；(4)将原始菌液按接种量为2％-3％接种于含amp的lb培养基中，于36-37℃，160-250r/min条件下培养，待菌液od600nm值为0.6-0.7时加入终浓度为20-30g/l的乳糖诱导培养5-6h；(5)将步骤(4)诱导培养后的菌液离心，弃上清，得第一沉淀，将第一沉淀置于2-8℃高渗液中重悬，冰浴10-15min，离心，弃上清，得第二沉淀，将第二沉淀置于2-8℃低渗液中重悬，冰浴10-15min，离心，收集上清液；(6)将步骤(5)所得上清液用0.22μm膜过滤除菌，然后加入除菌后所得液液1/10-1/5体积的10×醛化盐水，混匀，置于2-8℃，醛化处理72-76h，得醛化后的蛋白液；(7)将醛化后的蛋白液中加入吐温-80，混匀，得水相，其中吐温-80占水相总体积的4％；将注射用白油与司本-80按体积比为94:6比例，混匀，121℃灭菌60min，得油相；将油相与水相按2:1比例乳化，制成油包水乳剂，将油包水乳剂与1％吐温盐水按体积比为3:7比例乳化，制得鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗。进一步地，步骤(4)中乳糖添加量为20g/l。进一步地，步骤(4)中乳糖诱导时间为6h。进一步地，步骤(5)中高渗液通过以下方法制备得到：分别称取tris484g、edta146g和蔗糖40kg，混合，添加适量注射用水，混匀，然后用hcl调ph值至8.0，继续添加注射用水至200l，混匀后于121℃高压灭菌30min，制得。进一步地，步骤(5)中低渗液通过以下方法制备得到：分别称取tris484g和edta146g，混合，添加适量注射用水，混匀，然后用hcl调ph值至8.0，继续添加注射用水至200l，混匀后于121℃高压灭菌30min，制得。进一步地，步骤(6)中10×醛化盐水通过以下方法制备得到：将氯化钠溶解于注射用水中配成8.75％盐水，以121℃高压灭菌30分钟，冷却后，于每升盐水中加入5ml福尔马林，混合均匀，制得。进一步地，步骤(7)中1％吐温盐水通过以下方法制备得到：向每升注射用水中加入氯化钠9g，吐温-8010ml，混合均匀，121℃高压灭菌30分钟，制得。本发明提供的一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法，具有以下有益效果：(1)因为clhrh重组抗原为可溶性蛋白质，并设计带有特定“信号肽”，可以采用“渗透休克”的特殊方法，选择性地诱导clhrh融合抗原从细菌中分泌释放出来，继而经离心工艺固液分离，直接获取高纯度的clhrh融合抗原。与常规重组大肠杆菌表达蛋白的分离提取工艺相比，该纯化工艺不仅简便，更避免了细菌裂解工艺给蛋白纯化带来的麻烦，更避免了细菌成分的污染。(2)在制备过程中由于采用了乳糖作为表达的诱导剂，又用蔗糖作为渗透休克分泌的诱导剂，本产品原液的整个生产过程不涉及任何对动物具有潜在的有毒、有害或难以降解的物质。(3)该制备方法简单，成本低，制备的疫苗对去势效果好，方便使用，稳定性好。附图说明图1为乳糖诱导后clhrh目的蛋白纯度分析结果图。具体实施方式实施例1clhrh-ra-rs1株重组表达质粒的构建1、clhrh基因的设计和人工合成基因片段的设计根据鸡促黄体素释放激素(clhrh)的氨基酸序列及相应的大肠杆菌偏爱密码子，并结合pet-32c质粒本身的特点设计两条互补clhrh基因序列。