促皮质素与胰岛素样生长因子1融合蛋白及其制备方法与流程

本发明属于生物制药领域。具体涉及dna及蛋白质一级结构、表达载体的构建和表达、以及蛋白质的分离和纯化。

背景技术：

促皮质素(corticotropin)，也称促肾上腺皮质激素(acth，adrenocorticotropichormone)，是由垂体的前叶、下丘脑、肾上腺髓质、肠道和胎盘等组织分泌的一种39个氨基酸的多肽类激素，具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢，调节心脑血管功能、提高抵抗力，调控糖皮质激素(gc)的合成与分泌，神经损伤恢复与再生，抗炎，免疫抑制，抗毒素，抗休克等作用。acth是临床治疗两岁以下婴儿惊厥症的唯一特效药，该病发病率0.5％～1％，6～33％的婴儿惊厥症患儿在3岁前死亡，70～90％患儿智力发育缓慢，30％发展为自闭症。acth也用于红斑狼疮、多发性硬化病急性恶化、肾病综合征、全身性皮肌炎和结节病的治疗；还用于银屑病关节炎、风湿性关节炎、强直性脊柱炎以及严重眼部过敏和炎症等的辅助治疗。acth不稳定，体内半衰期只有15分钟；目前临床应用的acth是从动物组织中提取的，生产成本高并且有传播动物病毒和支原体的潜在风险。本发明从工程菌中表达制备基因重组acth融合蛋白，生产成本低，基本不会传播动物病毒和支原体。

胰岛素样生长因子1(igf-1，insulin-likegrowthfactor1)，又被称作促生长因子或生长激素介质(somatomedin)，含有70个氨基酸，相对分子量为7649的多肽类激素，其半衰期长达20个小时，其作用与胰岛素类似，igf-1单独应用能够将acth的作用提高20倍。igf-1在人体中的主要作用为调节血糖、促生长、促细胞分化、创伤修复等。igf-1制剂在临床上已用于治疗糖尿病、胰岛素抵抗综合征、侏儒症及神经系统疾病等多种顽疾，取得了良好的效果。本发明将acth与igf-1融合表达并纯化。得到的融合蛋白不但能够增强acth的作用，还具有acth与igf-1的双重药理作用。

初始表达架构为histag-linker-ekst-acth-igf-1。其中histag为组氨酸标签，linker为随机连接序列，ekst为肠激酶(enterokinase)底物序列(氨基酸序列为ddddk)。肠激酶能够特异性的切割其底物序列氨基酸序列末端，得到不含多余氨基酸的acth-igf-1融合蛋白。

技术实现要素：

1.发明的目的

利用工程菌中表达并纯化出一种基因重组融合蛋白(acth-igf-1)，及其制备和纯化方法。

2.发明的技术方案

一、使用重叠pcr技术将acth与igf-1相连，构建两端带有内切酶位点(bamh1和sal1)的cdna架构：bamh1-histag-linker-ekst-acth-igf-1-sal1，此架构中acth前插入了编码肠激酶底物(ekst)的碱基序列，ekst前面插入编码组氨酸标签(histag)的碱基序列，acth与igf-1之间以柔性连接序列gggs相连。

二、双酶切bamh1-histag-linker-ekst-acth-igf-1-sal1和载体pet30a，产生粘性末端。

三、用t4连接酶构将切出粘性末端的bamh1-histag-linker-ekst-acth-igf-1-sal1以及质粒pet30a连接，构建出表达histag-linker-ekst-acth-igf-1的pet30a质粒(图1)。

四、将构建好的质粒转入大肠杆菌表达菌株bl21-de3，筛选高表达菌株，诱导表达。

五、破碎菌体，收集包涵体并洗涤，再破碎和溶解包涵体，得到富含histag-linker-ekst-acth-igf-1的溶液。

六、利用镍(ni)柱纯化出histag-linker-ekst-acth-igf-1。

七、用带有his标签的肠激酶切割histag-ekst-acth-igf-1，得到acth-igf-1融合蛋白。

八、用镍柱去除带有his标签的肠激酶以及切下来的histag-linker-ekst，得到纯化的acth-igf-1。

3.发明的有益效果

本发明可以获得具有acth和igf-1双重功效的融合蛋白igf-1-acth，可以增强acth的作用。

附图说明

图1.histag-linker-ekst-acth-igf-1pet30a质粒图谱。

图2.histag-ekst-linker-acth-igf-1-pet30a表达质粒的构建结果验证。a.片段bamh1-histag-linker-ekst-acth的pcr扩增。m：marker；泳道1：空泳道，泳道2：bamh1-histag-linker-ekst-acth的pcr扩增产物。b.片段igf-1-sal1的pcr扩增。m：marker；泳道1：空泳道，泳道2：igf-1-sal1的pcr扩增产物。c.片段bamh1-histag-linker-ekst-acth-igf-1-sal1的pcr扩增。m：marker；泳道1：空泳道，泳道2：bamh1-histaglinker--ekst-site-acth-igf-1-sal1的pcr扩增产物。d.载体pet30a的酶切。m：marker；泳道1：pet30a载体，泳道2：bamh1、sal1双酶切载体pet30a。e.促皮质素-胰岛素样生长因子1融合蛋白表达载体histag-linker-ekst-acth-igf-1-pet30a的酶切鉴定。m：marker；泳道1：pet30a空载体，泳道2、3：bamh1、sal1双酶切已插入histag-ekst-linker-acth-igf-1-pet30a序列的质粒。

