一种酶促合成山奈酚的方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种酶促合成山奈酚的方法。

背景技术：

山奈酚是一种广泛存在于水果、蔬菜和中草药中的次生代谢产物——黄酮醇类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等多种生物学功能，且安全无毒，在食品和医药领域具有良好的应用前景(张雅雯等.山奈酚生物功能研究进展.生命科学,2017；29(4):400-5)。

目前，山奈酚的常用制备方法是有机溶剂提取法，然而该方法步骤繁琐复杂、周期长、得率低、成本高，需要用到大量的有机溶剂，而且原材料的来源易受到季节的限制，因而不利于工业化生产。获得山奈酚的另外一种方法是化学合成法。该方法不仅合成步骤繁琐复杂、反应条件苛刻、反应催化剂多为有毒物品、产率低，且区域选择性差、易产生大量的副产物，因而增加了分离纯化的难度和生产成本，极大地限制了山奈酚的工业化生产。

近年来，随着对黄酮类化合物生物合成途径的逐步阐明，学者们开始尝试用生物转化法在微生物体内合成黄酮类化合物，并取得了成功。如saileshmalla等(mallas,etal.regiospecificmodificationsofnaringeninforastragalinproductioninescherichiacoli.biotechnologyandbioengineering,2013,110:2525-2535)将拟南芥的黄烷酮3-羟化酶(f3h)基因和黄烷酮合酶(fls)基因以及大豆的类黄酮-3-o-糖基转移酶(ugt78k1)基因转入大肠杆菌bl21，利用大肠杆菌的内源性葡萄糖途径合成的udpg作为糖基供体，将柚皮素进行特异性修饰，最终了合成紫云英苷。然而，采用微生物发酵法生产黄酮类化合物仍然存在很多缺点。首先，合成途径中涉及到的关键酶以及合成过程中产生的中间产物会抑制宿主菌的生长。其次，在菌体生长前期涉及到多个基因的表达，而且基因之间的协同表达缺乏一种理性的调控方式，给宿主菌带来较大的代谢负担。最后，为了提高产量，敲除大肠杆菌体内的某些代谢途径同样会影响菌体的生长。

技术实现要素：

本发明要解决的问题：克服目前山奈酚生产方法的局限性，提供一种酶促合成山奈酚的方法，是一种在生物酶的作用下高效合成山奈酚的新方法。

本发明所采用的技术方案如下：

1.山奈酚生物合成途经中关键酶的克隆、表达和纯化

从拟南芥中克隆黄烷酮3-羟化酶(f3h)基因f3h和黄烷酮合酶(fls)基因fls1至原核表达载体pet-32a，构建重组质粒pet-32a-f3h和pet-32a-fls1，按常规方法诱导表达和纯化融合蛋白。

具体包括：

一种融合蛋白trxa-his-f3h，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：

(1)由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列seqidno.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)seqidno.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

所述的融合蛋白trxa-his-f3h的制备方法，包括以下步骤：

(1)黄烷酮-3-羟化酶(f3h)基因f3h的克隆：f3h基因的pcr扩增，连接到载体pet-32a，构建重组质粒pet-32a-f3h；

(2)将上述重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，iptg诱导表达，利用镍琼脂糖凝胶纯化融合蛋白。

进一步地，步骤(1)中f3h基因的pcr扩增，设计两对引物分别为：

正向引物为斜体碱基示酶切位点bamhi；

反向引物为斜体碱基示酶切位点ecori。

一种融合蛋白trxa-his-fls1，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：

(1)由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列seqidno.2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)seqidno.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

上述融合蛋白trxa-his-fls1的制备方法，包括以下步骤：

(1)黄烷酮合酶(fls)基因fls1的克隆：fls1基因的pcr扩增，连接到载体pet-32a，构建重组质粒pet-32a-fls1；

(2)将上述重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，iptg诱导表达，利用镍琼脂糖凝胶纯化融合蛋白。

进一步地，步骤(1)中fls1基因的pcr扩增，设计两对引物分别为：

正向引物为斜体碱基示酶切位点bamhi；

反向引物为斜体碱基示酶切位点ecori。

2.融合蛋白trxa-his-f3h和trxa-his-fls1的酶活性检测

2.1融合蛋白trxa-his-f3h的黄烷酮3-羟化酶活性检测：参照文献中的反应体系，用聚酰胺薄层色谱法(tlc)和高效液相色谱质谱法(hplc/ms)检测融合蛋白trxa-his-f3h将柚皮素(nrn)转化为二氢山奈酚(dhk)的催化能力。

2.2融合蛋白trxa-his-fls1的黄酮醇合酶活性检测：参照文献中的反应体系，用聚酰胺tlc法和hplc/ms法检测融合蛋白trxa-his-fls1将dhk转化为山奈酚(kmf)的催化能力。