在确保插入载体后阅读框架正确的前题下，在5‘端和3’端分别加上ncol和xhol两个酶切位点，酶切位点前加两个保护性碱基，用dna自动合成仪合成基因，基因序列如下:p1:5’-ggccatggctgaacactggtcctacggtctgcgtccgaacggcggtgagcactggtcttacggcctgcagccgggtggcggtgaacattggtcttacggtctgcgcccgaactaatgaactcgagca-3’(seqidno:1)p2:5’-tgctcgagttcattagttcgggcgcagaccgtaagaccaatgttcaccgccacccggctgcaggccgtaagaccagagctcaccgccgttcggacgcagaccgtaggaccagtgttcagccatggcc-3’(seqidno:2)2、clhrh基因片段的退火将人工合成的p1及p2基因片段分别用灭菌超纯水溶解成浓度为100pmol/μl(相当于1.82μg/μl)的溶液，各取2μl加入72μl超纯水中混匀，置沸水浴中2分钟后缓慢冷却至室温，-20℃冻存备用。3、clhrh基因的酶切用ncoi及xhoi对pet-32c质粒进行双酶切，具体操作参照takara公司限制酶使用说明书进行。4、连接dna连接反应参照takara公司dna连接试剂盒(dnaligationkit)使用说明进行。5、转化取10μ1连接产物转化200μldh5a感受态细菌。取200μl转化产物涂布含amp50μg/ml的lb琼脂平板，同时设未转化的感受态细菌对照(阴性对照)及pet-32c质粒转化的感受态细菌对照(amp抗性质控对照)。平板置37℃温箱中培养18小时。阴性对照无菌落生长，而阳性对照菌落呈“满天星”状，说明转化成功。6、重组质粒的酶切筛选pet-32c质粒多克隆位点有ecori及handⅲ酶切位点，当插入clhrh基因后这两个酶切位点应该消失，而ncoi和xhoi酶切位点仍然存在。据此原理，挑取转化后的单个菌落，接种含amp的lb肉汤扩大培养后提取质粒，分别用handⅲ，ecori，ncoi及xhoi进行单酶切，挑选handⅲ及ecori酶切位点消失而ncoi及xhoi酶切位点仍存在的阳性克隆。挑选经酶切鉴定的重组质粒，以t7terminaterprimer作为测序引物，对其进行测序。测序结果与设计序列相同。将上述重组质粒即重组抗原称为clhrh-ra-rs1株，现已于2017.9.28保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学，保藏编号为cctccno：m2017564。实施例2制备原始菌液根据蛋白表达特性和表达蛋白的免疫原性，筛选用于鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗研制的原始菌种，具体过程如下：1、转化将clhrh/pet-32c重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细菌，同时，以pet-32c质粒转化大肠杆菌，作阴性载体对照。取200μl转化菌液，涂布于含amp50μg/ml的lb琼脂平板，以未转化的感受态细菌作阴性对照，置37℃培养18小时。保存于2-8℃，待挑取菌落，扩增筛选后，选取最佳菌落，建立原始种子批。2、制备原始菌液挑取clhrh/pet-32c重组质粒转化大肠杆菌菌落，接种于10mlamp+lb培养基，置37℃摇床，震荡培养过夜，得原始菌液。实施例3最佳接种量的确定将实施例2得到的原始菌液接种于含有250mlamp-lb液体培养基1000ml锥形瓶，接种量分别是1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％，相同条件下重复三次，分别为第一组，第二组，第三组，均以36-37℃、230r/min摇振培养。记录菌体培养生长曲线，并分别于培养后1小时、2小时取样，测定od600nm值，其结果见表1-3。表1接种量与od600nm值关系(第一组)表2接种量与od600nm值关系(第二组)表3接种量与od600nm值关系(第三组)实验结果表明，各组接种量在2％-3％时，菌株培养2小时，细菌培养物od600nm值在0.6-0.7之间，符合产品工艺要求。