一种基于水溶性阳离子共轭聚合物材料检测DNA的方法与流程

本发明属于光电材料技术领域，具体涉及一种基于水溶性阳离子共轭聚合物检测dna的方法。

背景技术：

共轭聚合物材料具有良好的荧光效率和水溶性，其光电性质对细微的外部环境变化十分敏感，是一种良好的化学与生物传感材料。共轭聚合物是指在空闻结构上有长程π键共轭体系的聚合物，在聚合物共轭体系中，长程π电子共轭不仅大大缩小了成键和反键能带间的能隙(一般为1.5～3ev)，而且使两个能带增宽，能带内的轨道数增加，轨道间能隙减小，载流子(电子和空穴)在能带内可以自由移动，因此，共轭聚合物的共轭骨架允许电子或能量在整条链上自由流动，从而具有“分子导线”功能。即受激发产生的激子可以沿共轭主链迅速迁移。由于共轭聚合物的主链一般具有刚性的平面结构,因此很难熔融和溶解。通过聚合物侧链的修饰,可以改变聚合物的溶解性、熔解能力,而且通过在聚合物的侧链共价连接上亲水基团,如季铵盐、羧基盐、磺酸基、冠醚链以及多羟基化合物等亲水基团还可得到水溶性共轭聚合物。侧链所带有的电荷使得共轭聚合物可以与带相反电荷的生物分子如蛋白质、核酸等发生相互作用。

共轭聚合物所实现的信号放大作用是以检测共聚物荧光为基础的传感器的最重要的特点。相对于小分子而言,由于ccp具有信号放大作用,灵敏度要高得多。在fret机制中,聚合物作为能量给体,标记用的荧光发色团作为能量受体。较高的消光系数和离域的主干使得ccp成为很好的能量给体从而放大了受体的荧光信号,使得基于fret的荧光传感器有很高的灵敏度、较好的选择性以及极小的背景干扰。简单、有效、高灵敏度的dna检测方法对于医药生物学至关重要。另外水溶性共轭聚合物荧光材料，具有结构多样性、良好的生物相容性、荧光强度高、发光时间长和光化学稳定性好等特性，同现有的无机纳米材料相比，水溶性聚合物材料的制备方法简单，具有光学特性可调控、低毒、生物兼容性佳等优点，因此在材料选择方面，水溶性聚合物材料有非常大的优势。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种操作简单、特异性高、所需设备简单的检测dna的方法。与传统的基于荧光效应的检测方法相比，这种检测方法不仅利用了共轭聚合物的分子导线效应，也利用了目标dna循环反应的信号放大机制，结合荧光共振能量转移(fret)，可以克服传统荧光生物传感器中荧光强度低、选择性差的缺点，具有高灵敏度、快速响应和强抗干扰能力。

本发明提出的检测dna的方法，是以水溶性阳离子共轭聚合物为荧光共振能量转移(fret)的供体，修饰染料作为荧光共振能量转移的受体，通过静电作用使阳离子共轭聚合物与染料修饰的带负电的dna聚合体靠近，发生荧光共振能量转移，结合目标dna循环反应的信号放大机制实现对目标dna的高灵敏检测。

本发明的具体步骤如下：

(1)制备水溶性阳离子共轭聚合物材料(ccp)，并且溶于超纯水中。

(2)dna链h1和染料修饰的h2在配好的buffer中进行培育、杂交。

(3)然后加入目标dna进行培育、杂交。

(4)exonucleaseiii降解与目标杂交的双链探针上的h2。

(5)加入水溶性阳离子共轭聚合物水溶液，以404nm波长激发，进行荧光检测，根据荧光共振能量转移对目标dna进行定性检测。

进一步，所述共轭聚合物是一种具有良好溶解性的光敏感材料，带正电荷的线性分子，其吸收波长为404nm，发射波长为450nm。

进一步，步骤2中所述的两条dna单链h1、h2的核酸序列为：

h1:5’-ctcttcgagggttttgggttttgggttttgggagcta-3’

h2:5’-aaaacccaaaacccaaaacccgcgacgagtcacaacag-3’5’-fam。

进一步，步骤2中,所述dna链用染料fam修饰，其吸收波长为490nm，发射波长为520nm，fam的吸收光谱490nm与聚合物的发射光谱450nm存在很好的光谱重叠，能够满足荧光共振能量转移的光谱重叠条件。

进一步，步骤2中所用缓冲溶液为10mmtris–hcl,75mmkcl,10mmmgcl2,ph8.0。

进一步，步骤3中所述目标dna的序列为5’-ctgttgtgactcgtcgcaataac-3’，当目标dna出现时，就会和双链探针dna链上的h2未形成杂交的部分进行杂交，使双链dna形成3’端平末端。

进一步，步骤4中，所述exonucleaseiii是一种双链特异性的核酸外切酶，能降解平滑末端、3′凹陷末端及有切口的dna，但不能降解3′-突出末端，exonucleaseiii只能切掉与目标dna杂交的dna探针链，并且释放出的目标dna进行循环实现信号的放大。