3.一步法合成体系的建立

设计缓冲液体系，反应缓冲液为0.1mtris-hcl(ph7.2)，100μl反应体系中含有0.4％抗坏血酸、10％甘油、8.2mmα-酮戊二酸、0.01mm硫酸亚铁、0.5mm柚皮素、3.3μgtrxa-his-f3h、1.8μgtrxa-his-fls1；

并通过优化反应体系ph值、反应时间和温度，在体外建立一步高效合成山奈酚的方法，上述反应体系在恒温摇床反应40min、温度40℃、转速250rpm。

4.cck-8法检测合成的山奈酚对肿瘤细胞生长的抑制作用。

发明效果

1、本发明开发了一种制备融合蛋白trxa-his-f3h的方法，该方法具有设备简单、易操作、效率高、成本低、周期短等特点，制备的融合蛋白具有黄烷酮3-羟化酶活性，其纯度超过95％。

2、本发明开发了一种制备融合蛋白trxa-his-fls1的方法，该方法具有设备简单、易操作、效率高、成本低、周期短等特点，制备的融合蛋白具有黄烷酮合酶活性，其纯度超过95％。

3、本发明开发了一种在体外高效酶促合成山奈酚的新方法，最终产量为31.94±1.14mg/l，合成的山奈酚对肿瘤细胞mcf-7的生长具有明显的抑制作用，其ic50为63.25μm。

附图说明

图1sds-page电泳分析纯化的融合蛋白。m，蛋白质分子量标准品；1，融合蛋白trxa-his-f3h；2，融合蛋白trxa-his-fls1。

图2分析融合蛋白trxa-his-f3h和trxa-his-fls1的酶活性及一步合成山奈酚的结果图。a，聚酰胺tlc法分析融合蛋白trxa-his-f3h的黄烷酮3-羟化酶活性。1，反应产物。b，聚酰胺tlc法分析融合蛋白trxa-his-fls1的黄酮醇合酶活性。1，反应产物。c，聚酰胺tlc法分析从山奈酚的一步合成。1，反应产物。d，hplc法分析融合蛋白trxa-his-f3h和trxa-his-fls1的酶活性及山奈酚的一步合成。

图3nrn、dhk和kmf的质谱分析结果图。

图4cck-8法测定合成的山奈酚对肿瘤细胞生长抑制的结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式进一步阐述本发明。

实施例

1.山奈酚生物合成途经中关键酶基因的克隆、诱导表达和纯化

1.1黄烷酮-3-羟化酶(f3h)基因f3h的克隆：设计pcr扩增引物，正向引物为斜体碱基示酶切位点bamhi，反向引物为斜体碱基示酶切位点ecori。从拟南芥克隆f3h基因(基因登录号为nm_001203121.1)至原核表达载体pet-32a，构建重组质粒pet-32a-f3h。

1.2黄烷酮合酶(fls)基因fls1的克隆：设计pcr扩增引物，正向引物为斜体碱基示酶切位点bamhi，反向引物为斜体碱基示酶切位点ecori。从拟南芥克隆fls1基因(基因登录号为nm_120951.3)至原核表达载体pet-32a，构建重组质粒pet-32a-fls1。

1.3基因的诱导表达与纯化：将上述重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，iptg诱导表达，得到融合蛋白trxa-his-f3h、trxa-his-fls1，利用镍琼脂糖凝胶纯化融合蛋白,10％sds-page电泳分析蛋白纯度，结果如图1所示，融合蛋白的纯度均为95％以上。上述融合蛋白trxa-his-f3h、具有如下氨基酸序列：

(1)由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列seqidno.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)seqidno.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

上述融合蛋白trxa-his-fls1，具有如下氨基酸序列：

(1)由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列seqidno.2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)seqidno.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

2.融合蛋白的酶活性检测

2.1融合蛋白trxa-his-f3h的酶活性检测

反应缓冲液为100mmtris-hcl(ph7.5)，100μl反应体系中含有0.4％抗坏血酸、10％甘油、0.174mmα-酮戊二酸、0.1mm硫酸亚铁、0.5mm柚皮素和3.3μg融合蛋白trxa-his-f3h。

将上述反应体系在恒温摇床中反应45min，温度30℃，转速250rpm。反应产物经等体积乙酸乙酯萃取2h，收集有机相，挥干后用甲醇溶解，再用聚酰胺薄层色谱法和高效液相色谱质谱法进行分析，检测数据如图2和图3所示，制备的融合蛋白trxa-his-f3h能将柚皮素转化为二氢山奈酚，因而具有黄烷酮3-羟化酶活性。