实施例4乳糖诱导clhrh重组抗原1、乳糖诱导最适浓度的确定具体过程为：(1)取实施例3获得的符合生产工艺的菌液5ml，接种于6瓶250ml含氨苄青霉素的lb液体培养基锥形瓶，37℃以230r/min摇振培养，当od600nm值达到0.6时加入乳糖诱导其表达clhrh目的蛋白，分别按10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、60g/l、80g/l加入乳糖，37℃培养6小时后，分别取6个样品菌液10ml，离心收集菌体。(2)将步骤(1)所得菌体悬浮于4ml2-8℃高渗液中，冰浴处理10分钟，10000rpm离心10分钟，收集菌体。高渗液的制备：分别称取tris484g、edta146g、蔗糖40kg，混合，添加适量注射用水，混匀，然后用hcl调ph值至8.0，继续添加注射用水至200l，混匀后于121℃高压灭菌30分钟。(3)将步骤(2)所得菌体悬浮于4ml2-8℃低渗液中，冰浴处理10分钟，10000rpm离心10分钟，收集上清液。用分光光度法测目的蛋白质含量，记录数据。低渗液的制备：分别称取tris484g、edta146g，混合，添加适量注射用水，混匀，然后用hcl调ph值至8.0，继续添加注射用水至200l，混匀后于121℃高压灭菌30分钟。重复实验同时进行3组平行实验，收集不同乳糖诱导浓度下clhrh目的蛋白含量的数据，分析乳糖诱导浓度与clhrh目的蛋白表达量的关系，结果见表4。表4乳糖终浓度与clhrh目的蛋白表达产量的关系由表4可知，乳糖浓度在20g/l-30g/l，clhrh目的蛋白表达产量最高。2、乳糖诱导培养最佳时间的确定具体过程为：(1)取实施例3获得的符合生产工艺的菌液按接种量2.5％接种于250ml含氨苄青霉素的lb液体培养基锥形瓶，37℃以230r/min摇振培养，当od600nm值达到0.6时加入乳糖诱导其表达clhrh目的蛋白。从加入乳糖开始计时，每小时取样25ml，离心收集菌体。(2)分别将步骤(1)所得菌体悬浮于5ml2-8℃高渗液中，冰浴处理10分钟，10000rpm离心10分钟，收集菌体。(3)将步骤(2)所得菌体悬浮于5ml2-8℃低渗液中，冰浴处理10分钟，10000rpm离心10分钟，收集上清液，即为clhrh目的蛋白液。用分光光度法测量目的蛋白含量，记录数据。(4)将不同诱导时间渗透休克提取clhrh目的蛋白，进行电泳，并用考马斯亮蓝与高灵敏度的蛋白染色方法-银染法分别染色，分析clhrh目的蛋白纯度，结果见图1。按照上述方法进行3批次不同实验，分别记为a试验、b试验、c试验，收集不同乳糖诱导培养时间的clhrh目的蛋白含量(单位为mg/ml)，分析乳糖诱导培养时间与clhrh目的蛋白表达量的关系，结果见表5。表5诱导培养时间与clhrh目的蛋白表达产量的关系时间(小时)2345678a0.1340.3830.7271.0491.1951.1821.223b0.1010.4900.6271.1621.2351.2091.199c0.1590.5130.7861.2181.2991.2641.231由表5和图1可知，乳糖诱导培养5-6小时，clhrh目的蛋白表达产量最高，继续培养蛋白表达产量不再提高。表达蛋白经电泳染色分析，尤其是银染法显示乳糖诱导后培养6小时蛋白纯度高于乳糖诱导后培养7小时、8小时。试验结果表明，规模化生产中，乳糖诱导后发酵培养的最佳时间为6小时。实施例5低温渗透休克分离纯化clhrh重组抗原(融合蛋白)1、小样品实验将实施例3获得的符合生产工艺的菌液按接种量为2.5％接种于200mlamp-lb培养基，37℃摇床培养至od600nm值达到0.6时，加入乳糖至终浓度20g/l，继续培养5小时后，培养物分成两份，各100ml。一份超声破碎，另一份通过低温渗透休克分离纯化clhrh重组抗原(融合蛋白)。超声破碎：将100ml细菌培养物离心弃上清，全部菌体沉淀用10mlpbs(ph7.4)重悬，超声波破碎(冰浴)5分钟，超声功率为240w，离心后将上清转移至另一容器中，沉淀用10mlpbs重悬，各取50μl上清及沉淀悬液加入等体积的2x载样缓冲液，进行sds-page。