一株细菌纤维素生产菌株及其构建方法与应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株细菌纤维素生产菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

细菌纤维素(bactericalcellulose，bc)是指在不同的条件下，由醋酸菌属(acetobacter)、土壤杆菌属(agrobacterium)、根瘤菌属(rhizobium)和八叠球菌属(sarcina)等中的某种微生物合成的纤维素的统称。细菌纤维素与植物纤维素相比，没有木质素和半纤维素杂质，因而在工业应用前，不需要进行繁杂的预处理，提取过程简单；除此之外，细菌纤维素具有精细的网络结构、较高的机械强度、较高的吸水和保水性能、合成是可调控性、良好的生物相容性和生物可降解性等许多独特的性质，因此被认为是性能最好、使用价值最高的纤维素，但是，在目前的生产过程中，木醋杆菌的生产速度慢、产量低限制了它的广泛应用，因此，提高细菌纤维素的产量和产率非常有必要。

木醋杆菌是最早被发现的，也是研究最透彻的纤维素产生菌株，是目前已知的合成纤维素能力最强的菌株。目前，国内产细菌纤维素的菌株的选育主要是从天然环境中分离纤维素产生菌，然后通过传统的驯化方法选育出优良菌株；国外除了采用传统的驯化选育外，还采用了基因工程方法，改良获得了优良菌株。

技术实现要素：

本发明需要解决的技术问题是，提供一株细菌纤维素生产菌株，以解决现有技术中细菌纤维素生产菌株产量低、发酵时间长的问题。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述细菌纤维素生产菌株的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述细菌纤维素生产菌株的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株细菌纤维素生产菌株，在木醋杆菌中过表达纤维素合酶中的bcsb亚基，其中bcsb亚基主要参与细菌纤维素的合成。

作为优选，所述木醋杆菌为木醋杆菌atcc700178。

作为优选，所述纤维素合酶中的bcsb亚基，其基因序列如seqidno:1所示。

上述细菌纤维素生产菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)将纤维素合酶中的bcsb亚基的基因序列克隆到表达质粒中，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)中重组质粒转化木醋杆菌，既得到木醋杆菌基因重组菌。

步骤(1)中，所述表达质粒为psa-19。

步骤(2)中，所述木醋杆菌木醋杆菌atcc700178。

上述细菌纤维素生产菌株在发酵产细菌纤维素中的应用在本发明的保护范围之内。

有益效果：

本发明通过将与细菌纤维素合成相关的纤维素合酶亚基在木醋杆菌中进行过表达以此提高该菌株细菌纤维素的产量，得到的菌株的细菌纤维素产量最高可达5g/l，与原始菌株相比终产量提高了20％以上，同时将发酵时间缩短为原始菌株的一半。

附图说明

图1菌落pcr验证电泳图。

图2出发菌与重组菌发酵得到细菌纤维素的干重与产率对比图，0为出发菌，700178-b为本发明构建的重组菌。

图3出发菌与重组菌糖消耗速度对比图，0为出发菌，700178-b为本发明构建的重组菌。

图4出发菌与重组菌发酵随时间增长得到纤维素干重的对比图，0为出发菌，700178-b为本发明构建的重组菌。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：木醋杆菌纤维素合酶亚基bcsb基因的克隆

首先对于木醋杆菌的纤维素合酶中与细菌纤维素分泌相关的亚基(bcsb)进行扩增及序列测定，经过扩增得到470bp的dna片段。具体过程如下：

首先，提取木醋杆菌atcc700178的基因组，设计引物对bcsb-fa、bcsb-rc，以提取的木醋杆菌atcc700178的基因组为模板进行pcr扩增。pcr反应体系为5×primestarbuffer(mg²⁺)20.0μl、dntpmixture(2mm)10.0μl、bcsb-fa1.0μl、bcsb-rc1.0μl、primestar1.0μl、模板0.5μl；用无菌水补充至100.0μl，然后将其分装成25.0μl/管。反应条件：95℃5min；95℃10sec；60℃30sec；72℃3minc；72℃10min；35个循环，扩增得到的pcr产物通过凝胶回收试剂盒纯化。

