基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂的制作方法

本发明是《基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因突变的检测试剂、pcr检测方法及应用》(专利申请号2015103553148，申请日20150624)的分案申请。

本发明属于分子生物学生物核酸检测技术领域，具体涉及一种基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因突变的检测试剂、pcr检测方法及应用。

背景技术：

wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。wnt信号通路包括经典的wnt信号通路与非经典的wnt信号通路，在经典通路即wnt-β-catenin信号通路中，wnt因子通过激活细胞膜上的frizzle/lrp5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能够联合pygo2、bcl-9以及foxm1蛋白共同与tcf/lef-1转录因子家族形成复合体并激活wnt信号通路下游靶基因的转录激活。

pygo2蛋白是wnt信号通路中β-catenin下游重要成员之一，目前越来越多的研究已经发现，在很多肿瘤中pygo2蛋白均呈现高表达。

目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，虽然近年来wnt信号通路在癌症中的研究，以及pygo2蛋白作为wnt信号通路重要成员其表达水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的重要问题，但是同时其在很多肿瘤细胞中基因的突变也越来越多，尤其是在pygo2蛋白nhd端及phd端发生的突变，对pygo2蛋白发挥功能启动非常重要的作用，例如在膀胱癌细胞中检测出nhd端r46s突变，胰腺癌细胞中检测出p98h突变，肺腺癌细胞中检测出的phd端r334q突变以及急性骨髓性白血病中检测出的r356p突变。

肽核酸(peptidenucleicacids，pna)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的dna类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的dna类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了dna中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与dna相同，pna可以通过watson-crick碱基配对的形式识别并结合dna或rna序列，形成稳定的双螺旋结构。由于pna不带负电荷，与dna和rna之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于dna或dna、rna间的杂交，pna与dna或rna的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与dna或rna分子的杂交能力远优于dna/dna或dna/rna，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种能确定wnt信号通路中核心的信号分子pygo2基因突变情况，能解释核心分子pygo2在肿瘤细胞中变化，结果重复性，敏感性好的基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因r356p突变的检测试剂。

本发明目的的实现方式为，基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因r356p突变的检测试剂,包括引物和探针，所述引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针，其特征在于：

所述检测pygo2基因r356p突变正向引物如序列表中seqidno.7；

所述检测pygo2基因r356p突变反向引物如序列表中seqidno.8；

所述检测pygo2基因r356p突变pna荧光探针如序列表中seqidno.12；

所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为：fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。

基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因突变的检测试剂进行检测的方法，检测方法为基于肽核酸为荧光探针的实时荧光定量pcr方法；

所述实时荧光定量pcr的反应体系为：正向引物、反向引物、depc水、具有5'→3'外切活性的dna聚合酶、dntps、10×pcrbuffer、rnasin、m-mlv逆转录酶、oligo(dt)和含mg离子的溶液；

所述具有5'→3'外切活性的dna聚合酶为taq酶。

基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因突变的检测试剂的应用，用于制备检测肿瘤细胞及正常细胞的检测试剂，所述癌细胞为膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、肺腺癌细胞或急性骨髓性白血病血细胞。

本发明采用特异序列的pna寡聚物作为探针。由于pna是一种人工合成的核酸的类似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势，大大提高了检测灵敏度。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:pygo2基因是新发现的wnt信号通路中β-catenin蛋白下游的发挥着重要功能的基因，借助本发明提供的检测试剂能够通过实时荧光定量pcr法在转录水平快速检测出pygo2基因的突变，而与普通实时荧光定量pcr不同的是，本申请人使用的肽核酸pna荧光探针更加灵敏，本发明为抗癌药物的筛选，新靶向药物的机制研究都提供了非常有力的工具。

附图说明

图1是本发明实施例中所述肽核酸质谱图；

图2是本发明实施例中所述r46s突变型和野生型参考品pcr扩增图；

图3是本发明实施例中所述p98h突变型和野生型参考品pcr扩增图；

图4是本发明实施例中所述r334q突变型和野生型参考品pcr扩增图；

图5是本发明实施例中所述r356p突变型和野生型参考品pcr扩增图。

具体实施方式

基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因突变的检测试剂，所述引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针，其特征在于：

所述检测pygo2基因r356p突变正向引物如序列表中seqidno.7；

所述检测pygo2基因r356p突变反向引物如序列表中seqidno.8；

所述检测pygo2基因r356p突变pna荧光探针如序列表中seqidno.12。

所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为：fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。

检测试剂还含有对比试剂，对比试剂为与pygo2基因野生型互补的肽核酸序列，

所述特异性结合包含pygo2基因356密码子野生型pna序列如序列表中seqidno.16。

本发明所用肽核酸的质谱图见图1。

用基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因突变的检测试剂进行检测的方法，检测方法为pcr检测方法，所述pcr检测方法为基于肽核酸为荧光探针的实时荧光定量pcr方法；