对凝胶进行灰度扫描确定目的蛋白的百分含量。低温渗透休克：100ml细菌培养物，测od600nm，10000r/min离心1分钟，弃上清，沉淀用20ml高渗透溶液重悬，冰浴10分钟，10000r/min离心1分钟，弃上清加入同体积的低渗透液重悬，冰浴10分钟并不时摇动，10000r/min离心1分钟，将上清转移至另一离心管中，沉淀用同体积的低渗液重悬。对上清和重悬后沉淀进行sds-page。设未渗透休克的全菌体对照。电泳后对凝胶进行灰度扫描确定目的蛋白的百分含量，并用分光光度法测量上清中的蛋白含量。2、规模化工艺条件下进行渗透休克分离纯化(1)菌液培养：在培养罐中加入lb液体培养基及适量消沫剂，121℃灭菌15分钟。待培养基冷却至36-37℃时按培养基终浓度200ug/ml加amp，按培养基重量的2％-3％加入实施例3获得的符合生产工艺的菌液，于36-37℃连续培养，当od600nm值达0.5-0.6时，按2％-3％接种量进行罐体扩大培养2小时，当od600nm值达0.6-0.7时，添加乳糖诱导蛋白表达，乳糖终浓度为2％，继续培养5小时收获菌液，测定od600nm值，然后固液分离培养菌液进行连续流离心，16000r/min，收集菌体。(2)高渗处理：将步骤(1)所得菌体悬浮于2-8℃预冷的高渗液-中，冰浴处理10分钟。高渗液用量：发酵菌液体积×od600nm值/5。(3)低渗液用量的测定：取高渗液细菌悬液1.0ml，12000r/min离心3分钟，弃上清。将菌体悬浮于2-8℃预冷的1.0ml低渗液-中，冰浴处理10分钟。12000r/min离心3分钟，取上清，采用分光光度法测定小样休克蛋白浓度。按54％×高渗液体积×小样休克蛋白浓度/5，计算低渗液用量。(4)将步骤(2)处理好的菌液进行分离，16000r/min连续流离心收集菌体。(5)低渗处理：将步骤(4)所得菌体悬浮于2-8℃低渗液中，冰浴作用10分钟，然后以16000r/min连续流离心收集上清，得到clhrh融合蛋白液。将上述所得clhrh融合蛋白液稀释为clhrh融合蛋白液0.1mg/ml，与镍合柱纯化的载体蛋白一起进行sds-page电泳检测，蛋白染色观察蛋白条带，并经凝胶灰度扫描检测蛋白纯度。结果：(1)小样试品超声破碎：将乳糖诱导5小时后的菌体，用超声波破碎离心分离后分别对上清及沉淀进行sds-page，并与未经乳糖诱导的5小时平行培养全菌体进行比较，commassie染色可见一条分子量约22kda的主要蛋白带出现于超声波裂解液上清中，表明clhrh融合蛋白经乳糖诱导后呈可溶性表达。凝胶灰度扫描结果表明，表达的clhrh融合蛋白占菌体可溶性蛋白总量的73.95％(表6)。低温渗透休克：将渗透休克处理所得上清及菌体进行sds-page，commassie染色可见clhrh融合蛋白能通过渗透休克释放到菌体之外。凝胶灰度扫描结果表明(参见表6)，休克上清中clhrh融合蛋白主带的纯度高达94.5％，而于菌体中残留的clhrh融合蛋白仅占菌体总蛋白的2.05％。表达蛋白的可溶性和可分泌性，为渗透休克法分离纯化clhrh融合蛋白制备疫苗蛋白原液(半成品)提供了依据。表6sds-page主蛋白(22kda)凝胶灰度扫描结果表6中的泳道2和3为乳糖诱导后全菌菌体超声波裂解液离心上清(可溶性蛋白)；4和5为乳糖诱导后全菌菌体超声波裂解液离心沉淀；6和7为渗透休克离心上清，于约19kda可见分离纯化的clhrh融合蛋白条带；8和9为渗透休克离心沉淀(菌体蛋白)；10和11为乳糖诱导前的全菌菌体裂解液对照。(2)规模化生产经sds-page电泳考马氏兰蛋白染色，可见高纯度的clhrh融合蛋白，分子量约22kda。除少量较小分子量的降解产物外，没有明显可见的杂蛋白条带。凝胶灰度扫描结果显示，所得半成品clhrh融合蛋白纯度在80.4％-88.7％之间，平均值为84.58％；其纯度，比镍合柱亲和纯化的载体蛋白样品(平均值67.62％)还高。