图3.histag-linker-ekst-acth-igf-1测序图。

图4.重组融合蛋白histag-linker-ekst-acth-igf-1表达后用镍柱纯化结果图。histag-linker-ekst-acth-igf-1-pet30a质粒在bl21-de3工程菌中表达后，经超声破碎，上清液用镍柱纯化后，经sds-page(15％tris-glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，考马斯亮蓝r-250原位染色。m：分子量标记。泳道1-14：ni柱纯化后的histag-linker-ekst-acth-igf-1融合蛋白的分离组分，组分4-13中为ni柱纯化得到的融合蛋白histag-linker-ekst-acth-igf-1。

图5.纯化后的acth-igf-1的westernblot检测图。acth-igf-1用sds-page(10％tris-tricine胶)分离后，转印到低荧光背景pvdf膜检测，一抗为鼠抗人acth(santacruz)特异性抗体，二抗为alexa488荧光标记羊抗鼠抗体(abcam)么，用typhoonfla9500(gehealhcare)检测荧光条带。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式表达并分离纯化基因重组acth-igf-1融合蛋白，按以下步骤进行：

一、根据原核表达体系中的密码子偏好性优化设计acthcds序列，以适于在大肠杆菌表达菌株bl21-de3中高效表达。以bamh1和sal1作为融合表达蛋白cds序列的上下游两端的酶切位点，构建带有his标签和肠激酶酶切位点的融合蛋白原核表达序列histag-linker-ekst-acth-igf-1-sal1。具体步骤如下：

引物设计：设计扩增bamh1-histag-linker-ekst-acth的上游引物bamh1-histag-linker-ekst-acth-f，下游引物acth-r；设计扩增igf-1的上游引物igf-1-f，下游引物igf-1-sal1-r。引物序列见核苷酸序列表。

用重叠pcr法用引物bamh1-histag-linker-ekst-acth-f和acth-r，以人工合成的acth序列为模板，扩增出bamh1-histag-linker-ekst-acth(见图2a)；以含igf-1基因的质粒为模板，再用引物igf-1-f和引物igf-1-sal1-r扩增出igf-1-sal1(见图2b)；最后用扩增的这两个片段(bamh1-histag-ekst-acth和igf-1-sal1)为模板，用引物bamh1-histag-ekst-acth-f和igf-1-sal1-r扩增出目的片段：bamh1-histag-ekst-acth-igf-1-sal1(见图2c)，acth与igf-1之间的核苷酸序列编码氨基酸柔性连接片段gggs。

二、用bamh1和sal1分别酶切片段bamh1-histag-ekst-acth-igf-1-sal1和空白载体pet30a(见图2d)。

三、用t4dna连接酶连接片段和载体，构建质粒histag-linker-ekst-acth-igf-1-pet30a。酶切鉴定(见图2e)，绘制融合蛋白表达质粒图谱(见图1)，测序结果见图3。

四、40℃，30秒钟将质粒histag-linker-ekst-acth-igf-1-pet30a转入大肠杆菌表达菌株bl21-de3中，37℃恢复菌体1小时，取50ul涂含有卡那霉素的lb固体培养板，37℃倒置培养16h。挑选板上的单菌落，转入加有50ml液体lb培养基的锥形瓶中，培养基中加有卡那霉素，37℃摇菌至od600为0.6时，加入浓度为0.05mmiptg于180rpm37℃表达5h。

五、将上述工程菌收集在离心管中，以12,000rpm，在4℃条件下，离心15min，弃掉上清。加入非变性裂解液(50mmtris-hcl，300mmnacl，10mm咪唑，ph8.0)柔和洗涤菌体，12,000rpm，4℃离心10min收集沉淀，洗涤3次，每次15min。每克湿重加入8ml非变性裂解液，用旋转混合仪分散菌体。将菌液置于冰上，用超声波破碎仪破碎菌体，破碎功率为400w，破碎3s停5s共破碎200次。12,000rpm，4℃离心20min。在冰浴条件下，将离心沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液i(50mmtris-hcl、100mmnacl、2mmedta、1mmdtt、0.5％(v/v)tritonx-100，ph8.0)，超声3×10秒，室温放置10min，在4℃，以12,000rpm离心20min，分别收集上清及沉淀。将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液ii(50mmtris-hcl、100mmnacl、2mmedta、1mmdtt，ph8.0)，混匀后室温放置10min，同上条件再次离心20min后，收集合并上清液用于纯化蛋白质。