进一步，步骤5中所用荧光检测方法是将水溶性阳离子共轭聚合物材料溶液加入到培育好的dna聚合体溶液进行荧光发射光谱的扫描，激发波长为404nm，发射波长范围为410nm-650nm。

本发明具有有益技术效果具体如下：

(1)选用可激发荧光的水溶性阳离子共轭聚合物作为敏感材料。水溶性阳离子共轭聚合物在检测中作为荧光共振能量转移的供体，其强荧光性质可实现信号的放大。带正电的共轭聚合物与带负电的dna之间的静电作用有利于荧光共振能量转移。

(2)当加入目标dna时，目标dna和双链探针dna链上的h2未形成杂交的部分进行杂交，使双链dna形成3’端平末端。exonucleaseiii就会从平末端的3’端降解其中一条dna链，释放出的目标dna链进行循环反应，实现信号的放大。

(3)选择荧光物质fam进行修饰发夹dna是因为，fam的吸收光谱在490nm处，发射光谱在520nm，而共轭聚合物的吸收光谱在404nm，发射光谱在450nm，因此fam的吸收光谱(490nm)与共轭聚合物的发射光谱(450nm)具有很大程度的光谱重叠，满足荧光共振能量转移的光谱重叠条件。

(4)发明制备方法简单，不需要复杂的设备，对目标dna有很高的特异性和灵敏度。本发明可广泛应用于分子生物学、临床检测、生物传感器等领域，实现对生物分子、小分子的检测。

附图说明

图1为共轭聚合物和荧光素的化学结构示意图。

图2为检测原理图。

图3为荧光强度随着探针浓度的变化图。

图4为论证检测体系对目标dna的特异性示意图。

具体实施方式

现结合附图对本发明做进一步详细的说明。

本发明的工作原理是当目标dna加入到h1和染料修饰的h2形成的探针溶液中时，目标dna和探针上的h2链杂交，然后利用exonucleaseiii降解h2，释放出目标dna和h1，目标dna进行循环反应，最后加入水溶性阳离子共轭聚合物材料(ccp)，通过静电作用，ccp与溶液中游离的探针结合在一起，发生荧光共振能量转移，利用ccp的强荧光性质和目标循环的信号放大机制实现双重信号放大，检测原理图如图2所示。

结合图1，具体介绍基于水溶性阳离子共轭聚合物检测dna的制备方法。

以水溶性阳离子共轭聚合物作为荧光共振能量转移的供体，荧光材料fam作为荧光共振能量转移的受体，同时结合目标dna循环反应的信号放大机制完成对目标dna的高灵敏检测，其流程如下：

1.制备水溶性阳离子共轭聚合物材料，并用超纯水溶解到浓度为2×10^-6mol/l，避光待用。

2.将浓度为100um的h1和h2稀释至浓度为0.125um，分别取7.2ulh1和h2(0.125um)于155.9ul缓冲溶液中混合，总共配成相同的溶液7份，然后放入37℃恒温箱培育1h。

3.向7份样品中分别加入不同浓度的目标dna溶液，使目标dna的最终浓度分别为0nm,0.1nm,1nm,5nm,10nm,20nm,30nm,混合均匀后37℃培育1h。

4.向上述培育好的溶液分别加入2.5ulexonucleaseiii(8u/ul),在37℃培育30min。

5.向7份培育好的样品分别加入相同浓度的水溶性阳离子共轭聚合物溶液(2×10^-6m)，混合均匀后立即测荧光光谱。

实施例1：检测不同浓度的目标dna

1：分别取h1，h2(1.25×10^-7m)7.2ul与155.9ul缓冲溶液，混合均匀，需要得到7份相同的混合溶液，在37℃培育1h。

2：向每份样品中加入7.2ul不同浓度的目标dna(0nm，2.5×10^-9m，2.5×10^-8m，1.25×10^-7m，2.5×10^-7m，5×10^-7m，7.5×10^-7m)，混合均匀后37℃培育1h。

然后：向培育好的每份样品加入2.5ulexonucleaseiii(8u/ul)，混合均匀后37℃培育30min，降解和目标dna杂交后的探针dna链h2。

3：向每份样品加入20ul水溶性阳离子聚合物ccp(2×10^-6m)，使最终体积为200ul，混合后立刻在404nm处进行激发测试荧光。

从图3中可以看出随着目标dna浓度的增加，440nm处的荧光逐渐增强。

实施例2：特异性分析

检测1：将7.2ul浓度为7.5×10^-7m的targetdna加入到最终体积为200ul的检测底液中，其它实验条件同实施例1。

同时，做如下实验作为对比。

检测2：用等体积等浓度的单碱基错对dna、三碱基错对dna和完全错配dna进行实验，作为阴性对照，其它实验条件同实施例1。

检测3：用等体积的空白缓冲溶液代替targetdna进行试验，作为空白对照，其它实验条件同实施例1。

结果如图4所示，加入targetdna的检测体系的共轭聚合物的荧光恢复程度显著高于其他4种对照体系，表明该方法对targetdna的检测具有较高的特异性。