统计分析结果显示，半成品纯度批间标准差为3.64，变异系数(cv)4.30％，批间符合率95.70％，表明，不同批次半成品的纯度，具有良好的批间重复性，参见表7。表7渗透休克分离纯化clhrh重组抗原的凝胶灰度扫描结果在规模化生产工艺条件下，连续试制6批鸡促黄体素释放激素重组抗原，各批次重组抗原(半成品)经sds-page电泳和凝胶灰度扫描检验鉴定，均重复获得高纯度的clhrh重组抗原，验证了该纯化工艺在规模生产条件下的有效性与稳定性。实施例6去势疫苗成品的制备1、具体过程如下：(1)蛋白液醛化将实施例5获得的clhrh融合蛋白液采用0.22μm膜过滤除菌，然后加入除菌后所得蛋白液1/10体积的10×醛化盐水，充分混匀，置于2-8℃，醛化处理72小时。10×醛化盐水的配制：将氯化钠溶解于注射用水中配成8.75％盐水，以121℃高压灭菌30分钟，冷却后，于每升盐水中加入5ml福尔马林(36％-40％甲醛溶液)，混合均匀，即为10×醛化盐水。(2)配苗水相的制备：醛化后的蛋白液中加入吐温-80，充分混匀，吐温-80占水相总体积的4％。油相的制备：将注射用白油与司本-80按体积比为94:6比例，均匀混合，121℃灭菌60分钟。将油相与水相按体积比为2:1比例乳化，制成油包水乳剂。将油包水乳剂与1％吐温盐水按体积比为3:7比例乳化，制成去势疫苗成品；其中1％吐温盐水的制备过程：向每升注射用水中加入氯化钠9g，吐温-8010ml，混合均匀，121℃高压灭菌30分钟，制得。2、对成品进行检验外观：乳白色乳剂。剂型：水包油包水型，取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，呈云雾状扩散。稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml。黏度：按现行《中国兽药典》附录进行测定，符合规定。无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。安全检验：用15～20日龄spf鸡10只，各肌肉注射疫苗1.0ml，逐日观察14日，全部健活，无局部或全身不良反应。效力检验：用15～20日龄spf鸡10只，各肌肉注射疫苗0.5ml。于免疫前2日及免疫后15日分别采集血液，分离血清，测定elisa抗体效价。免疫鸡血清elisa抗体均为阳性(p/n值≥2.1，n为免疫前血清od450nm测定值)，且几何平均值不低于5126。甲醛残留量测定：按现行《中国兽药典》附录进行测定，符合规定。内毒素含量检测：按现行《中国兽药典》附录进行检验，每羽份不高于500eu。作用与用途：用于鸡的去势。免疫期为3个月。用法与用量：肌肉注射。15～20日龄鸡，0.5ml/羽。贮藏：2-8℃保存。序列表<110>华派生物工程集团有限公司<120>一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>127<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggccatggctgaacactggtcctacggtctgcgtccgaacggcggtgagcactggtctta60cggcctgcagccgggtggcggtgaacattggtcttacggtctgcgcccgaactaatgaac120tcgagca127<210>2<211>127<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgctcgagttcattagttcgggcgcagaccgtaagaccaatgttcaccgccacccggctg60caggccgtaagaccagagctcaccgccgttcggacgcagaccgtaggaccagtgttcagc120catggcc127当前第1页12