薄层色谱检测条件：展开剂氯仿与甲醇比例为2:1，加入0.5ml甲酸防止拖尾；显色剂为1％的三氯化铝乙醇溶液。

高效液相色谱质谱联用仪的检测条件：

检测前样品处理：反应组和对照组以及标准品用优级甲醇稀释到1ml离心管中，依次用0.45μm和0.22μm滤器过滤到样品瓶中，进行高效液相分析。

仪器设备:美国安捷伦公司6460液质联用仪(agilent1200-6460qqq)。

(1)色谱条件具体如下：

色谱柱：agilentc18column(150×4.6mm,5μm,thermofisherscientific.inc.,sanjose,ca,usa)。柱温：30℃。

流动相：a(蒸馏水)，b(乙腈)，梯度洗脱：0-10min,a:90％-75％,b:10％-25％；10-35min,75％-50％,b:25％-50％；35-45min,a:50％-15％,b:50％-85％；45-50min,a:15％-90％,b:85％-10％；50-60min,a:90％,b:10％。

进样量：10μl；流速：1ml/min，柱后分流流速：0.2ml/min；

检测器：光电二级阵列管检测器(dad)；

检测波长：λ＝280nm；330nm；370nm。

(2)质谱条件具体如下：电喷雾离子源(esi)，正负离子模式，全扫描(m/z):50-2000，气体流速45arb，辅助吹气流速0arb，电子喷雾电压5.00kv，毛细管温度300.00℃，毛细管电压20.00v，管路偏移电压30.00v。

2.2融合蛋白trxa-his-fls1的酶活性检测

反应缓冲液为0.1mtris-hcl(ph7.2)，100μl反应体系中含有0.4％抗坏血酸、10％甘油、8.2mmα-酮戊二酸、0.01mm硫酸亚铁、0.5mm二氢山奈酚和1.8μg融合蛋白trxa-his-fls1。

将上述反应体系在恒温摇床中反应3h，温度30℃，转速250rpm。反应产物经等体积乙酸乙酯萃取2h，收集有机相，挥干后用甲醇溶解，再用聚酰胺薄层色谱法和高效液相色谱质谱法进行分析，检测数据如图2和图3所示，制备的融合蛋白trxa-his-fls1能将二氢山奈酚转化为山奈酚，因而具有黄酮醇合酶活性。

薄层色谱检测条件：展开剂氯仿、甲醇和乙酸乙酯的比例为4:1.5:1.5，加入0.5ml甲酸防止拖尾；显色剂为1％的三氯化铝乙醇溶液。

高效液相色谱液质联用仪的检测条件：同2.1。

3.山奈酚的一步法合成

反应缓冲液为0.1mtris-hcl(ph7.2)，100μl反应体系中含有0.4％抗坏血酸、10％甘油、8.2mmα-酮戊二酸、0.01mm硫酸亚铁、0.5mm柚皮素、3.3μgtrxa-his-f3h、1.8μgtrxa-his-fls1。

上述反应体系在恒温摇床反应40min、温度40℃、转速250rpm。反应产物经等体积乙酸乙酯萃取2h，收集有机相，挥干后用甲醇溶解，再用聚酰胺薄层色谱法和高效液相色谱质谱法进行分析，检测数据如图2和图3所示。

薄层色谱检测条件：同2.1。

高效液相色谱液质联用仪的检测条件：同2.1。

4.cck-8法检测合成的山奈酚对肿瘤细胞生长的抑制作用。

胰酶消化、计数处于对数生长期的mcf7乳腺癌细胞，制成4×10⁴/ml细胞悬液，接种至96孔细胞培养板，每孔加入100μl细胞悬液(4000个细胞每孔)。设置空白孔(有培养基，无细胞)和对照孔(培养基不加药，有细胞)，每组设定5个复孔。置co2培养箱于37℃、5％co2孵育过夜，每孔加入100μl待检测药物(用培养基系列稀释山奈酚浓度为0、12.5、25、50、100、200mm)，于37℃、5％co2孵育2天。弃去培养基，每孔加入100μl新鲜培养基及10μlcck-8溶液，于37℃、5％co2继续孵育4h。测定各孔450nm的吸光值od450nm，参考波长为630nm。各重复孔的od450nm值取平均数。计算细胞活力％＝(加药细胞od450nm-空白od450nm)/(对照细胞od450nm-空白od450nm)×100％。检测数据如图4所示，体外酶促合成的山奈酚具有抑制肿瘤细胞生长的活性，其ic50为63.25μm。

序列表

<110>扬州大学

<120>一种酶促合成山奈酚的方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>439

<212>prt

<213>人工()