上述所需引物如下：

bcsb-fa：tatgaccatgattacgaattcgatatgaaaatggtgtccctgatcgcg；

bcsb-rc：cttgcatgcctgcaggtcgacgatcacgttctctgcctttcttcctgc。

实施例2：重组质粒psa19-bcsb的构建及验证。

根据ncbi上木醋杆菌内源性质粒序列合成质粒片段pah4，将质粒pah4和质粒puc18用hindiii单酶切后重组，得到带氨苄抗性的重组质粒psa19。用ecori和sali双酶切psa19质粒，凝胶回收。通过一步克隆将上述胶回收得到的目的片段连到psa19质粒上，从而构建了以氨苄抗性为选择标记的载体psa19-bcsb。然后对于psa19-bcsb载体进行验证，进行双酶切验证，验证结果与预期相符，将双酶切结果与预期相符的质粒送测序，与预期相符，证明该载体构建成功。

实施例3：psa19-bcsb载体转木醋杆菌700178转化子的构建及分子验证。

将1μg的psa19-bcsb载体转化木醋杆菌atcc700178，转化过程采用电转化法。在含有氨苄抗性的选择培养基上对转化子进行筛选，最终得到一株遗传稳定的木醋杆菌bcsb转化子。经pcr验证，证明上述转化子成功插入psa19-bcsb质粒。

上述的电转化的具体方法如下：

感受态的制备：

1、从平板上刮一环木醋杆菌种子于装有100ml种子液的500ml锥形瓶中，同时加入过膜除菌的纤维素酶使得每毫升培养基中的纤维素酶量为0.5u，30℃，150rpm，培养18h，使得菌液的od值在0.6-0.8之间。

2、将培养得到的菌液5000rpm，离心5min，弃上清收集菌体，再用5ml的epb溶液(284mmol的蔗糖溶液和100mmol，ph7.4的磷酸盐缓冲液分别灭菌后以1:19比例混合得到)洗涤两次。最后加3.3ml的epb溶液重悬，分装，每管560μl。

木醋杆菌的转化：

将得到的质粒psa19-bcsb取20μl(浓度约为30ng/μl)加入上述分装的感受态中，于冰上放置10min后，转入2mm电转杯中，加入电转仪中电转，电转条件为电压3000v，电阻200ω，电容25μf。

复苏、涂板：在电转化后的菌中加入1ml的含有纤维素酶的种子液，再在30℃，150rpm，复苏3h。复苏完成后，取100μl上述菌液涂布于含有75μg/ml的氨苄抗性的琼脂培养基，30℃，培养3-4天，挑选在琼脂培养基上长出的转化子。同时对于没有加入目的质粒的感受态按照同样的方法进行，按照相同的量涂布于相同的琼脂培养基上作为感受态生长情况检测及阴性对照。

上述的琼脂培养基(即选择培养基)：葡萄糖20g/l,酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l,琼脂20g/l，氨苄抗生素75μg/ml。

将选择平板上长出的转化子进一步挑取到转化基本培养基平板上进行复筛，将复筛培养基上挑选得到的转化子进行菌落pcr验证，验证的引物对为yz-b-1，yz-b-2；

yz-b-1:gagttagctcactcattaggcaccc

yz-b-2:gatcacgttctctgcctttcttcctgc

pcr结果的凝胶电泳图如图1所示。

实施例4：将重组菌木醋杆菌atcc700178-bcsb进行发酵验证。

将木醋杆菌转化子和出发菌株分别活化，接种到种子培养基中，30℃，150rpm(摇床)培养18-20h后，接种于100ml(500ml的三角瓶)发酵培养基中，同时在发酵培养基中加入1ml无水乙醇。接种的同时，取样测定初始糖浓度。于30℃静置培养6d后，用蒸馏水过夜冲洗纤维素膜以除去膜表面的培养基及杂质，再将纤维素膜浸泡在0.5m的氢氧化钠溶液中煮沸1h至乳白色半透明以除去附着的菌体，将处理后的纤维素膜在滤纸上沥干，将沥干的纤维素膜在烘箱中于65℃烘至恒重，称重(即纤维素干重)，如图2所示。

实施例5：

将得到的重组菌株700178-bcsb接发酵观察该菌株与原始菌株的产量与残糖随时间的变化，如图3所示；重组菌株700178-b在前期0-9d时的糖耗下降迅速，对应细菌纤维素的产量也大幅上升，而在9d之后，糖浓度下降缓慢，最终趋于稳定，对应细菌纤维素的产量基本不变；从产量图4可以看出，在发酵最终，700178-acsb的产量比原始菌株提高了47.8％，700178-acsb在发酵9d达到最大产量，而原始菌株在发酵14d左右达到最大产量，故发酵周期缩短了5d。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一株细菌纤维素生产菌株及其构建方法与应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2414

<212>dna

<213>木醋杆菌atcc700178(bacillusxylinusatcc700178)

<400>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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