六、再生好的ni柱用2倍体积20％乙醇洗过后，用2v的去离子水过一遍。更换流动相为平衡缓冲液(50mmtris-cl，300mmnacl，10mm咪唑,ph8.0)，平衡5个柱体积。上样，更换流动相为漂洗液(50mmtris-cl，300mmnacl，100mm咪唑,ph8.0)，漂洗40个柱体积。洗脱，更换流动相为洗脱液(50mmtris-cl，300mmnacl，250mm咪唑,ph8.0)，收集洗脱液组分，用15％sds-page电泳后，r-250染色(见图4)。

七、在洗脱液中组分中分别加入带有his标签的肠激酶，终浓度为1mm，在37℃温育1小时以切割样品中的histag-linker-ekst-acth-igf-1多肽链，得到游离的acth-igf-1以及his-tag-linker-ekst。

八、采用步骤六的方法平衡ni柱，将肠激酶切后的洗脱液组分加至ni柱，4℃静置30-60min以去除酶切洗脱液中连有his标签的肠激酶以及histag-linker-ekst多肽。westernblot鉴定各洗脱液组分中acth-igf-1结果如图5所示。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是不采用pet30a质粒，而是用pet21a作为表达载体。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是不采用pet30a或pet21a质粒，而是用pet28a作为表达载体。

序列表

<110>海南大学

<120>促皮质素与胰岛素样生长因子1融合蛋白及其制备方法

<130>2016.6.1

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>9

<211>534

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<221>terminator

<222>(526)..(534)

<400>9

atgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaa60

accgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgac120

gacgacaaggccatggctgatatcggatccatgcatcaccatcaccatcacgacgacgac180

gacaaatcttactctatggaacacttccgttggggtaaaccggttggtaaaaaacgtcgt240

ccggttaaagtttacccgaacggtgctgaagacgaatctgctgaagctttcccgctggaa300

ttcggtggtggttctggaccggagacgctctgcggggctgagctggtggatgctcttcag360

ttcgtgtgtggagacaggggcttttatttcaacaagcccacagggtatggctccagcagt420

cggagggcgcctcagacaggcatcgtggatgagtgctgcttccggagctgtgatctaagg480

aggctggagatgtattgcgcacccctcaagcctgccaagtcagcttaataataa534

<210>9

<211>175

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<221>chain

<222>(63)..(175)

<400>9

methishishishishishisserserglyleuvalproargglyser

151015

glymetlysgluthralaalaalalysphegluargglnhismetasp

202530

serproaspleuglythraspaspaspasplysalametalaaspile

354045

glysermethishishishishishisaspaspaspasplyssertyr

505560

sermetgluhispheargtrpglylysprovalglylyslysargarg

65707580

provallysvaltyrproasnglyalagluaspgluseralagluala

859095

pheproleuglupheglyglyglyserglyprogluthrleucysgly

100105110

alagluleuvalaspalaleuglnphevalcysglyaspargglyphe

115120125

tyrpheasnlysprothrglytyrglyserserserargargalapro

130135140

glnthrglyilevalaspglucyscyspheargsercysaspleuarg

145150155160

argleuglumettyrcysalaproleulysproalalysserala

165170175

<210>9

<211>45

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>9

cgcggatccatgcatcaccatcaccatcacgacgacgacgacaaa45

<210>9

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>9

tagcgtcgacttattattaagctgacttggca32

<210>9

<211>31

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>9

ctggaattcggtggtggttctggaccggaga31

<210>9

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>9

gcgtcgacttattattagaattccagcggg30

<210>9

<211>348

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<221>terminator

<222>(340)..(348)

<400>9

tcttactctatggaacacttccgttggggtaaaccggttggtaaaaaacgtcgtccggtt60

aaagtttacccgaacggtgctgaagacgaatctgctgaagctttcccgctggaattcggt120

ggtggttctggaccggagacgctctgcggggctgagctggtggatgctcttcagttcgtg180

tgtggagacaggggcttttatttcaacaagcccacagggtatggctccagcagtcggagg240

gcgcctcagacaggcatcgtggatgagtgctgcttccggagctgtgatctaaggaggctg300

gagatgtattgcgcacccctcaagcctgccaagtcagcttaataataa348

<210>9

<211>113

<212>prt

<213>artificialsequence

<400>9

sertyrsermetgluhispheargtrpglylysprovalglylyslys

151015

argargprovallysvaltyrproasnglyalagluaspgluserala

202530

glualapheproleuglupheglyglyglyserglyprogluthrleu

354045

cysglyalagluleuvalaspalaleuglnphevalcysglyasparg

505560

glyphetyrpheasnlysprothrglytyrglyserserserargarg

65707580

alaproglnthrglyilevalaspglucyscyspheargsercysasp

859095

leuargargleuglumettyrcysalaproleulysproalalysser

100105110

ala