所述实时荧光定量pcr的反应体系为：正向引物、反向引物、depc水、具有5'→3'外切活性的dna聚合酶、dntps、10×pcrbuffer、rnasin、m-mlv逆转录酶、oligo(dt)和含mg离子的溶液；

所述具有5'→3'外切活性的dna聚合酶为taq酶。

基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因突变的检测方法，检测的步骤如下：

1)针对pygo2基因46、98、334、356密码子突变型设计检测这些位点的引物及pna探针；

2)针对pygo2基因46、98、334、356密码子序列设计与这些位点野生型互补的4段pna序列；

3)构建含有pygo2基因突变型和野生型的质粒，并计算拷贝数，制成参考品；

4)提取待测细胞中mrna；

5)用上述检测pygo2基因突变试剂对参考品和样本进行荧光定量pcr检测，并判断pygo2基因46、98、334、356密码子是否发生突变。

所述pcr反应液中所述taq酶的终浓度为0.01u/μl～0.05u/μl，所述dntps的终浓度为0.2～0.6mm，所述10×pcrbuffer的终浓度为1×，所述rnasin的终浓度为40u/μl～60u/μl，所述m-mlv逆转录酶的终浓度为200u/μl～320u/μl，所述mgcl2的终浓度为1.5～5.0mm，溶剂为depc水，所述正向引物的终浓度为0.05～0.9μm，所述反向引物的终浓度为0.05～0.9μm，所述荧光探针的终浓度为0.05～0.9μm。

所述实时荧光定量pcr的反应程序为：42℃逆转录20min；94℃预变性，2min；95℃变性，30s；58℃，45s；进行40个循环。

本发明的实验体系可以在任何一台实时荧光定量pcr仪器上进行，其pcr反应仪器为appliedbiosystems公司7500型荧光定量pcr仪。上述引物置于八联管中，进行实时荧光定量pcr检测，实验操作简单，费用低廉，结果重复性，敏感性好，是研究肿瘤相关药物作用机理及基础科学研究的一种重要手段。

基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因突变的检测试剂用于制备检测肿瘤细胞及正常细胞的检测试剂，所述癌细胞为膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、肺腺癌细胞或急性骨髓性白血病血细胞。

本发明通过胰腺癌细胞进行举例说明。

本发明中pnac-1(人胰腺癌pnac-1细胞系)细胞系购自美国atcc，培养细胞所使用的rpmi-1640培养基及10％胎牛血清均购自英俊公司，其他试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。

利用本发明所述试剂检测细胞内wnt信号通路pygo2基因突变包括以下具体步骤：

一、引物探针设计

根据美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)报道的hpygo2mrna序列(ncbireferencesequence:nm_138300.3)，使用appliedbiosystems公司开发的primerexpresssoftwareforreal-timepcr软件设计特异的pygo2引物与探针。

pygo2r356p:

pygo2-f:5'-ccattctgtgtgaggcctcc-3'；

pygo2-r:5'-cacggatgtagacagactggatct-3'；

pygo2(pna)-p:5'fam-caccctgagtgcacaggca-bhq3'；

pygo2-pna：caccgtgagtgcacaggca

靶序列：

ggatgccattctgtgtgaggcctcctgccagaaatggttccaccgtgagtgcacaggcatgactgagagcgcctatgggctgctgaccactgaagcttctgccgtctgggcctgcgatctctgcctcaagaccaaggagatccagtctgtctacatccgtgagggcatgggg

以上：f：forward，正向；hw-f表示用于检测钩虫核酸的正向引物。

r：reverse，反向；hw-r表示用于检测钩虫核酸的反向引物。

p：probe，荧光探针；hw-p表示用于检测钩虫核酸的荧光探针，该荧光探针为taqman荧光探针。

在本发明实施例中，修饰荧光探针的5'端的荧光报告基团可以为：fam，hex，tet，joe，vic，rox，cy3或cy5；修饰荧光探针的3'端的淬灭基团可以为：tamra，eclipse，bhq1，bhq2，bhq3或dabcyl，该荧光报告基团与淬灭基团不影响荧光定量pcr的扩增，只需根据探针的荧光报告基团和淬灭基团选择所用的仪器的型号设置可检测的荧光信号范围。本发明实施例提供的荧光探针荧光报告基团：fam、hex、tet和fam的激发波长为470-650nm，接收波长为500-700nm；淬灭基团：eclipse、tamra、bhq1。引物合成后的纯化方式可以为：hap、page和hplc纯化方式。

二、人胰腺癌pnac-1细胞系培养与传代

1)细胞培养

所有细胞系使用rpmi-1640培养基(invitrogen,carlsbad,ca)，10％胎牛血清(invitrogen,carlsbad,ca)，于37℃、5％co2环境下培养。