<400>1

metserasplysileilehisleuthraspaspserpheaspthrasp

151015

valleulysalaaspglyalaileleuvalaspphetrpalaglutrp

202530

cysglyprocyslysmetilealaproileleuaspgluilealaasp

354045

glutyrglnglylysleuthrvalalalysleuasnileaspglnasn

505560

proglythralaprolystyrglyileargglyileprothrleuleu

65707580

leuphelysasnglygluvalalaalathrlysvalglyalaleuser

859095

lysglyglnleulysglupheleuaspalaasnleualaglysergly

100105110

serglyhismethishishishishishisserserglyleuvalpro

115120125

argglyserglymetlysgluthralaalaalalysphegluarggln

130135140

hismetaspserproaspleuglythraspaspaspasplysalamet

145150155160

alaaspileglysermetthrargleualaargaspphephealaleu

165170175

proprogluasplysleuargpheaspmetserglyglylyslysgly

180185190

glypheilevalserserhisleuglnglyglualavalglnasptrp

195200205

arggluilevalthrtyrphesertyrprovalargasnargasptyr

210215220

serargtrpproasplysprogluglytrpvallysvalthrgluglu

225230235240

tyrsergluargleumetserleualacyslysleuleugluvalleu

245250255

serglualametglyleuglulysgluserleuthrasnalacysval

260265270

aspmetaspglnlysilevalvalasntyrtyrprolyscysprogln

275280285

proaspleuthrleuglyleulysarghisthraspproglythrile

290295300

thrleuleuleuglnaspglnvalglyglyleuglnalathrargasp

305310315320

asnglylysthrtrpilethrvalglnprovalgluglyalapheval

325330335

valasnleuglyasphisglyhispheleuserasnglyargphelys

340345350

asnalaasphisglnalavalvalasnserasnserserargleuser

355360365

ilealathrpheglnasnproalaproaspalathrvaltyrproleu

370375380

lysvalarggluglyglulysalaileleuglugluproilethrphe

385390395400

alaglumettyrlysarglysmetglyargaspleugluleualaarg

405410415

leulyslysleualalysglugluargasphislysgluvalasplys

420425430

provalaspglnilepheala

435

<210>2

<211>501

<212>prt

<213>人工()

<400>2

metserasplysileilehisleuthraspaspserpheaspthrasp

151015

valleulysalaaspglyalaileleuvalaspphetrpalaglutrp

202530

cysglyprocyslysmetilealaproileleuaspgluilealaasp

354045

glutyrglnglylysleuthrvalalalysleuasnileaspglnasn

505560

proglythralaprolystyrglyileargglyileprothrleuleu

65707580

leuphelysasnglygluvalalaalathrlysvalglyalaleuser

859095

lysglyglnleulysglupheleuaspalaasnleualaglysergly

100105110

serglyhismethishishishishishisserserglyleuvalpro

115120125

argglyserglymetlysgluthralaalaalalysphegluarggln

130135140

hismetaspserproaspleuglythraspaspaspasplysalamet

145150155160

alaaspileglysermetgluvalgluargvalglnaspileserser

165170175

serserleuleuthrglualaileproleuglupheileargserglu

180185190

lysgluglnproalailethrthrpheargglyprothrproalaile

195200205

provalvalaspleuseraspproaspglugluservalargargala

210215220

valvallysalasergluglutrpglyleupheglnvalvalasnhis

225230235240

glyileprothrgluleuileargargleuglnaspvalglyarglys

245250255

phephegluleuproserserglulysgluservalalalysproglu

260265270

aspserlysaspilegluglytyrglythrlysleuglnlysasppro

275280285

gluglylyslysalatrpvalasphisleuphehisargiletrppro

290295300

prosercysvalasntyrargphetrpprolysasnproproglutyr

305310315320

arggluvalasngluglutyralavalhisvallyslysleuserglu

325330335

thrleuleuglyileleuseraspglyleuglyleulysargaspala

340345350

leulysgluglyleuglyglyglumetalaglutyrmetmetlysile

355360365

asntyrtyrproprocysproargproaspleualaleuglyvalpro

370375380

alahisthraspleuserglyilethrleuleuvalproasngluval

385390395400

proglyleuglnvalphelysaspasphistrppheaspalaglutyr

405410415

ileproseralavalilevalhisileglyaspglnileleuargleu

420425430

serasnglyargtyrlysasnvalleuhisargthrthrvalasplys

435440445

glulysthrargmetsertrpprovalpheleugluproproargglu

450455460

lysilevalglyproleuprogluleuthrglyaspaspasnpropro

465470475480

lysphelysprophealaphelysasptyrsertyrarglysleuasn

485490495

lysleuproleuasp

500

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工()

<400>3

aaggatccatgactcgtctcgctcgtga28

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>人工()

<400>4

aagaattcctaagcgaagatttggtcga28

<210>5

<211>28

<212>dna

<213>人工()

<400>5

aaggatccatggaggtcgaaagagtcca28

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>人工()

<400>6

aagaattctcaatccagaggaagtttat28