2)细胞传代

首先使用灭菌吸管将细胞培养皿中的培养液吸出，加入pbs缓冲液清洗2遍，往细胞中慢慢滴加适量胰蛋白酶，待细胞变圆，调整角度细胞能够移动后加入3ml的含10％胎牛血清的dmem培养基，反复轻轻吹打后，显微镜下观察细胞形态并计数，根据培养皿中细胞的含量将适量的细胞传代至其他灭菌的培养皿中，加入5ml的dmem培养基后放入5％co2培养箱。

细胞计数公式(个/ml)：(4大格细胞总数)×10⁴×稀释倍数/4

三、总rna的提取

1)倒掉培养基，pbs清洗后，直接将1mltrizol注入培养瓶(其中细胞5×10⁶个/ml)，反复抽吸均匀；

2)在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为trizol总体积的1/5)，振荡混均30秒，室温下静置5分钟；

3)12000rpm4℃离心15分钟，分相为三层。上层：rna(约为trizol的60％)；中间：dna；下层:蛋白质(酚-氯仿)；

4)小心吸取上清液，转移到另一ep管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.4～0.6ml。有机相和中间层含有dna和蛋白质,避免触及；

5)上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡混均30秒。室温下静置10分钟；

6)12000rpm4℃离心10分钟；

7)rna沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注意避免吸弃rna沉淀；

8)离心管加入1ml预冷的75％乙醇(1mltrizol至少1ml乙醇清洗dna),振荡混均30秒，使沉淀振荡起来，室温12000rpm离心1～2分钟。尽可能吸弃上清液,防止rna沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。在75％乙醇中，rna在4℃至少保存1周，－20℃至少保存1年；

9)室温选择流动性小，倒置离心管于滤纸上，干燥rna，但不能完全干燥(5～10分钟)。用depc水15μl溶解沉淀，55-60℃孵育10～15分钟。

10)rna纯度检测

滴加2μlrna溶液于超微量分光光度计(型号：p330-311)，并读取仪器中od260/od280比值。

四、构建重组质粒

1)将含有pygo2基因突变型和野生型的dna片段进行pcr扩增；

2)将pcr产物进行双酶切；

载体和pcr产物分别用一下条件进行双酶切(反应体系均为30ul，37℃，酶切2小时)；

3)将双酶切产物电泳后割胶回收(按照试剂盒说明书进行操作)；

4)将酶切产物与质粒载体进行连接；

上述双酶切产物经过纯化(其中载体酶切产物割胶回收，pcr片段酶切后纯化步骤与上述pcr产物纯化步骤相同)，在t4dna连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下：载体，2ul；pcr片段，6ul；10xt4buffer，1ul；t4dnaligase，1ul。

5)转化大肠杆菌感受态；

取上述连接液5μl转化到预先制备的dh5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mllb培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min(不要离心太久，以免太实)，最后均匀涂布在含有100ng/ml抗生素的lb平板上(100-150ul)。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100ng/ml抗生素的lb平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。

6)qiagen试剂盒抽提质粒(按照说明书进行)，制成参考品。

五、实时荧光定量pcr

取提取的总rna1-5μg，加入pcr反应液，pcr反应液包括：无菌水、具有5'→3'外切活性的dna聚合酶、dntps、10×pcrbuffer、rnasin、m-mlv逆转录酶、oligo(dt)和含mg离子的溶液。其中，浓度为5u/μl的具有5'→3'外切活性的dna聚合酶0.3μl，浓度为10mmol/l的dntps2μl，10×pcrbuffer5μl，浓度为40u/μl的rnasin0.6μl，浓度为200u/μl的m-mlv逆转录酶0.6μl，浓度为25mmol/l的mgcl2溶液5μl，添加无菌水至体积为50μl。其中，具有5'→3'外切活性的dna聚合酶可以为taq酶。

pcr扩增：将各反应管放入荧光定量pcr仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，选择要用的taqman荧光探针(本产品荧光报告基团为fam、hex、tat，荧光淬灭基团为eclipse)，定义样品孔，并按下表提供的扩增程序进行pcr扩增：

表1为pcr扩增反应扩增程序

在扩增程序的第三步的终了读取荧光值。

所述r356p突变型和野生型参考品pcr扩增图见图5，图中上、中、下三条线各表示pygo2基因第356位密码子突变型参考品、样本以及野生型参考品的扩增曲线。从图说明胰腺癌pnac-1细胞系中第98位密码子为突变型，而第46、334、356位密码子均为野生型。

六、数据分析判断：

同时选定所检样本与该样本检测位点对应的突变型和野生型参考品孔，对比三孔pcr扩增曲线(cta表示样本孔ct值，ctw表示野生型ct值，ctm表示突变型ct值)：

当ctw＜cta≤ctm时，表明该样本存在突变；

当ctw＝cta时，表明该样本为野生型。

序列表

<110>湖北工业大学

<120>基于肽核酸探针的wnt信号通路中pygo2基因r356p突变的检测试剂

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccattctgtgtgaggcctcc20

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cacggatgtagacagactggatct24

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caccctgagtgcacaggca19

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caccgtgagtgcacaggca19